1. Molecular Biology
Students: Ana María Ortiz Gil
Estefanía Lopera Velosa
III semester UPB

2. • The recurrent miscarriage is a condition where a woman has had a
frequently expontaneous loss of 3 or more pregnancies before the 20th
gestational week.
•It has been associated to multicausal
factors such as genetic, uterine,
thrombotic and/or autoinmune system.
•None of these factors are highly
related and they might be found on
patients with normal reproductive
activity. (1)

3. 1. Genetic factors: -Aneuploidy
-Parental anormalities
Factors related to Recurrent Miscarriage
2. Uterine abnormalities:
-Structure: Mullerian agenesis
Uterus didelphys
Bicornuate Uterus
3. Thrombotic factors: -Thrombophilias:
Factor V Leiden and Deficience of APC
4. Autoinmune system factors: Auto-antibodies:
laminin-1(4) and GalNAcβ. Antiphospholipid
antibodies (2)
5. Environment/ Habits factors:
Cigarrete(3), alcohol, cafein

4. • The antigens are substances which activate antibodies and generate
an immune response in the human body, due to it recognizes it as a
foreign. They can be exogenous (chemicals) and endogenous (viral
toxins and bacteria).
• An Autoantigen is an own body’s molecule that result of a
breakdown of tolerance mechanisms. It is recognized as
foreign and induces the appearance of an immune
response. (4)
Functions:
-Induces antibodies activation
-Implied on autoinmune disseases

5. During pregnancy, mother is exposed to fetal’s antigens (50% paternal and
50% maternal MCH codominal) but in normal cases these forgein antigens
do not activate antibodies or inmune response due to this molecules:
• T regulator Lymphocytes
• HLA-G
• CD95L
They increase tolerance and low the inmune response to avoid the reject of the
fetus.(5)

6. • There are IgG’s (antibodies) at chorionic tissue. Autoantigens
generate immune response, which produces a cascade of LT defense
molecules that destroy the antigen besides the tissue where it is, in this
case at the chorionic tissue.
Blood is the main transport vehicle of these molecules which cause lysis /
cell apoptosis. So, due to the mother's blood content is mixed with the
fetus's blood, it passes these molecules helping to destroy its blood cells
and tissues, reducing the oxygen contribution and eventually causing the
death of the fetus.

8. Purificación
Auto
Antígenos
Western
Blot
Auto
Anticuerpos
+
Sefarosa
Muestra de
Pacientes
RESULTADOS
SDS PAGE
Purificación
Auto
anticuerpos
MALDI-TOF

9. Muestra de
Pacientes
•Tejido coriónico 8 pacientes 21-33 años
(antecedente RM)
•Almacenaje -70°C
•Plasma sanguíneo 3 pacientes 27-29-33 años
(Sin antecedentes RM/ >2 partos) [CONTROL]

10. Purificación
Auto
anticuerpos
•Las muestras recogidas fueron lavadas con
PBS
•Mezcladas en TBS + Inhibidores de proteasas
•Incubación 4°C 30 minutos
•Centrifugación
•Sobrenadante lavado con TBS y puesto en
columna con Proteína G Sefarosa
•Los anticuerpos fueron separados de la columna con GlyHCL-Buffer y
neutralizados Tris-HCL
•Se preparó matriz de afinidad. Control: IgG purificada a partir de suero
sanguíneo de 3 mujeres sanas (Cromatografía Proteína G+Sefarosa)

11. SDS PAGE
•Método electroforésis para separar y analizar proteínas
• Desnaturalización proteínas, pierden su conformación
.
•Divisiones diferencia peso, tamaño y forma
• Gel de apilamiento: Aumenta [ ] proteínas
•Gel de resolución: Proteínas se separen según tamaño
•Tris: Buffer extracción
•Glicina: Arrastra cargas iónicas
•Acrilamida: Polimerización
•SDS: Detergente desnaturaliza proteínas
• Bromofenol: Azul, marcador avance
•Glicerol: Mezcla quede depositada
•Coomasie: Azul, colorante de proteínas
•Butanol: Disolución recubrimiento gel
•Mercaptoetanol: Rompe enlace di sulfuro proteína

12. SDS PAGE
.
•Anticuerpos ---> SDS PAGE
•Para detectar autoanticuerpos en los extractos obtenidos
estos se lavaron con PBS 3 veces durante 5 min y se
compararon con anticuerpos
secundarios unidos a horserabish peroxidase
•Incubación de la membrana
•Lavado de membrana con PBS
•Western Blot---> Visualizar proteínas

13. Western
Blot
Generalidades
•Técnica para detectar proteínas específicas en una
muestra determinada ej: extracto tisular
• Mediante electroforesis en gel se separan las proteínas
atendiendo al criterio que se desee: peso molecular,
estructura, hidrofobicidad, etc.
• Luego son transferidas a una membrana adsorbente
(nitrocelulosa +) para poder buscar la proteína de interés
con anticuerpos específicos para ella.
•Finalmente se detecta la unión antígeno-anticuerpo por
actividad enzimática, fluorescencia.
• De esta forma se puede estudiar la presencia de la
proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa
respecto a otras proteínas.

14. Western
Blot
Pasos
1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1. Se toma la muestra de un tejido ó cultivo celular y se le
agrega un buffer de extracción (Tris)
2. Homogenización (Correcta mezcla)
3. Centrifugación (obtener proteínas)
4. Adición de detergente/ inhibidor proteasas

15. Western
Blot
Pasos
2. ELECTROFORESIS EN GEL
Se realiza generalmente con SDS PAGE para extraer
proteínas por tamaños
3. TRANSFERENCIA
Las proteínas son llevadas desde el gel de poliacrilamida, a
una membrana de nitrocelulosa ó de PVDF por difusión ó
electrotransferencia
•DIFUSIÓN SIMPLE
Se ponen en contacto las superficies del gel poliacrilamida y de la
membrana y en el medio papel filtro + Buffer, el cual ascenderá
por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las
proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán retenidas en ella.

16. Western
Blot
•ELECTROTRANSFERENCIA

17. Western
Blot
Pasos
4. BLOQUEO
1. Se incuba la membrana con una solución de proteínas:
ASB, leche en polvo y una diminuta fracción de
detergente: Tritón X 100
2. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos
lugares de unión de la membrana que no estén
ocupados por las transferidas desde el gel.
De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno
específico reduciendo así los falsos positivos

18. Pasos
5. DETECCIÓN
Western
Blot
Se comprueba la presencia en la membrana de una
determinada proteína.
Se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a una
enzima que catalice una reacción colorimétrica.
Al colorearse se hace patente la unión con el antígeno, la
proteína y su localización.
•Anticuerpo unido a una enzima
Anticuerpo secundario + enzimas (sustrato soluble->insoluble).
De esta forma queda una mancha allí donde esté la proteína de
interés.
EJ: peroxidasa de rábano (HRP) HRP-->Luminol

19. 6. ANÁLISIS
Pasos
Western
Blot -Detección Colorimétrica: La cuantificación proteica se
evalúa por densitometría (cuan intensa es la mancha) o
por espectrometría
-Detección Quimioluminiscente: Se adiciona un reactivo
quimioluminiscente a la membrana,

20. Western
Blot
FUNDAMENTO
En la electroforésis PAGE se utiliza SDS que es una molécula
con carga negativa acoplada covalentemente con las
proteínas. Al desnaturalizarlas, hace que las proteínas queden
con carga negativa.
.
Después de la introducción de la proteína al gel poliacrilamida y la
aplicación de un campo eléctrico desde la parte superior a la inferior
del gel, las proteínas son repelidas por el polo negativo (cátodo) y
migran hacia el polo positivo (ánodo). Posteriormente las proteínas se
dividen en bandas. Las proteínas más pequeñas son las que migran
más lejos a través del gel y las de mayor tamaño se quedan en la
parte superior.

21. Western
Blot
.
FUNDAMENTO
Para identificar la proteína de interés en la mezcla, se
utilizan anticuerpos para que reaccionen con dichas
proteínas.
Debido a que los anticuerpos son proteínas grandes no
pueden atravesar el gel con facilidad. Por ello entonces se
transfiere el gel sobre una membrana de nitrocelulosa que
tiene carga positiva, así esta atrapa a las proteínas,
quedándose en su superficie.

22. Western
Blot
FUNDAMENTO
Esto se logra mediante la aplicación de otro campo eléctrico
que dirige las proteínas en modo horizontal.
La transferencia se puede demostrar con anticuerpos dirigidos
contra la proteína de interés.
La unión del anticuerpo se detecta empleando anticuerpos
secundarios y Anti Ig con peroxidasa de rábano, la cual genera
una peroxidación del Luminol, formando aminoftalato que es
el compuesto que al producirse emite luz. (6)
.

23. •Proteínas de los blot incubadas a 4°C con
autoanticuerpos biotinilados.
•Las IgG obtenidas del tejido coriónico y las IgG
obtenidas del suero sanguíneo se inmovilizaron
sobre la HC-Sefarosa 4B de acuerdo con el
fabricante de protocolo.
Auto
Anticuerpos
+
Sefarosa

24. Es el nombre comercial para la agarosa, un
polímero extraído de algas marinas.
•Separaciones cromatográficas de biomoléculas
• Inmovilizar enzimas, anticuerpos y péptidos a
través de unión covalente a la resina.
Sefarosa

25. • Las proteínas coriónicas se sometieron a cromatografía de
afinidad junto con la columna de sefarosa + autoanticuerpos
•Los extractos proteicos se incubaron junto con 1mL
autoanticuerpos a 24°C 1 hora ----> TBS
•Los anticuerpos con sefarosa fueron lavados con TBS
Purificación
Auto
Antígenos
Control: proteínas extraídas + IgG aislada (suero) + Sefarosa ->Cromatografía
•Proteínas se separaron de la columna con GlyHCL-Buffer y separadas por SDS-PAGE
•Proteínas fueron teñidas con G250
•Bandas de proteínas apropiadas se sacaron del gel para identificarlas MALDI-TOF

26. MALDI-TOF
GENERALIDADES
Técnica de ionización -> espectrometría de masas.
Se denomina MALDI por sus siglas en inglés Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización láser
asistida por matriz) y TOF por el detector de iones que se
acopla al MALDI y cuyo nombre procede también de sus siglas
en inglés Time-Of-Flight.
• Análisis de biomoléculas y moléculas orgánicas grandes que
tienden a hacerse frágiles y fragmentarse cuando son ionizadas
por métodos más convencionales.

27. MALDI- TOF
•Las bandas individuales de proteínas (PAGE) fueron
extraídas y tratadas por digestión en gel con tripsina.
• Extracción de los péptidos generados
•Se analizaron utilizando un 4,800 MALDI-TOF/ TOF,
espectrómetro de masas.

28. RESULTADOS
Esquema de purificación
de los autoantígenos
potenciales en pacientes
con aborto recurrente

29. • En las columnas 1, 2 y 3, las
proteínas coriónicas fueron
teñidas con Ponco C.
• En las columnas 1’, 2’ y 3’ se
muestra el análisis tras
haber sido lavado y tratado
con anticuerpos IgG
conjugados con HRP.

30. La prueba de Western
Blot reveló la presencia
de cadenas pesadas y
ligeras de IgGs en las
muestras de tejido
coriónico.

31. En las columnas 1 y 2 las
proteínas del tejido
coriónico son delimitadas
por los anticuerpos
previamente eluídos de las
muestras.
Los igG de pacientes sanos
junto con los anticuerpos
conjugados a HRP solo
delimitan péptidos en el
rango de 67 kDa.

32. Los igG tomados del suero
de mujeres con aborto
recurrente delimitaron
proteínas coriónicas
aisladas
En la columna 2 se
aplicaron igG del suero de
pacientes sanas

33. • Los cinco péptidos analizados fueron posteriormente
reconocidos mediante el MALDI-TOF como:
alfa-glicosidasa
neutra
(107 kDa)
Endoplasmina
(92 kDa)
ATPasa del retículo
endoplásmico
transicional
(89 kDa)
Proteínas putativas
de tipo
endoplasmina
(46 kDa)
Actina citoplásmica 2
(42 kDa)

34. DISCUSSION
Spontaneous
pregnancy loss has
been defined as 3
consecutive pregnancy
losses prior to 20 weeks
from the last menstrual
period.
Baek KH et
al., 2007

35. Among 5 novel potential
auto-antigens that we found
to be associated with the
RM, there is a neutral alpha-glucosidase
AB. This enzyme
[EC 3.2.1.84] is encoded in
humans by the GANAB gene.
Martiniuk F
et al.

36. Another detected auto-antigen
is a transitional
endoplasmic reticulum
ATPase [EC 3.6.4.6], also
known as valosin-containing
protein (VCP); it is an
enzyme that is encoded in
humans by the VCP gene
Pleasure
IT et al.

37. Endoplasmin is an
abundant molecular
chaperone resident in the
endoplasmic reticulum,
and it plays a critical role in
protein folding in the
secretory pathway of Toll-like
receptors and
integrins.
Maki RG
et al

38. CONCLUSIONS
Gel electrophoresis is definitely the leading tool for
scientists to perform most of their molecular tests.
This, due to its utility on selecting different proteins
to be either clasified or quantified in a study.
Through this investigation it is possible to talk about
5 potential antigens that respond to determined IgGs
present in blood serum of patients with RM.

39. Even if this study allows an approach to find the
molecular mechanism of RM; more investigation in
this field is needed to finally get to the cause and
start working on a treatment for the condition.
The main objective of the investigation was
accomplished since the experiments held yield the
expected results: the identification of 5 novel
potential autoantigens present on patients with RM.

40. WEBGRAFÍA
• https://www.rheumatology.org/Practice/Clinical/Patients/Dis
eases_And_Conditions/Antiphospholipid_Syndrome_(Espa%C
3%B1ol)/
• http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/ne
urobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm

41. • 1) Carrel, D. Peterson, M. Reproductive Endocrinology and infertility:
integrating modern clinical and infertility. Springler editorial. New York, USA.
2010. pp: 283-288
• 2) Habermann, T. Mayo clinic Internal medicine review. 7Th ed. Mayo clinic
Editorial. Minnesota, USA. 2006-2007. pp: 957
• 3) Lerner, H. Miscarriage: why it happens and how best to reduce your risks.
Perseus editorial. Cambridge, UK. 2003. pp: 142
• 4) Clínica Universidad de Navarra. Taken from web Site: http://www.cun.es/
• 5) Vásquez, S. Bouchan, P. Mecanismos de tolerancia inmunológica en el
embarazo. Revista de Perinatología y Reproducción Humana. Marzo 2011.
Volumen 25-1. pp: 39-45
• 6) Delves, P. Seamus, M. Inmunología: fundamentos. 11 Ed. Editorial
Panamericana. Madrid, España. 2006. pp: 137-147