Biocontrol de bacterias en procesos de fermentación láctea. Presentación de resultados de este proyecto, en la II Jornada Técnica "Nuevas Tecnologías en Seguridad y Calidad de los Productos Lácteos". Cáceres, noviembre 2013

1. José Emilio Rebollo Feria
Cáceres, 14 de noviembre, 2013

2. Es clásico en el uso de insectos
depredadores, parásitos o hervívoros
para el control de plagas en agricultura
Aunque surge en el campo de la
Entomología, puede aplicarse a
cualquier sistema depredador-presa,
en el que se pretenda la eliminación
controlada de ésta última
Larva de la mariquita Harmonia axyridis depredando
a los áfidos fitófagos Eriosoma lanigerum
El Biocontrol es la eliminación o interferencia de especies biológicas parásitas,
patogénicas o contaminantes mediante el uso de especies antagonistas

3. También aves o mamíferos pueden ser útiles en biocontrol

4. En el extremo opuesto de la escala
biológica, los bacteriófagos o fagos son
organismos acelulares que infectan y
lisan bacterias de forma específica

5. La lisis bacteriana
provocada por
bacteriófagos es
fácil de visualizar:
• Se forman
halos de lisis
en un tapiz
• Se interrumpe
el crecimiento
en estrías
• Se clarifica un
cultivo
infectado

6. Biocontrol de bacterias en procesos de fermentación
láctea: protección de la actividad de cultivos
iniciadores y reducción de interferencias microbianas
ÁREA DE GENÉTICA (Facultad de Ciencias, UEx) y DEPARTAMENTO DE
LÁCTEOS (INTAEX, CICYTEX)
Finca La Orden Valdesequera (CICYTEX)
Área de Microbología (Facultad de Ciencas, UEx)
QUESERÍAS ALMONTE SL (Deleitosa, Cáceres)
QUESOS DEL CASAR SL (El Casar, Cáceres)
HNOS. PAJUELO, S.A.T. (Almoharín, Cáceres)
TENTUQUESO SL (Monesterio, Badajoz)
LACTOCYEX SL (Malpartida, Cáceres)
Consejo Regulador D.O.P. Torta del Casar
Consejo Regulador D.O.P. Quesos de Ibores

7. La contaminación por Escherichia coli es
una de las principales causas de hinchazón
en quesos, provocando importantes
pérdidas
Con nuestro proyecto nos proponemos
obtener bacteriófagos útiles para la
eliminación de las cepas de Escherichia
coli que interfieren la producción de
Quesos de Ibores y Tortas del Casar

8. Diseño experimental del proyecto
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Aislamiento y caracterización de bacterias
Aislamiento de bacteriófagos
Selección de fagos líticos o bacteriostáticos
Diseño de un cóctel de fagos
Caracterización de los bacteriófagos útiles
Pruebas del cóctel en laboratorio en medios líquidos
Pruebas del cóctel en planta piloto
Pruebas del cóctel en queserías
Pruebas del cóctel en ganaderías estabuladas

9. 1. Aislamiento y caracterización de bacterias
• Determinación de niveles de mesófilos totales, enterobacterias,
coliformes y E. coli.
• Evolución microbiana a lo largo de la maduración
• Aislamiento de coliformes
• Aislamiento de cepas autóctonas de E. coli a partir de queserías y
ganadería
Análisis microbiológico
Biolog

10. 1. Aislamiento y caracterización de bacterias
SDS-PAGE fingerprinting

11. 1. Aislamiento y caracterización de bacterias
OTU1-RT396
OTU2-RT1
OTU3-RT12
OTU4-RT381
OTU5-RT3
OTU6-RT472

12. 2. Aislamiento de bacteriófagos
• SE HAN REALIZADO 39 AISLAMIENTOS DE BACTERIÓFAGOS A PARTIR DE 12
CEPAS DE Escherichia coli AUTÓCTONAS
1. Se indujo el ciclo líticos de los profagos residentes por tratamiento
con mitomicina C
2. Se prepararon suspensiones purificadas de fagos sobre MG1665
• SE HAN OBTENIDO 8 DERIVADOS CLAROS A PARTIR DE TRES DE LOS NUEVOS
BACTERIÓFAGOS ASÍ COMO DERIVADOS CLAROS Y VIRULENTOS DEL FAGO
LAMBDA
1. Se trataron con UV (dosis bajas) las suspensiones de fagossilvestres
2. Se localizaron los halos de lisis claros sobre MG1665 para los
mutantes claros o sobre MG1665 (λ+) para aislar derivados virulentos
3. Se prepararon suspensiones purificadas de fagos sobre MG1665
Inducción de profagos y derivados claros y virulentos

13. 2. Aislamiento de bacteriófagos
• SE HAN REALIZADO 44 AISLAMIENTOS DE BACTERIÓFAGOS A
PARTIR DE HECES DE OVEJA:
1. Detección por el método de la gota (picar agar con virus a
partir de zonas de lisis)
2. Obtención de una suspensión de fagos sobre cepas
autóctonas
3. Titulación sobre la misma cepa y sobre MG1665
4. Puriricación de halos aislados y obtención de
suspensiones de bacteriófagos
• ENCONTRAMOS FAGOS TURBIOS Y CLAROS CON DIVERSOS
TAMAÑOS Y MORFOLOGÍA
Aislamiento de fagos a partir de heces de oveja

14. 3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos
FAGOS DE
LABORATORIO
Lambda (λ)
λvir*
λcI60
λindλcI ind-(ts)857
λimm434
λimm21
T2
T4
T6
P1vir
φ80
φ80 c• Cepa obtenida
en este trabajo
Cruce de estrías

15. 3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos
Cruce de estrías

16. 3. Selección de fagos líticos o bacteriostáticos
Fagos: 1: Hof13; 2: Homg3; 3: Homg514; 4: Homg565.1; 5: Homg565.2
1
2
3
4
5
Cruce de estrías

17. 4. Diseño de un cóctel de fagos
Hof13 Homg3 Homg514 Homg565.1 Homg565.2
CÓCTEL 3
CÓCTEL 5

18. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles
Hort394
Homg97
Homg565.2
Homg511
Homg3
Hof13
Hof13
Halos de lisis: forma y tamaño

19. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles
Hort394
Homg97
Homg565.2
Homg511
Homg3
Hof13
Halos de lisis: forma y tamaño

20. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles
Bacteriófagos del Orden Caudovirales. Constituyen más del 95% de
los fagos existentes. Tienen cola y ADN bicatenario. A: Mioviridales,
con cola contráctil y placa basal. B: Siphoviridales, con cola larga y
flexible. C: Podoviridales, con cola casi inexistente y placa con fibras.

21. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles
fRT59c
Hof13
Hort380
Homg519.2
Homg518
Homg518
Homg478.1
Homg478.1
Microscopía electrónica de transmisión

22. 5. Caracterización de bacteriófagos útiles
En progreso:
• Caracterización molecular de los genomas virales
o Electroforesis en campo pulsante
o Patrones de restricción
• Secuenciación completa de los bacteriófagos útiles
en cócteles
• Diseño de sistemas de detección específica de
bacteriófagos en medios sólidos y líquidos

23. 6. Pruebas del cóctel en medios líquidos
• ANÁLISIS DE LA LISIS EN MEDIOS DE LABORATORIO
• Composición de los primeros cócteles de fagos
Cóctel 1
FAGOS STANDAR:
- Lambda vir
- T4
- P1
Cóctel 2
FAGOS AISLADOS DE CEPAS DE E.coli PROCEDENTES DE QUESERÍAS:
- 6RT97
- fRT3c
-fRT12c

24. 6. Pruebas de cócteles en medio LB
RT472
10
1
10
10
1
1
D.O 472
0,1
0,1
D.O 472
+COCTEL1y2
1ml
0,1
0,01
0,01
0,01
0
100
200
m.o.i. < 1
300
0,001
0
100
200
m.o.i. ≈ 10
300
0
100
200
300
m.o.i. ≥ 100
El umbral de m.o.i. que determina la lisis varía de unas cepas a otras

25. 6. Pruebas de cócteles en medio LB
Fagos cóctel 2 (m.o.i. < 1)
10
10
10
1
1
1
0,1
0,1
0,1
0,01
0,01
0,01
0
50
100
150
200
0
RT1
100
0
200
50
100
150
200
RT12
RT3
10
10
10
1
1
1
0,1
0,1
0,1
0,01
0,01
0,01
0,001
0
100
200
300
0,001
0,001
0
100
200
300
Fagos cóctel 2 (m.o.i. 10)
0
100
200
300

26. 6. Pruebas de cócteles en medio LB
CÓCTEL 1
m.o.i. < 1
CÓCTEL 2
m.o.i. < 1
CÓCTEL1
m.o.i. 100
CÓCTEL 2
m.o.i. ≥ 10
10
10
1
1
0,1
0,1
0,01
0
50
100
150
0,01
MG1655
200
0
10
10
10
1
1
0,1
0,1
150
200
1
0,1
100
10
1
50
0,1
0,01
0,01
0
100
200
300
0,01
0,01
0
100
200
300
RT381
0
50
100
150
200
0
100
200
300

27. 6. Pruebas de cócteles en leche
CÓCTEL DE 3 FAGOS
m.o.i. ≈ 10

28. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto
Evolución de los recuentos de E. coli (RT1) a m.o.i. 10 y 30

29. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto
Desarrollo de un sistema informático de análisis
cuantitativo de los “ojos” o “burbujas”

30. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto
Evolución de los “ojos” en quesos a m.o.i. 10 y 30

31. 7. Pruebas del cóctel 5 en planta piloto
1D
4D
Control
m.o.i. 10
Control
m.o.i. 30
m.o.i. 10
m.o.i. 30
28D
7D
Control
m.o.i. 10
m.o.i. 30
Control
m.o.i. 10
m.o.i. 30

32. 8. Pruebas del cóctel 5 en queserías

33. 8. Pruebas del cóctel 5 en queserías

34. 8. Pruebas del cóctel 5 en queserías
8
7
6
Leche
Queso 24h
5
4
3
Control
Ec
Ec+Fago
Evolución del número de bacterias E. coli (RT144) por mL

35. 9. Pruebas de cóctel en ganadería estabulada
Finca La Orden - Valdesequera

36. En progreso:
• Ensayos en ganadería estabulada
• Altas presiones: eliminación de fagos en el queso
Otras acciones del grupo:
• Análisis de la infección de bacterias autóctonas por los fagos
autóctonos
• Búsqueda y caracterización de fagos frente a Klebsiella oxytoca,
Enterobacter cloacae y Citrobacter braaki
• Selección de fagos para un cóctel de amplio espectro
• Nuevo sistema de detección de enterobacterias en alimentos
• Evolución de poblaciones bacterianas durante la maduración
• Valoración de la capacidad productora de gas de diferentes
especies bacterianas en los quesos extremeños

37. F. Molina
N. Balas
E. López
E. Ferrera
R. Tabla
A. Gómez
I. Roa
J.E. Rebollo
M.
Pacheco