ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際 講師：白澤 健太（かずさDNA研究所 先端研究部 植物ゲノム・遺伝学研究室 主任研究員） 2015年11月11日「第33回 DDBJing 講習会 in 東京」 ＠国立研究開発法人 科学技術振興機構 東京本部別館 YouTube：https://youtu.be/AL8gkTCLj_w DDBJing 講習会：http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/ddbjing.html

1. ゲノムワイド多型を利用した
遺伝解析の実際
白澤 健太
かずさDNA研究所

2. なぜ、ゲノムワイド多型データが必要か？
• マーカー数：少
• 解像度：低MAS
QTL
GWAS
• マーカー数：多
• 解像度：高GS

3. ゲノムワイド多型データの集め方
• RFLP
– サザンブロット分析
• RAPD, AFLP
– PCR→電気泳動
• SSR (microsatellite)
– PCR→電気泳動
• SNP
– PCR→電気泳動
– qPCR
– チップ
– NGS

4. NGSを利用したゲノムワイド多型分析
• 全ゲノム解読
• トランスクリプトーム
• エキソンキャプチャ
• ターゲットアンプリコン
シークエンス
• Reduced-representationラ
イブラリ
– RAD-Seq
– GBS
– ddRAD-Seq
Davy et al. (2011) Nat Rev Genet 12, 499-510

5. WGS
RAD-Seq
Digestion
Adapter ligation
PCR amplification
Sequencing
RAD-Seq in Kazusa
100PE 250PE

6. RAD-Seqワークフロー
1日目 2日目 3日目 4日目 5日目
9:00 PCR・精製 シークエンス シークエンス
10:00 情報処理
11:00 サイズ
セレクション12:00
13:00 サンプリング 精製・定量
14:00 DNA抽出
15:00 シークエンス
16:00 制限酵素
処理
アダプター
付加17:00 SNPリスト
DNA調整からSNPリストまで最短で5日

7. 情報処理
FastQ
Bowtie2
SAM
BAM
BCF
VCF
Filtering
CNV-seq
CNVs
SNPs Indels
SAMtools
BCFtools
VCFtools
SAMtools
ファイ
ル
ソフト
結果
手作業
Reference
FASTX-
toolkit

8. RAD-Seqの成功のポイント
1. 制限酵素選び
2. ゲノム中のSNP密度
3. ゲノム中のSNP分布

9. トマトゲノム中の制限酵素サイト数
制限酵素サイト数
0
50,000
100,000
150,000
200,000
250,000
300,000
350,000
400,000
450,000
500,000
SalI PstI EcoRI HindIII MspI
Numberofrestrictionsites
制限酵素断片数（300-900
bp）
0
10,000
20,000
30,000
40,000
50,000
60,000
70,000
80,000
SalI - PstI PstI -
EcoRI
EcoRI -
HindIII
PstI -
MspI
Numberofrestrictionfragments

10. RAD-SNP数と制限酵素断片数との関係
SalI - PstI
PstI - EcoRI
EcoRI - HindIII
PstI - MspI
y = 0.281x - 2129.8
R² = 0.995
0
2,000
4,000
6,000
8,000
10,000
12,000
14,000
16,000
18,000
20,000
0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000
#RAD-SNPs
No. of fragments (300-900 bp)

11. RAD-SNPのゲノム中の位置
0%
20%
40%
60%
80%
100%
WGS SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRi - HindIII PstI - MspI
Intergenic SNPs Genic SNPs

12. 6品種における全ゲノムSNP数
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
SNPs/10kb

13. RAD-SNP数と全ゲノムSNP数との関係
Regina
Micro-Tom
M82
Moneymaker
San Marzano
Ailsa Craig
y = 0.0237x - 1849.3
R² = 0.7304
0
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
30,000
0 200,000 400,000 600,000 800,000 1,000,000 1,200,000
#RAD-SNPs
#Genome-wide SNPs

14. F2集団からデータを取る
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Numberofeads(k)
F2 lines
ゲノムの0.6%を15xの厚みでカバーする
データが得られた。

15. RMF2-01 RMF2-02 RMF2-96
Micro-TomRegina x
↓
F1
…
Index-01 Index-02 Index-96…
MiSeq
Fastq-01 Fastq-02 Fastq-96…
BAM-01 BAM-02 BAM-96…
F2-VCF
Filtered VCF
Imputed VCF
Index-REG Index-MT
Fastq-REG Fastq-MT
BAM-REG BAM-MT
P-VCF
Filtered VCF
Excluding identical loci
解析の流れ
F2 lines
Seq. library
Sequencing
Seq. data
Mapping
SNP calling
Filtering
Imputing
Applications
Cleaning

16. 欠失データの補間
補間前 補間後

17. 連鎖地図と物理地図の比較
1.2 M SNPs (WGS) vs 1.3 K SNPs (RAD-Seq)

18. まとめ
• RAD-Seqの成功のポイント
– 制限酵素選び
– ゲノム中のSNP密度
– ゲノム中のSNP分布
• RAD-Seq・GBSの次にあるもの
• 情報解析のことをよく知る（逆も然り）
– 自分でできなくて良い
– できても良い
– 計算機でできること・できないことを知る
– お互いの理解を深める