Aplicación de la edición de genomas en los cultivos del CIAT
1. Serie de Simposios de DuPont Plant Sciences
Octubre 17 y 18
Centro Internacional de Agricultura Tropical-CIAT
Palmira-Valle, Colombia
2. Generar cambios/mutaciones permanentes y heredables en un sitio específico
del ADN. Estos cambios son mediados por los sistemas de reparación del ADN
de la maquinaria celular, que posibilitan la inserción, deleción o alteración de
las secuencias.
Aplicaciones
• Función génica: Knock-out
• Reemplazo de alelos, inserciones, Knock-in.
• Regulación de la expresión génica y epigenética
• Gene Drive
¿Qué significa editar un genoma?
https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/genomeediting
3. KO: Polyphenol oxidase (PPO) - Oxidación
KO: granule bound starch synthase GBSSI – Almidón
tipo ceroso (Waxy)
KO: Genes FAD2: Menos ácidos grasos poliinsaturados,
+ acumulación de aceite.
KI: TALENs, inserción alelo en el gen POLLED
4. Prueba de concepto en arroz, var. IR64
122 130 150
Diseño CRISPR
Transformación IR-64
Evaluación plantas editadas
Flor masculina en plantas editadas
IR64WT Fenotipo : Drooping leaf
IR64WT
5. Eliminación del gen de selección nptII en plantas transgénicas sobreexpresando el gen OsNas.
Deficiencia global de Hierro y Zinc
Fuente: PSD online database(USDA) and FAOSTAT population database (FAO)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Fe Zn
IRON AND ZINC CONCENTRATIONS IN RICE
[] initial Conventional Plant breeding Required Transgenic
ug/g
Concentraciones de Hierro y Zinc en arroz
6. Transformar embriones inmaduros de líneas transgénicas OsNAS
Regenerar plantas
Evaluación molecular
Confirmar deleción
Delete 2.3 kb using CRISPR/Cas9
Eliminación del gen de selección nptII en plantas transgénicas sobreexpresando el gen OsNas.
7. Pérdidas 25-75% en producción
Foto por: Michael Gomez Selvaraj. CIAT Phenotyping Platform
Validación del gen AGO4 en la resistencia al Virus de la
Hoja Blanca en Arroz .
Morales y Jennings. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources 2010 5, No. 043
10. Fenotipo TDF1
TDF1-P2 90 % del polen es estéril. Para P4, P5, P1 100% del polen es estéril
TDF1-P2 TDF1-P4 TDF1-P1 TDF1-P5 IR64
1kB p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 p11 p12 p13 p14 p15 p16 p17 p18 p19 p20 IR64 H20
11. Zhou et al. Nucleic Acids Research, 2014, Vol. 42 IR64 Editada única copia
Inducción de mutaciones en los promotores de los genes de
susceptibilidad a Xanthomonas (SWEET11, 13, 14)
12. Callo Embriogénico Friable de la
línea CP2-Cl10. Todos los callos
presentan tinción azul depués de
30 min en buffer de tinción GUS a
37oC.
GUSPlusTM NosT 35S hptII
RB LB
CP2 NosT
cleavage site
ATGGCTACTACTAAGCATTTGGCTCTTGCCATCCTTGTCCTCCTTAGCATTGGTATGACCACCAGTGCAAGAACCCTCCTAGATCTGAGGGTAAATTT
CTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTA
TGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAGAACCGACGAACTAGTCTGTA
CCCGATCAACACCGAGACCCGTGGC…
CEF de la línea CP2-Cl10
editada con CRISPR/Cas9.
Ensayo de GUS muestra callo
blancos.
Target site (yellow); PAM site (green); restriction site (triangle)
CRISPR/Cas9 diseñado para editar GUSPlusTM CRISPR/Cas9 diseñado para phytoene desaturase (PDS)
pdsKO wt
Prueba concepto en Yuca
14. • Al menos tres homólogos para ALS en Yuca.
Target region 1 Target region 2
csr1-1 (Pro197→Ser) csr1-2 (Ser653→Asn)
Resistencia a herbicidas en Yuca
15. Desarrollo de cassava “WAXY” Methodology
Diseño CRISPRs
Transformación genética de cassava
Producción de callo
embriogénico friable (CEF),
desarrolado en CIAT, disponible
para su transformación
(60444). (Estado actual)
Contenido de amilosa
wt waxy
Prueba Iodo
Editar el gen GBSSI para obtener almidón libre de
amilosa
16. • Tiempo de desarrollo de líneas endogámicas (12-15 años)
• Alta heterozigosidad.
• Difícil sincronización de floración.
• Intentos infructuosos de producir DH a partir de cultivos de anteras y
micro esporas.
Obstáculos en el
mejoramiento
convencional
Edición en Maíz
Inducir mutación en el gen
ortólogo ZmPLA1 en yuca
para generar haploídia
Obtención de líneas inductoras
haploides en el maíz, generando
una sola inserción en el gen
ZmPLA1 Diploide Haploide
Análisis de similitud
para la selección de
genes candidatos.
Diseño sgRNAs
Liu et al. 2017
Inducción de haploidía en yuca
17. Transformación genética de P. vulgaris
1 Kb E14.1.1 E14.1.2 E 8.4 pCambia ICA H2O
Amplificación gen GUS
1 Kb E14.1.1 E14.1.2 E 8.4 pCambia ICA H2O
Amplificación gen marcador hptII
18. Prueba concepto con CRISPR/CAS9
FRIJOL
Diseño CRISPR
(PDS)
Metodología
Transformación Frijol
Evaluación molecular
Amplificación región CAS9
gRNA PDS Cas9 HPT
Spe
E6.1.1 E.6.1.2 E.6.1.3 E6.1.4 E.6.1.5 E.6.1.6 Calima PLASMI H2O
FRIJOL
Diseño CRISPR
Metodología
Transformación Frijol
Obtención de plantas
Edición Proteínas antinutritivas
Pruebas moleculares
Identificación de Rafinosa y Estaquiosa en frijol
20. Perspectivas
Diseño y Transformación con CRISPRs para:
- Aumento del número de granos/panícula
- Reducción en la absorción de Cd & As
Inez et al. Enriching rice with Zn and Fe while minimizing Cd risk. Frontiers in Plant Science. 2015 Chen et al.Arsenic transport in rice and biological solutions to reduce arsenic risk from rice. Frontiers in Plant Science. 2017
21. Perspectivas
Obtención de plantas editadas a partir de protoplastos
Fotos & Figs : Tiew TWY et al, Frontiers in Plant Science 6, August 2015.
https://www.mirusbio.com/applications/genome-editing-using-crispr-cas/rnp-delivery
CIAT
Ribonucleo-Proteína
Planta Editada/Mutada
No-ADN
No transgenes
No selección
PEG
22. Detección de acidos nucleicos mediante CRISPR-Cas13a/C2c2
Perspectivas
J. S. Gootenberg et al., Science 10.1126/science.aam9321 (2017).
SHERLOK(Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unlocking)
Hinweis der Redaktion
Generar un cambio planeado. Permanente, y se hereda, en un sitio específico del ADN, mediado por los sistemas de reparación del ADN de la maquinaria celular.
Knock-out: Silenciar un gen. Impedir que una proteína se exprese. Estable en el tiempo.
La endogamia se refiere al cruzamiento entre individuos de una misma raza dentro de una población aislada, tanto geográfica, como genéticamente.
La haploidía es un estado de la célula en el cual su núcleo no tiene dotación cromosómica doble, es decir, tiene sólo un juego de cromosomas. E
Recently,ithasbeendemonstratedthatthe OsNRAMP5 gene in riceactsasamajortransporterofCdandMnintheroots (Ishikawaetal.,2012; Sasaki etal.,2012). Expressionanalysis showedthatitspresencewasrestrictedtoroots,aswellasintis- sues aroundthexylem(Ishimaruetal.,2012; Sasaki etal.,2012). Inaddition,extensiveanalysisofsilencing,insertionknock-out plants, andion-beamirradiationmutantsconfirmedtherole of OsNRAMP5 in reducingtheCdaccumulationbothinstraw and ingrainstonegligiblelevels,evenwhengrowninCd- contaminatedpaddyfields(Ishikawaetal.,2012; Ishimaruetal., 2012; Sasaki etal.,2012). Usingadifferentapproach,hydro- ponic andsoilcultureexperimentssuggestedroot-to-shootCd translocationviathexylemasthemajorphysiologicalprocess for determininggrainCdaccumulationinrice(Uraguchietal., 2009). AnalysisofmappingpopulationsforidentificationofQTLs relatedtoCdaccumulationinricegrainsindicatedthepres- enceofageneticlocusinchromosome7
otras proteínas Cas que son capaces de cortar moléculas de ARN (en lugar de ADN), dirigidas también por guías de ARN. Es el caso de la proteina Cas inicialmente denominada C2c2(hoy renombrada como Cas13a), que fue descrita hace menos de un año por el propio equipo de Feng Zhang, en colaboración con otros investigadores. La proteína Cas13a es por lo tanto una endonucleasa de ARN dirigida por ARN. En su momento ya se pensó que la Cas13a podría dar mucho juego, sobre todo en aplicaciones de análisis de la expresión génica, al ir dirigida su actividad hacia ARN y no hacia ADN.
Muy pronto Feng Zhang y sus colaboradores se dieron cuenta de una actividad colateral, inesperada, de corte inespecífico de cualquier ARN, que aparecía asociada a la proteína Cas13a tras activarse, es decir, tras acomplejarse con la guía de ARN y tras encontrar su molécula de ARN complementaria. En otras palabras, cuando la proteina Cas13a unida a una guía de ARN determinada encuentra su secuencia de ARN complementaria, no solo empieza a cortar esta secuencia sino cualquier otra secuencia de ARN que encuentre, de forma inespecífica. Esto es, sin duda, un problema importante y una limitación para el posible uso de Cas13a en edición genética. Sin embargo, ha resultado ser una oportunidad sorprendente para convertir el sistema Cas13a en un procedimiento diagnóstico, denominado SHERLOCK, gracias a la imaginación de los investigadores del BROAD. Mezclando en el tubo de ensayo las muestras a analizar con pequeñas moléculas de ARN asociadas a compuestos fluorescentes inactivos, que solamente empiezan a brillar cuando se corta el ARN, han conseguido ligar la identificación de secuencias específicas de ARN a una señal fluorescente, fácilmente detectable. Si en la muestra problema existen secuencias de ARN complementarias a la guía de ARN de la proteína Cas13a esta empezará a cortar todos los ARN de la mezcla, incluidos los que desatarán una señal fluorescente tras ser degradados. Esta es una técnica sorprendentemente sencilla, y poderosa.
a especificidad de la tecnología SHERLOCK reside en la propia proteína Cas13a, capaz de discriminar entre dos secuencias de ARN que se diferencien solamente en un nucleótido, en una letra. Cas13a solamente se activa si la guía de ARN encuentra exactamente su secuencia complementaria. Para aumentar la sensibilidad del proceso los investigadores someten a la muestra inicial a una serie de amplificaciones y transformaciones de ADN a ARN, usando la enzima T7 RNA polimerasa, la cual funciona a temperatura corporal, es decir, a +37 grados (simplemente manteniendo la muestra entre nuestros dedos), sin necesidad de requerir equipos termocicladores como los que se usan habitualmente en las técnicas de detección por PCR. Esto es una ventaja obvia si se piensa convertir esta tecnología en kits de detección de patógenos virales en territorios en los que difícilmente puede encontrarse una máquina de PCR, como algunas zonas de África, por ejemplo. Los investigadores del BROAD demuestran el uso de SHERLOCK detectando la presencia del virus Zika o del Dengue (o ADN de células tumorales) a partir de muestras de sangre de pacientes, con una sensibilidad atto-molar, es decir, de 10exp(-18), capaces de detectar una molécula de ARN viral entre un trillón (un millón de billones) de moléculas de ARN. Un artículo de Stat compara esta sensibilidad a la de ser capaz de detectar agua salada tras disolver una pizca de sal en el Lago Superior de EEUU, el mayor de los grandes lagos de agua dulce en NorteAmérica, con un volumen de 12,000 Km3 de agua (doce mil billones de litros de agua).