O documento discute esporos sexuais em fungos, como ascósporos e basidiósporos. Explica que a análise da disposição ordenada dos ascósporos em Sordaria permite determinar a distância genética entre um gene e o centrômero.

1. UERGS
Genética de microorganismos
Prof. Dra. Adriana Dantas

2.  Esporos sexuais
 Designações:
 Ascosporos (esporos sexuais dos
ascomicetos)
 Esporos sexuais ordenados ou não-ordenados
 Basidiosporos (basidiomicetos)

3.  Feita com apenas um gene envolvido em
suas duas formas alélicas ou com dois ou
mais genes.
 1 gene – A1 e A2 – possíveis 6 tipos de asco
ou seis disposições de tétrade ordenadas
 Meiose dentro do asco – 8 esporos sexuais
 Quatro células repetidas duas a duas

4.  Seis tipos de tétrades – resulta na
ocorrência ou não de permutação (crossing-
over) entre o gene considerado e o
centrômero
 Analise desta tétrade permite a
determinação da distância entre o gene
estudado e o centrômero do cromossomo
onde esse gene esta localizado

5. Selvagem:
Corpo frutifero de Sordaria
esporos sexuais (Ophistokonta: Fungi:
Ascomycota) cheio de esporos
pigmentados (pretos) :
gene c+
Mutante:
esporos sexuais albinos:
gene c-
Ascosporos de Sordaria (Ophistokonta: Fungi:
Ascomycota) ordenados segundo a orientação das
divisoes celulares da meiose

6.  Ciclo de vida haploide (n=9)
 Fase curta diploide (2n=18)
 Hifas multinucleadas
 Fusão extremidade das hifas
 Celulas binucleadas
 Mitose
 Fertilização - meiose
 Fusão dos pares de nucleo
 Celulas monucleadas
diploides
 Mitose
 4 nucleos n = 8 nucleos n
 Ordem linear
 Origem ascas dentro de corpos
frutíferos - PERITÉCIOS

7. Figura 2. Em Sordaria fimicola a produção de um asco contendo 8 ascósporos haplóides (n) a partir de
uma célula
diplóide (2n) envolve uma divisão meiótica seguida de uma divisão mitótica. A posição relativa dos ascósporos claros
e escuros reflete a ordem das cromátides no núcleo de uma célula em meiose, permitindo a dedução da ocorrência
de permutação entre duas das quatro cromátides (meiose representada à direita), além disso, permite também a

8.  O arranjo reflete diretamente a ordem das
cromátides no núcleo de uma célula diplóide
em processo de meiose
 O processo ordenado permite identificar quais
das quatro cromátides participam da permuta
entre dois marcadores (1 gene e o centrômero)
durante a recombinação intracromossômica
 Possibilita o calculo da distancia relativa entre
o gene e o centrômero

9.  A distancia relativa entre um determinado gene
e o centrômero é feito dividindo-se por dois a
porcentagem de ascos recombinantes
 % ascos recombinantes = frequência de ascos
onde houve permuta entre o gene e o
centrômero
 Frequência de recombinação = ½ da
frequência de quiasmas, uma vez que, 4
produtos de meiose apenas 2 são
recombinantes

10. Numero de ascos recombinantes x 100
Numero total de ascos analisados
Onde, um centimorgans (cM) – 1% de
recombinantes

11. Analise as fotomicrografias recebidas, observe ascos contendo ascósporos no seu
interior, ascósporos estes que se originaram do cruzamento entre uma
linhagem selvagem (ascósporos escuros) e uma mutante (ascósporos claros)
de Sordaria fimicola.
Observe que o arranjo linear de ascósporos claros e escuros difere entre os vários
ascos. Analise somente os ascos íntegros, ou seja, com oito ascósporos.
Determine a distribuição de ascósporos claros e escuros em pelo menos 20
ascos.
Nos ascos, o arranjo do tipo quatro ascósporos escuros e quatro claros (4m+ : 4m)
se forma quando não ocorreu permuta entre o gene marcador e o centrômero.
Quando ocorreu permuta entre o gene marcador e o centrômero, o arranjo dos
ascósporos escuros e claros dentro do asco será do tipo 2:2:2:2 que, por sua
vez, pode se distribuir em diferentes ordenações:
 a) 2 escuros : 2 claros : 2 escuros : 2 claros;
 b) 2 claros : 2 escuros : 2 claros : 2 escuros;
 c) 2 escuros : 4 claros : 2 escuros;
 d) 2 claros : 4 escuros : 2 claros

12. Gene A: alelos A1 e A2 Tipos I e II: 50% do total (25% I e 25% II)
Tipos III e IV: 12,5% de cada
A1
A2 recombinantes
I II III IV V VI
Quatro ascosporos em um asco com ascosporos ordenados

13.  a) para cada par de cromossomos homólogos
duplicados e emparelhados somente duas das
quatro cromátides sofrem permutação e,
portanto, somente metade dos ascósporos
resultante é recombinante, pois a outra metade
é classificada como sendo do tipo parental (não
recombinante);
 b) a unidade de distância relativa, denominada
centimorgan (cM), corresponde a 1% de
recombinantes.

14.  Recombinantes são produzidos sem processo
meiótico ou ciclos sexual
 Ocorre nos deuteromicetos ou fungos
imperfeitos (sem ciclo sexual)
 Fusão de hifas e formação de um heterocarions
que contém núcleos haplóides.
 Apesar de ser raro, o ciclo parassexual é
importante na evolução de alguns fungos.
Anastomose (A), heterocariose (B) e cariogamia (C) presentes no ciclo parassexual em fungos

15.  Consiste na união ocasional de diferentes hifas
monocarióticas (de indivíduos diferentes) originando uma
hifa heterocariótica em que ocorre fusão nuclear e
“crossing-over” mitótico.
 Há a formação de aneuplóides por erros mitóticos e então
o retorno ao estado haplóide por perda cromossômica.
 São formadas hifas homocarióticas recombinantes.
 Processo não muito comum em condições naturais devido
à existência da incompatibilidade somática que impede
que hifas de micélios diferentes se anastomosem ao
acaso,
 Processo é evolutivamente interpretado como um
mecanismo de segurança e preservação do genoma
original.

16.  Obtenção de linhagens diplóides com
mutantes para coloração de colônias
 Duas linhagens haplóides:
 ade, w (requer adenina e conídios brancos)
 paba, bi, y (requer ácido p-aminobenzóico,
biotina e conídios amarelos)
Germinação das linhagens, ocorre anastomose de
hifas (pareamento), e formação do
HETEROCÁRIO (sem adenina, biotina, ac. p-
aminobenzóico)

17.  Os conídios de constituição genética igual a dos
conídios que deram origem ao heterocarion
não podiam germinar e formar colônias
 No entanto, alguma colônias de heterocarions
germinam são diplóides pela fusão de núcleos
haplóides com divisões mitóticas
 Analise no conteúdo de DNA é o dobro do
encontrado na linhagem haplóide e presença
de setores recombinantes nessas colônias,
indicando natureza heterozigótica

18.  Ponto inicial é a heterocariose
 Fusão de núcleos - originam diplóides
heterozigotos
 Produção de recombinantes
 Permutação mitótica e haploidização

19.  Recombinação mitótica foi descrita pela primeira vez por Stern em seu
clássico Drosophila
 Para Stern, a recombinação se refere apenas aos cruzamentos
recíprocos (RCOs) (Figura 1A).
 Método para recuperar os dois produtos de RCOs em Saccharomyces
cerevisiae.
 Método para medir as taxas de espontânea e induziu recombinação mitótica.

20. Figura 1. Crossovers recíproca e conversão gene.
(B)Um RCO é retratado entre cromátides de dois cromossomos homólogos. A segregação padrão resulta em células-filhas
que se tornaram homozigotos para a seqüência de distal para o site de crossover. (B-D) Uma visão de close-up
a região delineada pelo caixa pontilhada, mostrando diferentes configurações do gene conversão detectável marcadores.
(C)n º de conversão, seja porque não houve conversão gene ou o trato era muito pequeno para ser detectado com os
marcadores disponíveis. Todos os marcadores são ainda presente em uma proporção de 2:2.
(D)Um evento de conversão típico gene produz um padrão que altera alguns dos marcadores (b e c) a proporção de 3:1.
Note-se que as caracterisitcas de conversão só pode ser detectada se os dois produtos recíproca (ie, tanto células-filhas)
​
são recuperados e analisados, como feito por Lee et al.
(E) Genes que foram total ou parcialmente 04:00. No exemplo mostrado aqui, marcador de b tem segregado 04:00, mas
marcador c tem segregado 3:1; este é, portanto, uma 04:00 / 03:01 é uma conversão gene híbrido .

21.  Por que a recombinação mitótica, que pode ser prejudicial,
ocorre?
 A maioria RCOs espontânea são iniciadas pelo DNA dupla
vertente-breaks (LAP).
 É provável que vários tipos de lesões de DNA pode ser
importante para eventos de recombinação mitótica
espontânea.
 Além disso, alguns agentes recombinantes (tais como a
radiação ultravioleta) estão pensados para produzir perdas
quando o DNA é replicado é cortado .
 Assim, a questão de porque torna-se amarrado com a
questão de quando.

22.  Em que ponto do ciclo celular que recombinação mitótica ocorre?
 Enquanto que recombinação meiótica ocorre durante a meiose, a recombinação mitótica
mais provavelmente não ocorre durante a mitose, mas durante interfase.
 Análise de conversão do gene tratos associados RCOs fornece pistas sobre quando
durante a interfase mitótica recombinação ocorre. O gene de conversão é uma troca não-
recíproca da informação genética.
 Conversão gene normal entre cromossomos homólogos produz uma proporção de 3:1 de
alelos (Figura 1C);
 No entanto, também detectados 03:01 / 04:00 como genes híbridos (Figura 1D).
 Se tratando de 04:00 mais prováveis quando ocorre uma quebra antes de DNA
replicação,, mas ocorre no reparo, após replicação.
 A replicação de um cromátides quebradas resulta em cromátides irmãs que são
quebradas na mesma posição. Uma vez que ambos estão quebrados, o cromossomo
homólogo deve ser utilizado como um modelo de reparação.
 Se ambos os cromátides quebradas no reparo foram do cromossomo homólogos, um
híbrido 04:00 ou 04:00 / 03:01 é produzido, dependendo ou não ambos os trechos
serem idênticos.
 A alta freqüência de 04:00 e 03:01 / 04:00 sugere que uma fração considerável da
quebras que resulta em RCOs ocorrer antes replicação.

23.  Qual é o mecanismo molecular pelo recombinação mitótica que é
realizado?
O gene RCOs com diferentes comprimentos na conversão gênica pode
ser produzido por diferentes mecanismos.
 Conversão curta pode resultado de uma via de reparo envolvendo
formação heteroduplex seguido por reparo mismatch (mutação).
 A heteroduplex é um região de DNA composto de fios que são
derivadas de dois cromossomos diferentes.
 Polimorfismos entre os dois cromossomos irá resultar em
desencontros, e reparar essas inconsistências podem resultar na
conversão de gene.
 Embora esse mecanismo tenha sido comprovada a ser importante para
conversão do gene meiótica, na qual os genes de conversão são
normalmente 1-2 kb de comprimento, ele pode produzir a longas
conversões (média de 12 kb).

24. 
Existem hotspots de recombinação mitótica como existem para
recombinação meiótica?
 Acredita-se que alguns sitios chamados comum locais frágeis (QCA)
 A maioria dos estudos de QCA têm contado com o uso de inibidores de
replicação para aumentar a freqüência de breaks, seguida de detecção
citológica.
 Os sitios de RCOs, e, portanto, os locais iniciais da espontânea danos,
são distribuídos ao acaso.
 Porém, a existência de uma região com RCOs elevados.
 O fato de que tal poderia hotspot ser detectada pelo exame de apenas
1% do genoma faz com que esta descoberta mais intrigante ainda.
 O que faz certas regiões mais propensas a quebra de mitose e
recombinação de outros?
 Concentrando-se em regiões propensas a danos espontânea, ao
contrário para danos induzidos.

25.  A distancia entre os loci para o corpo amarelo (y) e o centrômero pode
produzir no local twin (manchas chamuscados e amarelo) remendos de
tecido onde as células recombinantes (clones da célula original que
tinha recombinação mitótica) são homozigotos para qualquer y do ou
alelo do sn.

26.  Resulta de uma série de não-disjunções.
 A exemplo de A. nidulans, um diplóide com
2n cromossomos pode produzir núcleos
contendo um cromossomo a menos, fica
instável ate atingir n = 8 cromossomos, que
é um estado haplóide.

27.  Organismo haplóide e desprovida de um ciclo sexual , impedindo a
aplicação de estratégias que use genética clássica para definir genes
essenciais.
 No entanto, tem sido mostrado previamente que o ciclo parassexual, que
depende da química das cepas para a haploidização diplóides artificial ,
pode ser usado para demonstrar a função essencial de genes.
 A. fumigatus heterozigotos diplóide é gerado por substituição ou por gene
alvo por mutagênese insercional aleatório e é submetido a haploidização
com ou sem a pressão seletiva correspondente ao introduziu mutação.
 A ausência de descendentes haplóides sob condições seletiva só é
indicativo da inativação de um gene essencial para o crescimento
 Ao utilizar este abordagem, foi demonstrado que o gene FKS1 de A.
fumigatus, que codifica a 1,3 - D-glucan-sintase, e o gene smcA,
codificação de um membro da SMC (estrutural manutenção do
cromossomo)que são de família de proteínas, são essenciais para o
crescimento A. fumigatus .

28.  A identificação do genoma de genes essenciais, tem sido
desenvolvida in vivo por transposons em um sistema de
mutagênese.
 Transposons são ferramentas moleculares amplamente
utilizado in vitro e / ou in vivo para as bactérias e leveduras,
mas só muito recentemente eles têm sido aplicados nos
fungos filamentosos.
 Elementos transponíveis de classe II da família Tc1, foi
identificado por como transposons fitopatogênicos no fungo
Fusarium oxysporum e tem se mostrado eficiente em espécies
de Fusarium, Aspergillus nidulans e Magnaporthe grisea
 Muito utilizado para gerar um conjunto de diplóides
heterozigotos.

29.  Estratégia para a identificação de
genes essenciais para A.
fumigatus .
 Diploides estáveis heterozigotos para os
marcadores de cor de esporos (w1 r7) é
aleatoriamente mutagenizados com o imp160
elemento transponível:: pyrG
(imp:: pyr).
 Durante haploidização em um meio contendo
benomil,ocorre a erda aleatória de
cromossomos dá origem a duas subpopulações
de cor
haplóide conídios (w1 ou r7): um rolamento do
alelo do transposon inativado (população A) e
um rolamento do alelo selvagem (população B).
 A capacidade de formar progênies haplóides em
um meio não-seletivos e da incapacidade de
fazê-lo em um meio de haploidização seletiva
(sem uridina e uracila) leva à identificação
de cepas mutantes com uma inserção em um
gene essencial.

30.  Triagem
parassexual.
 Haploidização de 10 diplóides pyrG
revertentes NIAD em meio não
seletivos (A) e seletivo (B).
 Segregação aleatória dos
cromossomos é visualizada pela
produção de conídios haplóide de
cores diferentes.
 No caso de integração no
plasmídeo um gene essencial, o
crescimento residual é observada
em meio de haploidização seletiva
(setas).
 Para esses revertentes NIAD pyrG,
esporos haplóides obtidos em meio
de haploidização não seletivos
foram testados para a ausência do
elemento transponível para

32. Ciclo Sexual Ciclo parassexual
1. Fusão nuclear em estruturas 1. Fusão nuclear rara em qualquer
especializadas nas hifas resultando ponto da hifa dando diplóides
zigotos diplóides 2. O diplóide não é efêmero e sofre
2. O zigoto formado é efêmero mitoses dando mais núcleos
persistindo por apenas uma geração diplóides
nuclear 3. Recombinação rara por permuta
3. Meiose com recombinação meiótica mitótica. Ocorre haploidização
no estágio de quatro fios e volta ao 4. Os recombinantes mitóticos, se
estado haplóide utilizados marcadores apropriados,
4. Produtos meióticos (ascósporos) são emergem como setores oriundos de
facilmente reconhecíveis e isolados colônias diplóides