El documento proporciona información sobre la preparación y esterilización de material de laboratorio de microbiología. Explica que un laboratorio de microbiología debe ser un lugar limpio donde se puedan manipular microorganismos de forma segura. Describe los cuatro grupos de riesgo de agentes infecciosos y especifica que en un laboratorio de prácticas siempre se deben usar microorganismos del grupo 1, que no suelen causar enfermedades. Además, presenta normas generales para el uso del laboratorio y detalla los procedimientos para preparar y

1. Introducción
Un laboratorio de microbiología debe ser un lugar convenientemente habilitado
donde se puedan manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe
ser realizado con una buena técnica aséptica y por tanto se requiere un ambiente
limpio y ordenado. Por tal razón, se requiere trabajar en condiciones de esterilidad.
Estas condiciones se encuentran en una cámara de seguridad biológica o bien, en
la proximidad de un mechero de alcohol o de gas. Según la capacidad de causar
infecciones en humanos, los microorganismos se clasifican en cuatro grupos de
riesgo:
Tabla 1. Clasificación de los agentes infecciosos según su riesgo biológico
Grupo Riesgo de Profilaxis o
de Riesgo infeccioso propagación a la tratamiento eficaz
riesgo colectividad
1 Poco probable que causen No Innecesario
enfermedad
2 Pueden causar una Poco probable Generalmente
enfermedad y constituir un posible
peligro para los
manipuladores
3 Pueden provocar una Probable Generalmente
enfermedad grave y posible
constituir un serio peligro
para los manipuladores
4 Provocan una enfermedad Probable No conocido en la
grave y constituyen un serio actualidad
peligro para los
manipuladores
Los agentes biológicos del grupo 1 son los que habitualmente no se asocian con
enfermedades en humanos. En un laboratorio de prácticas de microbiología
siempre se deberá trabajar con microorganismos del grupo 1.
1

2. Normas generales de uso del laboratorio
Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas
elementales que deben ser observadas con toda responsabilidad:
1. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente el manual para
adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica (los resultados
deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se obtengan).
2. Trabajar con calma y concentración.
3. Uso de bata en el laboratorio.
4. Lavarse las manos con agua y jabón al iniciar y finalizar el trabajo.
5. El orden y la limpieza son esenciales en todas las prácticas de laboratorio.
Antes de comenzar se deberá desinfectar la superficie de trabajo.
6. Está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos u
oídos.
7. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores
manuales o pipetas automáticas.
8. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama del
mechero o en campana de seguridad biológica.
9. El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contienen
cultivos representan un riesgo evidente. Colocar las placas y otros
recipientes de forma segura para evitar que se caigan.
10. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
11. Los desechos contaminados deberán ser esterilizados en el
laboratorio antes de ser procesados como residuos. Todos los
materiales de desecho que hayan entrado en contacto con
microorganismos (como pipetas usadas, cajas petri o tubos), deben
colocarse en bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder
posteriormente a su esterilización.
12. Accidentespersonales, tales como derrame de reactivos, cortes y
quemaduras, deben comunicarse inmediatamente al Instructor.
13. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse
alejados de las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas
se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la
llama.
14. Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y se debe estar
seguro que se les ha apagado al final de cada práctica.
2

3. 15. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y
microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar
sus mecanismos.
16. Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su
identificación respectiva, ej.: número de mesa, nombre, naturaleza del
espécimen o sustrato del cual se aísla.
17. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de
microorganismos, nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más
horizontalmente posible (inclinados) y para quitar el tapón se mantendrán
inclinados con una mano y se abrirán con la otra, que sostendrá a su vez el
asa. Una vez abierto, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo
dicha operación una vez realizada la siembra (el tapón nunca debe dejarse
sobre la mesa).
18. Las pipetas se tomarán de forma que sea el dedo índice el que tape su
extremo superior para regular la caída de líquido.
19. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras,
éstas deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama.
Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a que se
enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la caja de Petri que
contiene el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas
utilizado, deben flamearse nuevamente.
20. Al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material
que se ha utilizado. Cada equipo se responsabilizará de su zona de trabajo
y de su material.
3

4. PRACTICA 1: PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MATERIAL
INTRODUCCIÓN
La presencia de microorganismos en todos los medios ambientales hace
imprescindible que para estudiar una bacteria determinada sea necesario destruir
todas aquellas que pudieran encontrarse contaminando los medios o los
instrumentos de trabajo. Esto se consigue mediante la ESTERILIZACION,
consistente en la destrucción de todo microorganismo.
Generalmente en las prácticas de microbiología se utiliza el calor como método de
esterilización rutinario, aunque existen otras técnicas. Los medios con contenido
acuoso han de ser esterilizados en el AUTOCLAVE mediante calor húmedo,
obtenido por calentamiento en un depósito hermético que contiene agua y del que
previamente ha sido evacuado el aire con el fin de limitar las oxidaciones. En este
sistema el vapor de agua sobrecalentado a 121 (2 atm) o 111 ºC (1.5 atm) difunde
muy rápidamente, haciendo que los elementos termosensibles de las células se
desnaturalicen, especialmente sus enzimas.
Conceptos generales
El concepto de esterilización implica la eliminación de todas las formas vivas.
Según dicha definición, estéril significa libre de organismos. Otras metodologías,
como desinfección, pasteurización, etc., conllevan una eliminación parcial de los
microorganismos existentes.
Métodos de esterilización:
1. Agentes físicos
a) Calor
- Calor seco: flameado, aire caliente (horno Pasteur)
- Calor húmedo: vapor saturado (AUTOCLAVE). En el autoclave la
esterilización se produce mediante vapor de agua a presión. En el autoclave se
alcanza una temperatura de 121º C a una presión de 1 atmósfera sobre la presión
ambiental.
b) Filtración: permite la eliminación de los microorganismos de un medio
líquido, sin la destrucción de estos. Para ello se hace pasar la muestra
líquida a través de un filtro de membrana con tamaño de poro inferior al
tamaño de los microorganismos (0,2-0,45 micras). Los microorganismos
quedarán retenidos en el filtro y el fluido obtenido tras la filtración estará
estéril.
c) Radiaciones:
- Rayos gamma: radiaciones ionizantes
- Rayos Ultravioleta: de escasa penetración y de utilidad para eliminación
de microorganismos de superficies.
4

5. Figura 1. Esquema de autoclave.
2. Agentes químicos: para esterilizar material (generalmente algunos tipos de
plástico) que son termolábiles. Como el óxido de etileno y glutaldehído.
3. Otros métodos de eliminación:
- calor: ebullición, pasteurización, tindalización.
- agentes químicos: desinfectantes, antisépticos.
OBJETIVOS:
1. Preparar material de vidrio de uso microbiológico para su esterilización en
autoclave.
2. Emplear la técnica de vapor húmedo para el control de microorganismos.
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
MATERIAL
Algodón
Gasa
Papel estrasa
Tijeras
Hilo de algodón
Pinzas
Cinta testigo
Aguja enmangada
5

6. Pipetas de vidrio
Cajas de Petri
Mechero de alcohol
Autoclave
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DEL MATERIAL A ESTERILIZAR
1. Colocar un filtro de algodón en el extremo posterior de las pipetas con
ayuda de la aguja enmangada (con precaución de que el algodón no quede
excesivamente compactado). El exceso de algodón externo será flameado
con un mechero de alcohol. Las pipetas serán envueltas en papel estrasa
cuidando de proteger la punta y posteriormente autoclavadas
empaquetadas. Se debe tomar la precaución de orientar las pipetas, de
forma que todas ellas se puedan extraer posteriormente sin ser expuestas a
contaminación.
2. Cada una de las cajas de Petri (de vidrio) será envuelta en papel estrasa y
el conjunto empaquetado para su esterilización en autoclave.
3. Se prepararán tapones con algodón y gasa para los matraces antes de ser
esterilizados.
4. Los tubos con tapón de rosca conteniendo agua destilada (9 ml), serán
esterilizados en autoclave, dejando ligeramente suelto el tapón.
5. Todo el material de vidrio será esterilizado en autoclave durante 15 minutos
a 120 oC y 15 lb de presión.
NOTA: El material de vidrio también se esteriliza mediante calor seco en el Horno
Pasteur. Una vez limpio, el material se envuelve en aluminio o papel, se introduce
en un contenedor (ej: pipetas en pipetero) y se mantiene en el horno durante dos
horas a 160 ºC. En el caso de los portainóculos que se están utilizando
constantemente, se utiliza el calor directo del mechero, que también sirve para
flamear los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc.
RESULTADOS
1. Esquematizar el proceso de esterilización de material de vidrio.
2. Explicar el funcionamiento del autoclave.
3. Investigar los métodos físicos y químicos para el control de
microorganismos, mencionando un uso específico para cada uno.
CONCLUSIONES
6

7. PRACTICA 2. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. La diversidad metabólica de estos organismos es enorme, por
ello, la variedad de medios de cultivo es también amplia, y no existe un medio de
cultivo universal adecuado para todos ellos.
Constituyentes habituales de los medios de cultivo
1. Fuente de carbono y sales. En muchos casos, la glucosa, la lactosa u otras
dextrosas se emplean como fuentes de carbono. Algunos medios de cultivo
se complementan con sales como el NaCl o diversos fosfatos y/o sulfatos
de potasio, magnesio, amonio, etc.
2. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los
medios de cultivo. el componente dominante en el agar bacteriológico es un
polisacárido, al que acompañan algunas impurezas, que se obtiene de
ciertas algas marinas (rodófitas). Un gel de agar al 1-2 % en agua licúa
hacia los 100 oC y se gelifica alrededor de los 40 oC, dependiendo de su
grado de pureza. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el
agar no se emplea como nutriente.
3. Extractos. Para su preparación, cortos órganos o tejidos animales o
vegetales (p. ej., carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y
calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo.
estos preparados deshidratados se emplean con frecuencia en la
confección de medios de cultivo. Son una fuente rica de alimentos,
vitaminas y diversos factores de crecimiento. Ejemplo: extractos de carne,
de levadura, de malta, etc.
4. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos nitrogenados y sales
minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas
animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas
son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en
determinadas vitaminas y sales.
5. Fluidos corporales. sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el
cultivo de algunos patógenos. la sangre no puede esterilizarse y debe, por
tanto, obtenerse en condiciones asépticas directamente de un animal sano.
los fluidos corporales no sólo contribuyen como factores de crecimiento, si
no también con sustancias que neutralizan inhibidores de crecimiento de
algunas bacterias.
6. Sistemas amortiguadores (soluciones tamponadas). Algunos componentes
son incorporados al medio al medio de cultivo para mantener el pH dentro
7

8. del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos más
comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a
la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias
como las peptonas, previenen variaciones del pH.
7. Indicadores de pH. indicadores ácido-base se añaden a menudo a los
medios e cultivo para detectar variaciones del pH.
8. Agentes reductores. Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores
que se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan
el desarrollo de microorganismos microaerófilos o anaerobios.
9. Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de
cultivo puede convertirlo en selectivo. Por ejemplo cristal violeta, sales
biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración
adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados
microorganismos.
Tipos de medios de cultivo
1. Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos.
2. Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del
resto.
3. Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo microbiano
determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.
4. Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve
propiedades que posee un determinado tipo de microorganismo.
OBJETIVOS:
1. Preparar medios de cultivo sólidos.
2. Esterilizar mediante calor húmedo los medios de cultivo.
3. Vaciar en placa los medios de cultivo.
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
1. Preparación de medios de cultivo
Caldo común. Composición por litro.
Material:
Extracto de carne 3g
Peptona bacteriológica 10g
Cloruro sódico 5g
8

9. Para prepararlo, se añaden los distintos componentes en un matraz de dos litros,
se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 y se lleva al volumen final
correspondiente. Posteriormente, se reparten en tubos utilizando un embudo al
que se acopla una goma o un dosificador automático. Los recipientes se aíslan
con tapones metálicos o de algodón envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de
presión.
Agar nutritivo.
- La composición es la misma que la del caldo común, pero se añade antes de
esterilizar 15 g de agar por litro, disolviéndolo durante la esterilización.
- Pesar y disolver los componentes en el medio en el volumen indicado de agua
destilada.
- Ajustar el pH del medio, si procede.
- Para asegurar la completa disolución del agar, el medio se calienta hasta
ebullición al mismo tiempo que se somete a agitación, previamente a su
esterilización en el autoclave.
Medio base para la fermentación de azúcares. Inicialmente se prepara un
medio base pobre en aminoácidos de la siguiente composición por litro:
Material:
Extracto de carne 1g
Peptona bacteriológica 10 g
Cloruro sódico 5g
Una vez disueltos los componentes, se ajusta el pH a 7 y se añaden 2 ml de
solución de púrpura de bromocresol (PBC: 1.6 g en 100 ml de etanol al 45%. Se
disuelve inicialmente en etanol al 95 y posteriormente se diluye con agua) por litro.
Este es un indicador de pH que vira a amarillo por debajo de pH 5.2, por lo que
permite la detección de la producción de ácido en el medio. El medio se reparte en
tres volúmenes iguales a los que se añade 10 g por litro de glucosa, lactosa o
sacarosa. Una vez disuelto, se reparte en tubos en los que previamente se ha
introducido una campana Durham, pequeño tubo de ensayo que se dispone en
posición invertida para detectar la presencia de gases. El medio ha de ocupar
completamente el interior de estas campanas para poder detectar posteriormente
el desprendimiento de gases en la fermentación. (No olvidar marcar cada tubo con
la inicial del azúcar que contenga). Una vez taponados, se esterilizan a 0.5 atm
durante 20 min.
2. Esterilización de medios de cultivo
9

10. Una vez preparado el medio, éste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el
crecimiento de microorganismos:
- Medios sólidos en placa: Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con papel
de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121º C, 15-20 min). Una vez
estéril repartir el medio en placas de Petri estériles y dejar en reposo para su
solidificación.
- Medios sólidos en tubo (agar inclinado): Tras la ebullición del medio con agar,
éste se reparte en los tubos de cristal, de forma que queden llenos hasta
aproximadamente la mitad. Los tubos se cubren con tapón (de aluminio) para
llevar al autoclave. Una vez esterilizado, los tubos se disponen en posición
inclinada para su solidificación.
- Medios líquidos: Una vez disueltos los componentes del medio en el matraz,
repartir en su caso en tubos de 2-4 ml por tubo, cubrir con tapón y llevar a
esterilizar en el autoclave. Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el
matraz, y posteriormente repartirlo con la ayuda de pipetas estériles en tubos de
plástico estériles.
- Medios semisólidos: Se preparan con concentraciones inferiores de agente
solidificante (agar-agar). El medio se reparte en tubos.
RESULTADOS
1. Esquematizar el proceso de preparación de medios de cultivo.
2. Investigar tipos de medios de cultivo, su composición y uso.
3. Mencione las características que debe tener un medio de cultivo para el
crecimiento de un fitopatógeno.
4. Indique como determinaría la necesidad de nutrientes esenciales de un
microorganismo.
CONCLUSIONES
10

11. PRACTICA 2. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
INTRODUCCIÓN
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o
menos complejas. Por ello, una técnica especial en microbiología es la que
permite la obtención de cultivos puros o axénicos, a partir de los cuales son
posibles estudios sobre las propiedades de un microorganismo concreto, ya que
un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. Aunque
existen numerosas técnicas de aislamiento, las más utilizadas emplean un medio
sólido sobre el que se desarrollarán las colonias macroscópicas como resultado
del crecimiento y división de los microorganismos. Teóricamente cada colonia
procede de la multiplicación de una sola célula; sin embargo, una colonia también
puede ser el resultado de la multiplicación de un agregado de células. Por otra
parte, no todas las células bacterianas son capaces de formar colonias, ya que no
crecen en medios de cultivo. Por tal razón, lo más correcto es hablar de unidades
formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia.
Manejo de las muestras y toma del inoculo
La toma del inóculo de una muestra de un medio sólido o líquido es simple, pero
requiere atención. Se recomienda lo siguiente:
1. Coloque frente al manipulador el mechero y la preparación o muestra que
contiene los microorganismos, así como el resto del material necesario
(tubos, placas, pipetas, etc.), que pueda ser alcanzado con facilidad.
2. Tome el asa de siembra y flamee el filamento hasta que este alcance un
rojo incandescente. Enfríelo en la proximidad de la llama (unos 10 s).
Recuerde que las llamas “frías” son anaranjadas y no esterilizan. Las
llamas muy “calientes” son de color azul, y si esterilizan.
3. Tome con la otra mano el recipiente (tubo, placa, etc.) que contiene la
muestra. Si la muestra está en un tubo, quite el tapón con los dedos
meñique y anular como se muestra en la figura 2 y flamee la boca del tubo.
Si la muestra está en una placa de Petri, coloque la placa invertida sobre la
mesa de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los
microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del mechero.
4. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, introduzca el
asa de siembra y tome una pequeña muestra del cultivo. Si el medio es
liquido, agite ligeramente el tubo y tome una muestra que quedará adherida
por tensión superficial en el extremo del filamento del asa de siembra. Si los
microorganismos están en forma de colonias o sobre un medio sólido, tome
11

12. una pequeña porción de una de las colonias mediante un ligero roce con el
asa de siembra.
5. Deposite el inóculo en un medio de cultivo estéril.
6. Siembre sobre la superficie del medio de cultivo. Marque las placas con la
identificación del cultivo, la fecha y el nombre. Incube en las condiciones
adecuadas durante el tiempo necesario para que se desarrollen los
microorganismos.
7. Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flaméela de nuevo con el
objeto de esterilizarla.
12

13. Figura 2. Manejo de muestras y toma del inóculo.
OBJETIVOS
1. Aislar un microorganismo de una mezcla de varios (suelo, vegetales y
alimentos en descomposición, plantas enfermas, aguas grises, etc.).
2. Obtención de cultivos puros de microorganismos a partir de un cultivo
mixto, mediante estría en medio sólido.
3. Recuento de microorganismos empleando la técnica de diluciones seriadas.
Procedimiento
a) Aislamiento mediante agotamiento por estrías. Se trata de un método
rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un
medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo final consiste en
obtener un número reducido de colonias distribuidas individualmente sobre
la superficie de la placa. Al incubar esta, cada una de las bacterias originará
una colonia. Normalmente, una colonia aislada es un cultivo puro.
Material
Muestra mixta con microorganismos (suelo, basura, agua, alimentos en
descomposición, yoghurt, etc.).
Medio de cultivo (Agar nutritivo) en placas de Petri
Tubos de ensaye
Agua destilada estéril
Mechero Bunsen
Mechero de alcohol
Pipeta de vidrio estéril
Asa de siembra
1. En condiciones estériles (mesa desinfectada con benzal y mechero
encendido), resuspender 0,1-1 g de muestra en un tubo con 1 ml de agua
destilada estéril.
2. Agitar bien en vórtex. Dejar sedimentar las partículas.
3. Tomar una muestra del sobrenadante con el asa de platino (como fue
indicado anteriormente), o con pipeta de 2 ml estéril, y extender con el asa
(previamente flameada) en una placa de Agar Nutritivo (ver figura 3).
13

14. 4. Una vez sembrada la muestra por estriado, marcar la caja con la clave
asignada y número de aislamiento que le corresponde (por ejemplo, A1).
Incubar a 28 oC durante 24 h, o hasta que haya crecimiento de
microorganismos.
Figura 3. Aislamiento de microorganismos a partir de una muestra mixta.
14

15. Figura 4. Técnica de aislamiento por estría en superficie.
RESULTADOS
1. Esquematice el proceso realizado para el aislamiento de microorganismos a
partir de una muestra mixta.
2. Reporte en un cuadro el número de colonias obtenidas y su morfología
macroscópica.
Colonia Forma Borde Elevación Superficie Fotografía
1
2
3
3. Indique cuales fueron las colonias seleccionadas para resiembra y
obtención de un cultivo puro.
15

16. b) Obtención de un cultivo puro a partir de un cultivo mixto. El trabajo
con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con
poblaciones extensas y homogéneas del microorganismo a estudiar. Por lo
tanto, es necesario utilizar técnicas que permitan obtener un cultivo puro,
y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo. Para obtener cultivos
puros se utilizarán instrumentos estériles y colonias aisladas del
microorganismo deseado.
Para aislar un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo
puro del mismo, la técnica más utilizada es la de siembra por estría en
placa Petri, en medio sólido, que permite obtener colonias separadas de
individuos que proceden por división de una única célula. Estas colonias
nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra técnica consiste en
obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer
diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir
colonias aisladas.
Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo
resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en
glicerol (10-30%) a -80°C, en nitrógeno líquido a -173°C, o mediante
liofilización.
Material
Cultivos de microorganismos en agar nutritivo
Medio de cultivo (Agar nutritivo) en placas de Petri
Mechero Bunsen
Mechero de alcohol
Asa de siembra
Estereoscopio
1. Observación de colonias aisladas. Con el uso de un estereoscopio se
observará la morfología de cada una de las colonias desarrolladas en las
placas de Petri (aislamiento 1).
2. Resiembra. Tomar una muestra del cultivo mixto, con ayuda del asa de
siembras previamente flameada. Debe flamearse el asa antes y después de
16

17. tomar la muestra. La muestra se extiende con suavidad con el asa sobre la
superficie del medio de agar nutritivo en placa Petri (ver figura 4). Una vez
finalizada la resiembra, se vuelve a tapar la placa y está se dispone en
posición invertida para llevar a incubar a 28 ºC durante 24 horas.
3. Se harán las resiembras necesarias hasta obtener cultivos puros de las
colonias seleccionadas.
RESULTADOS
1. Reporte en un cuadro el número de colonias obtenidas y su morfología
macroscópica.
Colonia Forma Borde Elevación Superficie Fotografía
1
2
3
2. Indique cuales fueron las colonias seleccionadas para resiembra y
obtención de un cultivo puro.
3. ¿Cómo demuestra que tiene un cultivo puro aislado?
c) Recuento de microorganismos. Frecuentemente, las muestras
naturales tienen un número muy elevado de microorganismos, por lo que
se requiere diluirlas para poder efectuar recuentos. Para ello, se realizan
diluciones seriadas que posteriormente se siembran en placas con el medio
de cultivo adecuado. El método más habitual para la determinación de
células viables se basa en contar el número de colonias. Según el concepto
de UFC, solo se van a cuantificar los microorganismos que se multipliquen
en las condiciones concretas del ensayo (temperatura, medio de cultivo,
atmósfera, etc.). La inoculación de la placa con la muestra que contiene
17

18. los microorganismos puede realizarse: a) mezclándolo previamente con el
medio fundido y temperado, para verterlo después sobre la placa de Petri
vacía (método de vertido en placa o siembra en profundidad); b)
directamente sobre el medio ya solidificado en la placa (método de
extensión sobre placa).
Material
5 tubos con 9 ml de solución salina o agua destilada estéril
Pipetas estériles de 1 ml
Placas de agar nutritivo
Muestra: resuspender una colonia en 10 ml de agua destilada estéril
1. Diluciones seriadas (Ver figura 5)
 Abrir el recipiente que contiene la muestra problema y flamear la boca del
mismo. Tomar 1 ml de la muestra problema. Flamear de nuevo la boca del
recipiente y taparlo. Transferir 1 ml al primero de los tubos con 9 ml de agua
destilada estéril o solución salina estéril, flameando la boca del tubo después
de retirar el tapón y antes de reponerlo.
 Agitar el tubo para homogenizar totalmente la suspensión. De esta forma, se
consigue diluir la muestra inicial 10 veces (dilución 10-1).
 Agitar bien el tubo con la primera dilución. Con una nueva pipeta estéril de 1
ml, transferir 1 ml de esta primera dilución al segundo tubo con 9 ml de agua.
Agitar el tubo y marcarlo como dilución 10-2.
 Repetir la misma operación para conseguir las diluciones 10 -3, 10-4, 10-5, etc. El
número de diluciones dependerá de la carga microbiana que se sospeche que
contiene la muestra.
2. Siembra en profundidad (Ver figura 5)
 Transferir con una pipeta estéril 1 ml de cada dilución de la muestra a placas
de Petri con el medio de agar fundido y atemperado a 45-50 oC.
 Mezclar y distribuir uniformemente (girando la placa con suavidad), se deja
enfriar hasta su solidificación.
 Invertir las placas e incubar en las condiciones adecuadas requeridas.
3. Extensión sobre placa (Ver figura 6)
 Transferir con una pipeta estéril 0.1 ml de cada dilución de la muestra a
placas de Petri con el medio de cultivo ya solidificado. Este inóculo debe
extenderse de forma homogénea por toda la superficie de la placa, para lo
cual se utilizará la varilla de vidrio acodada, previamente esterilizada
(impregnándola de alcohol y pasándola por la llama del mechero).
 incubar las placas en posición invertida a 30 oC durante 24 horas.
18

19.  Después del periodo de incubación examinar las placas. Las colonias
aparecerán sobre la superficie del agar. Cada colonia representa los
descendientes de una unidad formadora de colonia (UFC).
A
B
Figura 5. Recuento de microorganismos. A. Diluciones seriadas B. Siembra
en profundidad.
Serie de
disoluciones
conocidas de
la muestra
cayado
19
Siembra por Extensión en Superficie

20. Figura 6. Siembra por extensión en placa.
Resultados
1. Calcular el número de UFC/ml de las muestras problema a partir del
recuento de colonias.
2. Discutir las condiciones necesarias para efectuar un análisis adecuado de
recuento de colonias.
3. ¿Se obtendría el mismo resultado si cuantificáramos las bacterias
presentes en una muestra por turbidimetría o por diluciones seriadas? ¿Por
qué?
4. Aplicando la técnica de esta práctica, considere que se han sembrado 2
placas de medio de cultivo a partir de las diluciones 10 -4 y 10-5. Tras la
incubación de las placas a 37 oC durante 24 horas, no apareció ninguna
colonia. ¿Significa esto que no había ninguna bacteria en la muestra
problema? ¿Por qué?
5. Considerando, que para un cultivo se toman 2.5 g de tierra y se
resuspenden en solución salina estéril hasta un volumen final de 50 ml. A
continuación, se hacen diluciones decimales y se siembran 0.2 ml de cada
una sobre un medio adecuado. Tras la incubación, en la placa de la dilución
10-6 se desarrollan 200 colonias. Calcule el número de UFC por gramo de
tierra.
6. Investigar otras técnicas de recuento bacteriano.
CONCLUSIONES
PRÁCTICA 4. OBSERVACION MICROSCOPICA
DE MICROORGANISMOS
INTRODUCCION
La gran mayoría de los organismos unicelulares son invisibles para el ojo humano,
por lo que e uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos
20

21. seres vivos. Para lograr una buena observación microscópica, además de
disponer de un adecuado aumento de la imagen, es necesario tener en cuenta dos
factores más: el contraste y la resolución. Los objetos deben tener un cierto grado
de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a través del
microscopio. Por otra parte, el grado o poder de resolución (la capacidad para ver
separados dos objetos muy próximos entre si) depende de las características del
sistema de lentes que posea el microscopio y está limitado por la longitud de onda
de la luz empleada, el índice de refracción del medio en que se realiza la
visualización y la apertura numérica del objetivo.
El microscopio óptico compuesto (ver figura 7) con iluminación en campo claro es
el más utilizado en los laboratorios de microbiología. El microscopio compuesto
recibe este nombre porque su sistema óptico dispone de dos o más lentes de
aumento. Estructuralmente, un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el
sistema óptico.
Figura 7. Microscopio óptico compuesto.
1. Soporte. Es elemento que proporciona un apoyo fijo y estable a todo el
resto de elementos del microscopio. Sus partes principales son las
siguientes:
a) La base, que normalmente alberga la fuente de iluminación (lámpara de
incandescente o halógena). Muchos microscopios poseen en su base un
reóstato para variar la intensidad de la luz que llega a la preparación. En
algunos modelos la base incorpora un sistema portafiltros con varios filtros
de luz y un diafragma del campo luminoso.
21

22. b) El brazo soporta el sistema óptico, el cabezal portaoculares (mono o
binocular) y el revolver portaobjetitos. En el brazo se dispone también el
mecanismo de anclaje de la platina, dotado de un sistema de movimiento en
el eje vertical controlado por los tornillos macrométrico y micrométrico.
c) La platina es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su
observación. Presenta un orificio central por donde pasa la luz y esta
equipada con un sistema de fijación de la preparación, que permite el
desplazamiento del portaobjetos sobre la platina en los dos ejes del plano
horizontal y facilita el cambio del campo de observación.
d) Los tornillos macrométrico y micrométrico controlan el movimiento de la
platina en el eje vertical y así permiten el enfoque de la preparación. El
primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con el objetivo
de menor aumento (x 10), mientras que el tornillo micrométrico permite
afinar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40,
x100).
2. Sistema óptico. El sistema óptico de un microscopio compuesto consta
normalmente de tres lentes o conjuntos de lentes denominados
condensador, objetivo y ocular. Las dos últimas se alojan en los extremos
del tubo del microscopio y su acción combinada produce el aumento total
de la imagen, puesto que son las lentes que se interponen entre la
preparación el ojo del observador.
a) El condensador, es la lente o conjunto de lentes colocadas entre la fuente
de iluminación y la preparación. Su misión es recoger los rayos de luz
procedentes de la fuente de iluminación y concentrarlos sobre la
preparación. El condensador incorpora un diafragma tipo iris, que permite
ajustar la cantidad de luz que llega a la preparación y actúa de un modo
muy eficaz sobre el contraste final de de la imagen microscópica. Cuando
se empleen grandes aumentos, es fundamental conseguir una iluminación
óptima; en este caso es necesario realizar un centrado tanto de la fuente
de luz como del condensador, además de un correcto diafragmado.
b) El objetivo genera una imagen ampliada e invertida que se forma en el
plano focal anterior del ocular. Los objetivos están montados sobre un
soporte rotatorio o revólver que posibilita cambiar de un objetivo a otro
mediante un sencillo giro. A diferencia del resto de objetivos, el objetivo de
inmersión (normalmente de 100 aumentos), está diseñado para emplearse
en contacto directo con aceite de inmersión para microscopia, que se
aplica previamente sobre la preparación y se interpone entre esta y el
objetivo. Como los índices de refracción del portaobjetos (vidrio) y del
aceite son prácticamente iguales, los rayos de luz no son refractados al
pasar de un medio a otro, lo que se traduce en una mayor resolución.
22

23. c) El ocular es la lente, o conjunto de lentes que aumentan a modo de lupa
la imagen real proyectada por el objetivo y permite que sea percibida en la
orientación y posición correctas por el ojo del observador. El ocular es el
elemento del sistema óptico que se encuentra más próximo al ojo del
observador. Suele llevar grabado el número de aumentos (x10,
generalmente).
OBJETIVOS
1. Conocer el manejo y uso del microscopio óptico.
2. Practicar la observación con el microscopio y familiarizarse con el uso del
aceite de inmersión.
3. Identificar cultivos puros por observación microscópica.
4. Observar microorganismos vivos e identificar su morfología en condiciones
naturales con ayuda del microscopio.
5. Preparar frotis bacterianos y realizar tinciones simples empleando dos tipos
de colorantes.
6. Observar la morfología bacteriana y distinguir los distintos tipos de
agrupaciones.
7. Diferenciar entre bacterias Grampositivas y gramnegativas.
8. observar las formas y tamaños de las endosporas en varias especies
bacterianas formadoras de endosporas.
.
PROCEDIMIENTO
a) Manejo y uso del microscopio
Material
Microscopio óptico por equipo
Portaobjetos
Cubreobjetos
Algodón
1. Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos están limpias.
De no ser así, límpielas cuidadosamente con un algodón o papel especial
para óptica. No toque las lentes con los dedos.
2. Coloque el portaobjetos (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte
superior) sobre la platina, de manera que quede asegurado por las pinzas
de sujeción. Compruebe previamente que el objetivo de menor aumento (x4
o x10) está en posición de empleo.
23

24. 3. Disminuya la iluminación de la preparación bajando el condensador (más
contraste), y con el diafragma abierto.
4. Coloque en posición el objetivo de 10 aumentos (x10) y realice la operación
de enfoque de la manera siguiente:
a) Sin mirar por el ocular, gire el tornillo macrométrico y acerque al
máximo la lente del objetivo a la preparación.
b) Mirando por el ocular, gire el tornillo macrométrico en sentido
opuesto y aleje el objetivo de la preparación lentamente hasta que
obtenga un enfoque nítido.
5. Gire el revólver y coloque en posición de objetivo X40. Suba ligeramente el
condensador hasta obtener una iluminación suficiente para ese aumento.
La imagen debería estar casi enfocada, pero puede ser necesario afinar el
enfoque girando un poco el tornillo micrométrico. La distancia óptima
funcional del objetivo de X40 es de unos pocos milímetros por encima de la
preparación, por lo que podría romperse si no se maneja con precaución.
Por otra parte, cuando se ha realizado una observación con el objetivo de
inmersión (X100), no puede volver a enfocar la muestra con el objetivo de
X40, ya que este lente no debe nunca estar en contacto con el aceite.
6. Empleo del objetivo de inmersión (X100):
a) Una vez que haya enfocado con el objetivo de X40, gire el revólver
hacia el objetivo de inmersión sin llegar a colocarlo en posición.
b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la muestra en la
zona de observación.
c) Gire con precaución el revólver hasta situar en posición el objetivo
de inmersión asegurándose que este no toca la preparación, pero si
la gota de aceite.
d) Gire ligeramente el tornillo micrométrico hasta conseguir un enfoque
nítido. La preparación debería estar prácticamente enfocada si se
ha realizado un enfoque adecuado con el objetivo de X40. De no
ser así, es preferible volver a enfocar de nuevo un campo distinto,
libre de aceite de inmersión.
e) Finalizada la observación de una preparación y antes de retirarla de
la platina, se colocará el objetivo de menor aumento. Nunca retire la
preparación con el objetivo de inmersión en posición de
observación.
f) Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión con cuidado
empleando algodón. Compruebe también que el objetivo de X40
está perfectamente limpio.
RESULTADOS
1. Investigar el funcionamiento del sistema óptico del microscopio compuesto.
24

25. 2. investigar el funcionamiento y uso de otros microscopios ópticos
especiales.
b) Examen en fresco de microorganismos
El examen en fresco de una suspensión microbiana es la técnica de observación
microscópica más fácil y rápida de realizar. Es el método de elección cuando se
desea evitar la alteración que sufren los microorganismos de una muestra cuando
esta se somete a una fijación y a una posterior tinción. El examen en fresco
posibilita la observación de microorganismos vivos, y permite estudiar
determinadas características como su morfología y tamaño reales, su color natural
o su movimiento.
Material
Mechero Bunsen
Asa de siembra
Portaobjetos y cubreobjetos
Muestras obtenidas en aislamiento (práctica anterior)
Muestra de agua estancada
Microscopio de campo claro
Aceite de inmersión
1. Usando un gotero o una pipeta, colocar una gota de agua sobre un
portaobjetos bien limpio y desengrasado.
2. Usando el asa de siembra previamente flameada, tomar una colonia o una
porción de esta (si se encuentra en un medio sólido), y extender
suavemente sobre la gota de agua en el portaobjetos hasta ocupar una
superficie de aproximadamente 1 cm2 .
3. Colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos. Para evitar que se formen
burbujas, depositar el cubreobjetos sobre la gota, primero una arista y
luego, lentamente, el resto.
4. Observar a través del microscopio.
25

26. NOTA: Tenga en cuenta que el calor generado por el foco luminoso irá
secando la preparación dificultando la observación de la muestra. Para que
esto no suceda, como alternativa se puede aplicar parafina en los bordes del
cubreobjetos.
RESULTADOS
1. Identifique si existe movimiento activo de los microorganismos (por medio de
cilios o flagelos, o por deslizamiento), o movimiento pasivo de vibración o
“browniano”.
2. Identifique (con dibujos o fotografías) los diferentes tipos morfológicos de los
microorganismos observados.
3. Señale las ventajas e inconvenientes del examen en fresco.
c) Preparación de un frotis bacteriano
La mayoría de las bacterias son transparentes, por lo que suele ser necesario
recurrir al uso de tinciones si se desea observar a estos seres vivos con un
microscopio óptico convencional. Las tinciones aumentan artificialmente el
contraste entre las células bacterianas y el medio circundante. La tinción que hace
uso de un solo colorante se denomina tinción simple. Las tinciones más usadas en
microbiología requieren que la muestra en estudio se someta al proceso de
fijación. Habitualmente, las muestras bacterianas se preparan para ser observadas
en forma de frotis o extensión sobre portaobjetos, lo que asegura una adecuada
26

27. separación entre las células y facilita que la tinción posterior se distribuya de
manera homogénea. Para hacer un frotis o extensión, la suspensión bacteriana se
homogeneiza bien, se extiende sobre un portaobjetos y se fija (Figura 8).
Material
Mechero Bunsen
Asa de siembra
Portaobjetos
Cultivos bacterianos
1. Coloque sobre un portaobjetos limpio una pequeña gota de agua. La
cantidad de agua no debe superar la que se puede reunir tomando dos
veces con el asa de siembra.
2. a) Transfiera una pequeña cantidad del cultivo (la equivalente a una
pequeña porción de una colonia) a la gota. Empleando el asa de siembra
previamente flameada, disperse los grumos y luego remueva la gota
mediante movimientos circulares hasta formar una suspensión homogénea.
Extienda la preparación para facilitar el secado.
2. b) Si parte de un cultivo bacteriano en medio liquido, coloque una gota
pequeña de la suspensión bacteriana (tomando muestra varias veces con el
asa de siembra) sobre el portaobjetos. Extienda la preparación para facilitar
su secado.
3. Fijación de las bacterias al vidrio portaobjetos:
a) Por calor. Caliente el portaobjetos a la llama con rápidos pases sobre el
mechero Bunsen. No utilice pinzas, el calor en exceso dañaría la
integridad-estructura de las células.
b) Con metanol (apropiado para bacterias procedentes de medio liquido).
Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión previamente desecada al
aire. Retirar de inmediato el exceso de metanol del portaobjetos,
golpeándolo ligeramente por una orilla sobre un papel de filtro. Esperar a
que el metanol se evapore completamente.
27

28. Figura 8. Preparación de un frotis bacteriano.
d) Tinción simple
28

29. Como la mayoría de los microorganismos carecen de una coloración natural, hay
que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la
imagen. Una forma sencilla de conseguir este contraste consiste en realizar
tinciones simples con un colorante. Para poner de manifiesto o realzar de manera
específica determinadas características morfológicas o estructurales de las
células microbianas se emplean tinciones diferenciales con varios colorantes.
Estas últimas tienen un gran interés para identificar y clasificar las bacterias. La
tinción diferencial más utilizada en bacteriología es la tinción de Gram. Otras
tinciones de gran importancia bacteriología son las que sirven para teñir capsulas
mediante tinción negativa, las que se emplean para diferenciar las bacterias
aaaaa2acido alcohol-resistentes” y las que permiten poner de manifiesto
estructuras bacterianas características como las endosporas.
Material
Mechero Bunsen
Asa de siembra
Portaobjetos
Cultivos bacterianos
Colorantes para tinción:
a) Solución de cristal violeta al 1%
b) Solución de safranina al 0.5 %
Microscopio
Aceite de inmersión
1. Cubrir un frotis con cristal violeta y el otro con safranina cuidando que no
quede ninguna porción sin teñir. deje actuar a los colorantes durante 1
minuto.
2. lavar las preparaciones con agua para eliminar el exceso de colorante. para
ello incline el portaobjetos y aplique el agua corriente de grifo en su parte
superior de manera que resbale poco a poco sobre l frotis. No dirija el agua
directamente sobre el frotis pues podría despegar parte de la preparación.
3. Secar el portaobjetos por simple presión entre dos papeles de filtro o
mediante calor. En ningún caso frote el portaobjetos con papel u otro tejido.
4. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión.
29
Figura 9. Tinción simple.

30. Figura 10. Morfología bacteriana y tipos de agrupaciones.
RESULTADOS
1. Dibujar o fotografiar la morfología y agrupación de las bacterias
observadas.
2. ¿Observó microorganismos diferentes a las bacterias? ¿Qué características
morfológicas presentaron?
3. Indique que etapas debería seguir para preparar una extensión de las
siguientes muestras: yogur, saliva, sedimento de un río, una colonia
bacteriana resuspendida en agua.
4. ¿Qué finalidad tiene fijar las muestras cuando se realiza un frotis
bacteriano?
5. Señale las ventajas y desventajas de la tinción simple respecto del examen
en fresco.
6. Con los resultados de una tinción simple, ¿se puede saber si la muestra
teñida es un cultivo puro?
30

31. e) Tinción diferencial de Gram
Las tinciones diferenciales se denominan así porque son capaces de diferenciar
estructuras o incluso microorganismos que poseen características superficiales
distintas. Este tipo de tinciones requieren de más de un colorante. La tinción
diferencial más empleada es la tinción de Gram, llamada así en honor de Christian
Gram, patólogo danés que la describió por primera vez en 1884. La aplicación de
esta tinción permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: las bacterias
Grampositivas y las bacterias gramnegativas. Estos dos grupos poseen
características estructurales superficiales notablemente distintas (Figura 11).
El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos
grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más
fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante
(Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en
las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda
retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán
después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
Figura 11. Paredes celulares bacterianas.
31

32. Material
Portaobjetos con frotis bacterianos previamente preparados a partir de cultivos
aislados por cada equipo.
Colorantes
)a Solución de cristal violeta al 1 %
)b Solución de safranina al 0.5 %
)c Solución diluida de yodo (Lugol)
)d Etanol-acetona (1:1)
Microscopio y aceite de inmersión
Papel filtro
1. Preparar frotis bacterianos. Prepare una extensión con cada una de las
colonias aisladas en cultivo puro.
2. Teñir con cristal violeta (1 min).
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con lugol (1 min).
5. Lavar con agua el exceso de lugol.
6. Lavar la preparación con etanol-acetona hasta que observe que no arrastra
más colorante de la muestra (10-20 segundos).
7. Lavar con agua para eliminar los restos de disolvente.
8. Teñir con safranina (1 min).
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación entre dos hojas de papel filtro cuidando de no frotar, o
bién secar por escurrimiento.
11. Examinar al microscopio con el objetivo de inmersión.
32

33. Figura 12. Tinción de Gram.
RESULTADOS
.1 Reportar la morfología de los microorganismos de cada una de las
colonias observadas e identificar como grampositivas o
gramnegativas.
.2 Si cambiara el orden de empleo de los colorantes primario y de
contraste, ¿cree que la tinción seguiría permitiendo distinguir entre
grampositivas y gramnegativas?
.3 ¿Cómo afectaría a las coloraciones finales si no se efectuara
correctamente el lavado con los solventes orgánicos?
.4 ¿Existe alguna relación entre el tipo de morfología y la tinción de
Gram?
PRACTICA 4. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES,
COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli POR LA
TÉCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MÚLTIPLE
(NÚMERO MÁS PROBABLE O NMP)
33

34. OBJETIVO
• Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
• Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la búsqueda de
microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
• Organizar e interpretar los resultados.
GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcionen como indicadores de contaminación fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes, tener una sobrevivencia similar a la de los
patógenos intestinales y deben de ser capaces de desarrollarse
extraintestinalmente. El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo
de la materia fecal, sin embargo, las características de sobrevivencia y la
capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas
potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación
fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será
la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.
Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat
primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra. El grupo
de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos
aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está
conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter
y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-
negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de
incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin
embargo la más prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de
organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo
líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado
dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como
comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay
algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas
E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores de
virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente.
Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y
delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las
toxinas son mediadas por plásmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han
34

35. sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están
implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
FUNDAMENTO
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del
Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a
35°C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de
sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos que se encuentren
presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente
de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo
lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de
aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante. La determinación del número más probable de microorganismos
coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva
y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y
producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un
periodo de 24 a 48 h. La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los
tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios
selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y
posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias
típicas.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1. Para análisis de agua
Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de
muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1.
• 5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o
caldo lactosado concentración doble o triple con campana de Durham.
• 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durham.
• 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de
Durham.
• Caldo EC MUG con campana de Durham.
• 2 cajas Petri con agar para métodos estándar.
• 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno.
• 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
• 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e
35

36. • 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de
Simmons (opcional)
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero
Perilla.
Gradilla
Balanza granataria.
Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodón.
Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodón.
Pipetas Pasteur estériles
Asa bacteriológica
Portaobjetos
Microscopio óptico
Termómetro calibrado
Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C
Incubadora a 35° ± 2,0ºC.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°C
Autoclave
PROCEDIMIENTO
1. Agua
1.1 Prueba presuntiva
• Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada
uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan
seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.
CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio
• In
c
u
b
a
r
los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h y observar si hay
36

37. formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si
no se observa producción de gas, incubar 24 h más.
1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde
brillante, con campana de Durham.
• Agitar los tubos para su homogeneización.
• Incubar a 35 ± 2 oC durante 24 a 48 h

• Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de
24 a 48 h.
• Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes totales/100 mL.
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.
• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con
caldo EC conteniendo campana de Durham.
• Agitar los tubos para su homogeneización.
• Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48
h.
• Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y
producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
• Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes fecales/ 100 mL.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y
una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli
• Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y
sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su
aislamiento.
• Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
• Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial:
• Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay
colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido
E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las
pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.
• Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.
• Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de
bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.
37

38. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
1. Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable
conforme al procedimiento señalado en la tabla 1, para estimar la población
de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia
coli de acuerdo con las diluciones empleadas.
2. Expresar en NMP/100 mL. En el caso de usar volúmenes de 20 mL de
muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos,
utilizar las siguientes tablas:
TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos
con 20 mL de muestra de agua o hielo.
38

39. TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos
con 10 mL de muestra de agua o hielo.
39