Seminario de Técnicas de Biología Molecular. UBA

1. Seminario Genética Técnicas de Biología Molecular

2. 1º Extracción de ADN Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano: Sangre, Saliva, Semen, hisopado vaginal, restos de fluidos en ropa, orina, piel, bulbo piloso, muestras biospsias de órganos/tejidos, material cadavérico (ej huesos), etc Se separa el ADN de otras fases orgánicas celulares:

5. Las técnicas pueden ser Directas o Indirectas Fragmento de ADN El sector azul representa una secuencia conocida dentro fragmento de ADN El sector azul es una secuencia conocida que esta ligada/asociada a la presencia del sector que quiero buscar y desconozco su secuencia especifica (en verde) Detección ADN Directa Indirecta

7. SOUTHERN BLOT Edwin Southern desarrolló esta técnica en 1975

10. Para poder realizar Hibridación en una muestra de ADN se necesitan realizar los siguientes pasos

13. Sacado de los bocetos de Edwin Southern antes de la publicación de la técnica

16. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Kerry Mullis en 1983 desarrolló esta técnica

19. 1. Desnaturalización: 94°C - 96°C 2. Alineación: temperatura variable 3. Extensión: 68 - 72°C PCR: la reacción se divide en 3 pasos LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE REPETIRSE VARIAS VECES

20. Necesitamos en este proceso controlar la temperatura: termociclador Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Extensión de la cadena 75 ºC Primer Ciclo Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias Desnaturalización 95°C Hibridización 50-60 ºC 2 do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC

27. El siguiente es el resultado en un gel de agarosa En la calle (1) se sembró el marcador de peso molecular En la calle (2) se sembró una muestra conocida para una mutación homocigota En la calle (3) se sembró la muestra del paciente

28. El siguiente es el resultado en un gel de agarosa En la calle (C1) muestra conocida homocigota gen mutado En la calle (C2) muestra conocida homocigota gen normal ¿Qué resultados dieron las muestras 1, 2, 3, 4?

30. Los iones de magnesio estimulan a la enzima Taq Polimerasa para que incorpore los dNTP´s. Algunas aclaraciones… Sol. amortiguadora PCR: 􀁺 Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe 􀁺 Sales Proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima, influyen temperatura desnaturalización y de hibridación Taq Mg

33. Secuenciación: Método enzimático 1977: Frederick Sanger desarrolló esta técnica Método de los terminadores de cadena o dideoxi

35. En la polimerización del ADN H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3 ’ 5’ 2’ 1’ 4’ Jerárquico OH del carbono 3

36. Secuenciación: utiliza deoxinucleotidos y dideoxinucleotidos H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ deoxinucleotido monofosfato

37. Cuando se incorpora un dideoxinucleótido se interrumpe la polimerización H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato

41. ► Alternativa del método Sanger ► Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reacción ► Los productos se detectan durante electroforelectroforésis al pasar por un láser que excita los fluorocromos y se detecta fluorescencia emitida ► Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas Se coloca el cebador marcado, polimerasa , dNTP y ddNTP ► Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en único tubo SECUENCIACION AUTOMATICA empleando método enzimático

44. + Big Hairy Computer … . . Placa caliente Pol. líquido A TT G C A Laser Prisma Detectores - Ventana Reacción Secuencia Capilar

45. ¿Cómo se ve el resultado?

46. En el electroferograma se observa dos picos en la posición 152 (G / A)