Teknik PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA spesifik secara cepat dan akurat melalui siklus pengulangan proses pemanasan dan pendinginan yang memisahkan dan memperbanyak DNA target. Teknik ini memungkinkan deteksi dan karakterisasi DNA dalam jumlah sedikit untuk berbagai aplikasi medis dan forensik.
6. DEVELOPMENT OF MOLECULAR BIOLOGY
TECHNIQUES
DNA
ISOLATION
PURE DNA
IN-VITRO
MANIPULATION
MOLECULAR BIOLOGY
TECHNIQUES
7. POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)
• Kary Mullis (1984)
• PENGGANDAAN FRAGMEN SPESIFIK DNA
SECARA INVITRO JUTAAN KOPI
FRAGMEN DNA SECARA CEPAT DAN
AKURAT
• Meniru replikasi in vivo
• Teknik amplifikasi DNA spesifik secara in
vitro
8. Prinsip PCR
• PCR: dapat mengamplifikasi urutan DNA spesifik
• Reaksi PCR: mengandung DNA target rantai ganda, dua
primer yang dapat berhibridisasi pada urutan pada
DNA target yang berlawanan, 4 dNTP, dan DNA
polimerase
• Karena, reaksi dipanaskan pada suhu tinggi, PCR
tergantung pada DNA polimerase yang stabil terhadap
panas
• Beberapa DNA polimerasi yang tahan thd panas:
diisolasi dari bakteri termofilik
• Enzim pertama yang digunakan adalah Taq polimerase
(dari Thermus aquaticus)
9. PCR terdiri dari 3 tahap:
Denaturasi: campuran reaksi dipanaskan sampai
95oC (15-30 detik) untuk mendenaturasikan DNA
target menjadi rantai tunggal
Penempelan primer: campuran didinginkan
dengan cepat sampai suhu tertentu yang
memungkinkan dua primer mengikat pada
rantai tunggal DNA target
Suhu penempelan ini ditentukan dengan hati-hati
untuk menjamin primer hanya mengikat pada
urutan DNA yang diinginkan. Satu primer
mengikat pada masing-masing rantai.
10.
11. Elongasi: suhu campuran dinaikkan menjadi 72oC
dan dipertahankan yang memungkinkan DNA
polimerasi mengelongasi primer dengan
mengkopi DNA target rantai tunggal
Pada akhir inkubasi, DNA target rantai
tunggal menjadi rantai ganda.
Tiga tahap siklus PCR diulangi. Pada siklus kedua,
empat rantai DNA mengalami denaturasi,
kemudian primer mengikat dan diperluas. Tidak
ada reaktan lain yang perlu ditambahkan.
Tiga tahap ini diulangi lebih dari sekali untuk
siklus ketiga
12. Thermocycler otomatis sekarang ini telah
digunakan untuk mensklus reaksi tanpa interfensi
manual
Setelah 20 siklus, DNA target (asli) telah
diamplifikasi berjuta kali lipat dan ini akan
meningkat 1000 juta setelah 30 siklus
Semuanya ini memmerlukan waktu kurang dari
satu jam.
13. Aplikasi PCR
• PCR dapat mengamplifikasi molekul DNA
tunggal dari campuran kompleks,
menghindari penggunaan kloning DNA
dalam sel untuk mendapatkan molekul DNA
murni yang diinginkan.
• Penentuan urutan basa DNA dapat
disederhanakan dengan PCR, dan aplikasi
ini sekarang sangat umum.
• Dengan menggunakan primer yang sesuai,
melalui PCR dapat dibuat mutasi titik, insersi
dan/atau delesi DNA target yang dapat
membantu analisis ekspresi dan fungsi gen.
14. • PCR sangat sensitif dan dapat mengamplifikasi DNA dalam
jumlah yang sedikit. Dengan menggunakan primer yang
sesuai, DNA bakteri atau virus dalam jumlah sedikit dapat
dideteksi dalam jaringan. Hal ini menyebabkan PCR tidak
terlalu mahal untuk diagnosa medis.
• PCR cukup murah untuk mengkarakterisasi sampel DNA
secara medis. Misalnya, dalam penentuan penyakit genetik
manusia. Pada penentuan penyakit genetik, PCR didasarkan
pada analisis daerah microsatellites dalam DNA.
Microsatellites ini merupakan urutan di, tri dan tetranukleotida
berulang dalam DNA, yaitu jenis (CA)n atau (CCA)n di mana n
adalah bilangan dari 10 sampai 30. Microsatellites dapat
digunakan sebagai penanda, seperti pada RFLP.
• Karena sensitivitasnya, PCR sangat penting dalam forensik.
PCR mengamplifikasi DNA dari rambut manusia atau tetesan
darah yang tertinggal pada tindakan kriminal untuk
membuktikan tersangkanya.
17. Step 1 : Denaturation
(separation of double-stranded DNA) by Heat (95° C)
Step 2 : Primer Anneals (50 - 65° C)
step 3
Primer Extension by Taq Polymerase (72° C)
End of the 1st PCR Cycle
Results in 2 Copies of Target Sequence
22. • End-Point Detection
Detection of PCR product at the end of the PCR
program
Gel Based – electrophoresis (agarose or
polyacrylamide gel electrophoresis)
Real-Time Detection
Detection during the PCR program
Detection of PCR Product
23. Gel Electrophoresis
Agarose gel
Pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran
Makin kecil ukuran migrasi makin cepat
1-2% + ethidium bromide
Visualized using UV transilluminator
28. Jika DNA terdenaturasi
(ssDNA), SYBR Green
tidak berfluoerescensi
SYBR Green®
SYBR Green® dye
berfluorescensi jika terikat
dengan dsDNA ada amplicon
Makin banyak terjadi
amplifikasi makin banyak
amplicon makin banyak
SYBR Green terikat dengan
dsDNA intensitas
fluorescensi makin tinggi
40. The Birth of the Southern Blot, 1975
"Gels used for electrophoresis of nucleic acids and proteins are permeable
This obvious fact didn't dawn on me until I tried to dissolve some agarose
by floating it on a solution of sodium perchlorate and noticed a bead
of liquid form on the top. I reasoned that if DNA molecules were carried
through with the flow it would be possible to capture them on
a nitrocellulose membrane, using the setup shown in the sketch.
The big thrill came when, at the first attempt, I saw genes lit up as
bands after hybridizing with radiolabeled probes.
The Journal of Molecular Biology [initially] rejected the
first manuscript1 as a 'methods paper' and the sketch is
what I sent to people who had heard of the method and
wanted to get on and use it.“
-- Ed Southern, Oxford University
41. DNA is transferred ("blotted") to filter paper
Filter is exposed to a DNA probe
Probe - single-stranded DNA, base-complementary
to gene of interest
Binds specifically to target DNA immobilized on filter
Radioactively labeled with 32P / 35S-dNTPs
exposes X-ray film
Autoradiogram shows presence / absence & size
of cloned DNA
RFLP differences
[click here for an animation of southern blotting]
DNA probe binds to RNA: "Northern Blot" Is a particular gene
(DNA) expressed as mRNA in a particular tissue?
[Antibody probe binds to protein: "Western Blot"]