Affettività e rischio psicopatologico delle disabilità intellettive
Functional characterization of the common c.-32-13T>G mutation of GAA gene
1. Functional characterization of the
common c.-32-13T>G mutation of
GAA gene: identification of
potential therapeutic agents.
Dardis et al., Nucleic Acid Research; 2013
2. La maggior parte dei pazienti LO presenta la mutazione di splicing c.-
32-13TG. (circa il 90 % dei pazienti presentano la mutazione in un
allele).
Recentemente, sono state utilizzate numerose strategie per valutare
approcci terapeutici in grado di correggere/aumentare lo splicing
normale di trascritti che presentano mutazioni che colpiscono lo
splicing dell’mRNA.
Esempi: AONs (clinical trials).
Piccole molecole che aumentano l’espressione o l’attività
dei fattori di splicing
Questi approcci sono mutazione specifici e dipendono del
meccanismo mediante il quale la mutazione altera lo splicing normale.
3. Obbiettivi
Caratterizzazione funzionale della mutazione c.-32-
13TG del gene GAA
Valutare in vitro strategie mirate a correggere/aumentare
lo splicing normale dei trascritti mutati.
4. exon 1
5’ss(c1) GAA 3’ss(c2)
-13TG Tcttccccaag/ga
exon 2 (578 bp)
exon 3
gcg/gtaaca
35 bp
cgggtgaga
tcttctcccgcaggc….
60 bp
….acggtgggc catctcttctagat
g
Relative norrmal spliced
mRNA expression(% of C)
RT-qPCR
1 2 3
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
Control P1 P2
SV2
SV3
c2
SV1
SV3’
c2
6. A
-13u gccucccugcugagcccgcuuucuucucccgcagGCCUGUAugugugug
-13g gccucccugcugagcccgcuugcuucucccgcagGCCUGUAugugugug
BP ug-tail
-13 3‘ss
-13g -13u Beads
U2AF65
TDP-43
(yncuray)
B C MW -13g -13u Beads
kDa
83
58
47.5
32.5
P. red Western
12. exon 1
In sintesi
5’ss(c1) 3’ss(c2)
exon 2 (578 bp)
exon 3
gcg/gtaaca
35 bp
cgggtgaga
tcttctcccgcaggc….
60 bp
….acggtgggc catctcttctagat
-13TG
Tcttccccaag/ga
U2AF
65
SRSF4 Isoforma normale di splicing
Resv. SAHA Isoforma normale di splicing
Espressione della proteina GAA
Attività enzimatica GAA
“in vitro proof of principle” per l’utilizzo di piccole molecole al fine di
correggere lo splicing degli alleli che presentano la mutazione c.-32-
13TG
13. Ringraziamenti
ICGEB
Emanuele Buratti
Cristiana Stuani
Francisco Baralle
Regional Coordinator Centre
for Rare Diseases
Stefania Zampieri
Irene Zanin
Annalisa Pianta
Milena Romanello
Bruno Bembi