Навчальний курс: «Молекулярна онкологія, патологія та генетика» Медична лабораторія CSD спільно з Center for research and education of translational biology and medicine (www.tbm.center ) запускає безкоштовний курс навчальних лекцій для усіх бажаючих. Анастасія Фітьо - біолог відділу імуногістохімії, напрямку FISH дослідження

1. Основи методу FISH, досвід
використання в лабораторії
CSD
Біолог
Фітьо Анастасія
Київ – 2021

2. FISH - Fluorescence in situ Hybridization
Гібридизація in situ – базовий метод молекулярно-цитогенетичних досліджень.
● дозволяє виявити специфічну послідовність нуклеїнової кислоти (ДНК чи РНК) в клітині.
● Принцип методу полягає у комплементарному зв’язуванні нуклеотидного зонду (проби) із
послідовністю ДНК чи РНК досліджуваного зразка.
Гібридизація in situ
Формування гібридів (ДНК-ДНК,
ДНК-РНК, РНК-РНК)
В умовах фіксованого
субстрату,
в клітині
ДНК зразка
Зонд

3. Класифікація зондів
● Зонд (проба) – це коротка нуклеотидна послідовність (оптимально 50-300 пар основ),
комплементарна досліджуваній послідовності нуклеїнової кислоти.
За місцем приєднання:
a) локусспецифічні (LSI - Locus Specific Identifier)
b) центромерні (CEP)
c) теломерні
d) до всієї хромосоми (WCP - Whole chromosome
painting)
За будовою:
a) дволанцюгові ДНК-зонди,
b) одноланцюгові антисенс-РНК-зонди (рибопроби),
c) одноланцюгові ДНК-зонди,
d) синтетичні олігодезоксинуклеотидні зонди та
олігорибозонди

4. За способом мічення:
Зонди
З радіоактивною
міткою
З нерадіоактивною
міткою
P32, S35, H3 Біотин
Дигоксигенін
(DIG)
Флуорохром
мітки
fluorescein
rhodamine
coumarin
Texas Red
SpectrumOrange
SpectrumGreen

5. Види гібридизації in situ
ISH
Радіоактивний
(авторадіографія)
BRISH
Bright field in situ hybridization
(світлова мікроскопія)
СISH
Chromogenic in situ
hybridization
SISH
Silver in situ
hybridization
інші
FISH
Fluorescent in situ hybridization
(флуоресцентна мікроскопія)
Rainbow-FISH
Raman-FISH
ReD-FISH
Reverse-FISH
RING-FISH
RNA-FISH
RxFISH
Split-Signal
FISH
T-FISH
3-D FISH
Zoo-FISH
ACM-FISH
armFISH
CARD-FISH
catFISH
CB-FISH
CO-FISH
COBRA-FISH
COD-FISH
COMBO-FISH
Comet-FISH
Cryo-FISH
D-FISH
DBD-FISH
e-FISH
Fiber-FISH
Flow-FISH
Fusion-Signal FISH
Halo-FISH
Harlequin-FISH
Immuno-FISH
LNA-FISH
M-FISH
Multilocus or ML-FISH
PCC-FISH
PNA-FISH
Q-FISH
QD-FISH

6. Принцип та основні етапи методу FISH/CISH
(на прикладі гістологічного матеріалу)
Парафіновий блок
з фіксованою у
формаліні
тканиною
Виготовлення
зрізів
товщиною
2-3 μm
Депарафінізація у
ксилолі
Дегідратація у серії спиртів в порядку
зменшення їх концентрації
Ферментативний протеоліз
(найчастіше з використанням
пепсину)
Додавання міченої
проби
Денатурація (82 °С, 5 хв) Гібридизація
37 °С (18 год)
Постгібридизаційна
відмивка
Детекція
Пряма (проба, мічена
флуорохромом, FISH метод)
Непряма (проба, мічена біотином або
дигоксигеніном, СISH метод)
Контрфарбування з
4’,6-діаміно-2-
феніліндолом (DAPI)

7. Принцип методу
CISH
HRP – Horseradish peroxidase (пероксидаза хрону)
DAB – Diaminobenzidine – субстрат для HRP
EBV (CISH)

8. ● Проводиться за допомогою флуоресцентного
мікроскопа.
● Аналіз і підрахунок клітин відбуваєтсья при великому
збільшенні (10х100) з використанням імерсійної олії для
флуоресцентного мікроскопа (Type FF)
Інтерпретація результатів FISH
DAPI
Green/orange фільтр

9. a) Single color probe
b) Dual color probe
c) Multi color probe
d) Dual color Break apart probe
e) Dual color Fusion probe
Dual Color Probe
Multi color probe
Dual color Fusion probe Dual Color Break Apart Probe
Опис (карта) проби

10. Практичне застосування FISH (CISH) в медицині
● Виявлення вірусних геномів (EBV, HPV)
● Виявлення генетичних порушень на метафазних
хромосомах або в інтерфазних ядрах клітин (хромосомні
аберації, транслокації, делеції, ампліфікації тощо)
● Диференційна діагностика в онкології
● Визначення чутливості до таргетних препаратів в онкології
● Визначення груп ризику в онкології
● Пренатальна діагностика

11. Приклади застосування методу FISH в лабораторії CSD
• В 1960 г Peter Nowell та David Hungerford описали специфічну
хромосому, яку назвали філадельфійською.
• Філадельфійська хромосома (Ph.) – це результат
реципрокної транслокації* між ділянками довгого плеча 22
(ділянка 22q11.23, ген BCR) та 9 (ділянка 9q34.12, ген
ABL1) хромосоми.
• У 90% пацієнтів з хронічним мієлолейкозом і 25% з гострим
лімфобластним лейкозом наявна транслокація
• BCR/ABL t (9; 22) (q34.1; q11.2).
*Реципрокна транслокація - обмін ділянками між двома негомологічними хромосомами
Визначення «Філадельфійської хромосоми»
(BCR/ABL, t (9; 22) (q34.1; q11.2))

12. BCR/ABL -
(2R2G)
BCR/ABL +
(2F1R1G)
BCR/ABL +
(1F1R1G)
Матеріал: кров або аспірат кісткового мозку
Підрахунок мінімум 100 клітин
Cut off – 2 %
Проба: Dual color Fusion probe
Визначення філадельфійської хромосоми
BCR/ABL

13. Визначення чутливості до таргетних препаратів
Дослідження ампліфікації гена Her2/neu
(рак молочної залози, рак шлунка, колоректальний рак)
• Ген ERBB2 (Her2/neu) розташований на довгому
плечі 17 хромосоми (17q12)
• Ген ERBB2 кодує білок 185-190 кДа (Her2/neu), що є
рецептором з тирозинкіназною активністю та бере
участь в регуляції клітинного росту.
• Білок Her2/neu є мішенню для таргетних препаратів,
що інгібують дію цього білка та блокують
проліферацію (ріст) пухлинних клітин.
• Для визначення ефективності дії такого препарату
необхідно провести дослідження ампліфікації
(збільшення кількості копій) гена Her2/neu.

14. Базовий алгоритм проведення дослідження *
Оцінка ступеня
експресії Her2/neu
(метод ІГХ)
Her2/neu (0/+1)
негативний
Her2/neu (3+)
позитивний
Her2/neu (2+)
сумнівний
Ампліфікація
гена HER2/neu
(FISH)
*ASCO–CAP HER2 Test Guideline Recommendations (2018)

15. Матеріал: гістологічний (FFPE tissue), парафінові зрізи
Підрахунок мінімум 20 клітин інвазивного компоненту пухлини
Проба: Dual color probe
Дослідження
ампліфікації гена
HER2/neu (FISH)
Базовий алгоритм проведення дослідження *
HER2/CEN17 >2,
HER2 >6
позитивний
HER2/CEP17 <2,
HER2 = 4-6
пограничний
HER2/CEN17 <2,
HER2 <4
негативний
*ASCO–CAP HER2 Test Guideline Recommendations (2018)

16. ● Ген ALK (Anaplastic lymphoma kinase) розташований на
короткому плечі 2 хромосоми
● Ген ALK кодує трансмембранний білок з
тирозинкіназною активністю, який є мішенню для дії
таргетних препаратів, інгібіторів ALK.
● Транслокація гену ALK спостерігається у 5-7% пацієнтів
з недрібноклітинним раком легень (НДРЛ)
Визначення чутливості до таргетних препаратів
Виявлення транслокації гена ALK
(Аденокарцинома легень)

17. Матеріал: гістологічний матеріал (FFPE tissue), цитологічний
матеріал
Підрахунок мінімум 50 пухлинних клітин
Проба: Dual color probe (break apart)
Рекомендації щодо інтерпретації *
*The IASLC Atlas of ALK and ROS1 Testing in Lung Cancer

18. Визначення груп ризику
Матеріал: кров або аспірат кісткового мозку на EDTA
Підрахунок мінімум 100 клітин
Cut off – 10 %
Проба: Dual color probe
Виявлення делеції 17p13.1 (TP53)
• Ген TP53 розташований на короткому плечі 17
хромосоми (17p13.1)
• Ген TP53 кодує білок 53 кДа (р53), що є
транскрипційним фактором та бере участь в
регуляції клітинної проліферації,
диференціації та апоптозу. Є супресором
пухлинного росту.
• Делеція 17p13.1 (TP53) зустрічається при
багатьох онкогематологічних захворюваннях
(ХЛЛ, МДС, множинна мієлома та ін.) і
зазвичай асоціюється з несприятливим
прогнозом (група високого ризику)

19. Отже,
● FISH є важливим методом молекулярно-цитогенетичних
досліджень, який дозволяє виявити різні генетичні
порушення (транслокації, делеції, ампліфікації тощо)
● Є важливим допоміжним інструментом в
1. діагностиці онкологічних захворювань та підтверджені
діагнозу
2. підборі тактики лікування
3. прогнозі перебігу захворювання

20. Дякую за увагу!