Caracterização de lectninas vegetais do bioma da caatinga

1. MESTRANDO:
ALDO LUIS BORGES XAVIER
ORIENTADOR:
PROF. DR. WAGNER FÉLIX PEREIRA
Titulo:
IDENTIFICAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LECTINAS PRESENTES
EM ESPÉCIES DE CURCUBITACEAS NATIVAS DO BIOMA CAATINGA.

2.  Identificar e Caracterizar lectinas em espécies
cucurbitáceas do gênero Apodonthera.
2
TEMA

3.  Quais dentre as espécies de cucurbitáceas pré-
selecionadas contém quantidade de lectinas
significante e quais métodos podem ser empregados
para isola-las?
3
Pergunta:

4.  De acordo com a literatura e pesquisas em outras espécies de
cucurbitáceas é comum a presença da proteína lectina.
Levando-se em consideração os presentes estudos, espera-se
obter êxito nas espécies do gênero Apodonthera e obter
quantidade significante de lectinas.
4
Hipótese

5.  Identificar, isolar, purificar e caracterizar
parcialmente lectinas de espécies de cucurbitáceas
nativas do bioma caatinga do gênero Apodanthera.
5
Objetivo Geral

6. 1. Determinação da concentração de proteínas pelo método de
BRADFORD;
2. Purificação da lectina por Cromatografia de Afinidade e
determinar a concentração da proteína por espectrometria;
3. Determinação da pureza da proteína por Eletroforese em Gel
de Poliacrilamida (SDS-PAGE);
6
Objetivo Específicos

7. 4. Determinação da massa molecular por Espectrometria de
Massa (SM);
5. Determinar a atividade hemaglutinante;
6. Determinar a inibição da atividade hemaglutinante por
açúcares;
7
Objetivo Específicos

8. 7. Determinar o efeitos: do calor, do pH e do EDTA e de cátions
divalentes sobre a atividade hemaglutinante;
8. Determinação de concentração inibitória mínima (CIM) contra
microrganismos patógenos;
9. Avaliação de presença de glicídios constituintes.
8
Objetivo Específicos

9. Métodos e Técnicas
9

10. PPRNSA 10
Para iniciar a purificação,
inicialmente é necessário extrair
a proteína de interesse para um
meio líquido, exceto se ela já
estiver naturalmente presente em
um meio líquido.
Material Vegetal
Glicina 0,1 M
pH 2,6
Homogeinização
Extração com
Tampões
Acetato de
sódio 0,1M pH
5,0
Fosfato de sódio
0,1M pH 6,55
Borato de sódio
0,1M pH 10,0
Tris-HCl 0,1M
pH 7,8
Filtração/
Centrifugação
Testes
Hemaglutinante
Precipitação (Sulfato
de Amônio, 90%)
Centrifugação
(10.000xg)
Solubilizado em Tris-
HCl 50mM pH 7,8
Fração 0/90%
(F0/90).
Etapa de Purificação

11. 11
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
Os métodos geralmente mais utilizados são:
• Biureto;
• Lowry;
• “Coomassie brilliant blue” BG-250 ou
reagente de Bradford;
• BCA ou reagente de Smith.
• Ultravioleta absorção a 280 nm
Método de Bradford:
• Determinação de proteínas totais
• proteínas que contém aminoácidos
de cadeias laterais básicas ou
aromáticas;
• Absorve fortemente em 595 nm.
• como padrão a albumina sérica
bovina (BSA).

12. 12
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Fração 0/90% (F0/90).
Cromatografia de
Afinidade
Coluna de galactomanana de
Adenanthera pavonina L. reticulada
com epicloridrina e equilibrada com
Tris- HCl 50mM pH 7,8
PICO I PICO II
Medida da Concentração
Espectrofotômetro 280 nm
Fração Não
Retida
Eluição
Fração Retida
Dializar com água e Liofiliza
Purificação da Lectina
ELETROFORESE EM GEL DE
POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
ESPECTROMETRIA DE MASSA

13. 13
Determinação da Pureza da Proteína
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
Proteína Liofilizada
Tampão Padrão +
fervura
Gel com malha 15%
com Marcador
Molecular

14. 14
 Verificar sua pureza;
 Determinar sua massa molecular.
ESPECTROMETRIA DE MASSA
Lectina
Diluição: Água + ácido
Fórmico 0,1 %
Alíquota: Reduzida com
Ditiotreitol + Iodoacetamida
Espectrofotometria

15. 15
Determinação Da Atividade Hemaglutinante
Lectina
• Serão empregadas amostras de eritrócitos;
• Diluições seriadas em tubos de ensaio
segundo;
• Expresso em unidade de hemaglutinação
(UH.mL-1)

16. Titer = 32 HA units/ml
1:8
1:2 1:21:21:21:2
8 16 32 64 128 256
Lectina
Diluição Seriada
Mistura com celulas
vermelhas do
sangue
Vista lateral
Vista superior
 Unidade HA : quantidade minima de lectina capaz de provocar
completa aglutinação da celulas vermelhas do sangue.

17. 17
 A ausência de aglutinação é indicador de uma reação positiva;
INIBIÇÃO DA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE POR AÇÚCARES
1:8
1:2 1:21:21:21:2
8 16 32 64 128 256
Açúcares
Diluição Seriada
Mistura com
eritrócitos
Vista lateral
Vista
superior
A especificidade de ligação
da lectina a carboidrato será
determinada pelo ensaio de
inibição utilizando as
seguintes soluções de
açúcares (concentração
inicial de 500 mM):
D-galactose, D-lactose,
D-manose, D-glucose,
D-frutose, D-sacarose,
D-lactulose, D-trealose e
D-maltose.
(+) (+) (+) (-) (-) (-)

18.  Incubação da lectina em banho-maria por 30 min no intervalo de 20 °C
a 100 °C, com incremento de 10 ºC;
 Após incubação, as amostras são resfriadas em banho de gelo e
usadas para ensaios de hemaglutinação.
18
EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE

19.  Será incubando 100 μL da lectina obtida (1,0 mg.mL-1) com 100 μL dos
seguintes tampões:
 Acetato de sódio 100 mM (pH 5,0), citrato de sódio 100 mM (pH 6,5),
fosfato de sódio 100 mM (pH 7,5), Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) e borato de
sódio 100 mM (pH 10,0) por 30 min a 37 ºC.
 Em seguida adiciona-se a mesma quantidade de suspensão de
eritrócitos 2%(v/v), incuba-se novamente e os resultados são
observados macroscopicamente.
19
EFEITO DO PH NA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE

20.  A dependência de cátions divalentes (Ca2+ e Mn2+) para a
atividade hemaglutinante da lectina deverá ser determinada
pelo método da dupla diluição seriada usando EDTA como
agente quelante, conforme PAJIC et al. (2002).
20
EFEITO DO EDTA E DE CÁTIONS DIVALENTES SOBRE A
ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE

21.  A presença de carboidratos neutros na lectina isolada será
determinada pelo método de Dubois et al. (1956).
 Utiliza-se como padrão solução de D-glucose (1μg.mL-1) e 100 μL
da substância (1mg.mL-1), com leitura em espectrofotômetro.
21
AVALIAÇÃO DE PRESENÇA DE GLICÍDIOS CONSTITUINTES

22.  A CIM será determinada pelo método de microdiluição em caldo de cultura Brain Heart Infusion
(BHI) de acordo com a metodologia descrita pelo CLSI, 2009.
 Culturas microbianas puras mantidas em ágar sob refrigeração, serão repicadas para caldo
infusão (caldo BHI) e incubadas a 37ºC até atingirem fase exponencial de crescimento (4-6h).
 Após esse período, as culturas terão sua densidade celular ajustada em meio BHI estéril, de
modo a se obter uma turbidez equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland
(aproximadamente 1,5 × 108 UFC.mL-1). A suspensão obtida será diluída 100 vezes, em solução
salina 0,15M estéril, seguida de contagem de cultura. Aos poços da microplaca adiciona-se 100
μL de caldo BHI, 50 μL da lectina em diferentes concentrações e por fim, 50 μL da suspensão
microbiana.
 Logo após, as microplacas deverão ser incubadas durante 24h em estufa bacteriológica a 37°C
para posterior inspeção visual do crescimento microbiano e a leitura das absorbâncias em
leitora de Elisa Bio-Tek a 620 nm. A CIM é considerada a menor concentração da substancia
(lectina) capaz de inibir o crescimento das cepas testadas, constatado pela ausência de
turvação visível do crescimento microbiano ou pelas leituras de absorbância quando a amostra
por si só gera turvação quando em contato com o meio.
22
DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
(CIM) CONTRA MICRORGANISMOS PATÓGENOS

23.  Os dados serão analisados utilizando uma análise de uma via de variância
(ANOVA) (General Linear Models).
 Um teste de Tukey será usado para identificar os meios que diferiam quando
a ANOVA indicou significância estatística. Para este teste, os valores de
p<0,05 serão considerados significativos.
23
Estatisticas

24.  Espera-se com a purificação e caracterização desta nova lectina
apresente atividade biológica para uma diversidade de
aplicações, tais como: antibacteriana, anticâncer, anti-
inflamatório e da biotecnologia e ao seu posterior uso como
drogas para doenças.
PPRNSA 24
Resultados Esperados