Chemistry

1. PROTOCOL
WESTERN BLOT
Geluri
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 ml)
Tris base 6.06 g
diH2O ~60 ml
Adjust to pH 6.87 with 6N HCl
diH2O to 100 ml
Store at 40
C
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (150 ml)
Tris base (18.15 g/100 ml) 27.23 g
diH2O 80 ml
Adjust to pH 8.8 with 6 N HCl
diH2O to 150 ml
Store at 4ºC
10% (w/v) SDS (100 ml)
SDS 10.00 g
diH2O 90 ml
Dissolve with gentle stirring diH2O to 100
ml
10% (w/v) APS (fresh daily)
Ammonium persulfate 0.10 g
diH2O 1 ml
Acrylamide/Bis (30% T, 2.67% C) (AAB)
Acrylamide (29.2 g/100 ml) 87.60 g
N'N'-bis-methylene-acrylamide 2.40 g
diH2O to 300 ml
Filter and store at 4ºC in the dark (30 days).
Separating gel şi Stacking gel se lucrează în
paralel şi se introduc astfel: întâi Separating
gel până la aproximativ 1 cm de vârful
pieptănului şi apoi Stacking gel până sus. Se
introduce pieptănul imediat după
introducerea gelurilor.
Separating gel (10%) 25 ml
dH2O 12 ml
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 6,25 ml
10% SDS 0,25 ml
30% AAB 6,5 ml
_______________
10% APS 250 µl
TEMED 25 µl
Obs: TEMED se adaugă ultimul şi se toarnă
imediat în suport să nu apuce să se
solidifice.
Stacking gel (4%) 10 ml
dH2O 5,3 ml / 6,62 ml/ 5,7 ml
0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 2,5 ml
10% SDS 100 µl
30% AAB 1900 µl / 750 µl (putem ajusta
cantitatea în funcţie de proteinele căutate,
NU E BINE SĂ FIE FOARTE
CONCENTRAT)
_________________
10% APS 100 µl
TEMED 10 µl
GELUL SE POATE LĂSA ÎN SUPORT
PESTE NOAPTE LA FRIGIDER ÎN
PUNGĂ DE PLASTIC ŞI MEDIU
UMED!!!!!
Se încarcă probele pe gel în funcţie de
concentraţia de proteine din probă
determinată cu metoda Bradford
Trasarea curbei standard
60 µl BSA 1,42 mg/ml + 540 µl H2O = 600
µl soluţie BSA de lucru
Nr
BSA
(µg/ml)
µl
soluţie
BSA
H2O
dist
(µl)
Reactiv
Bradford
(µl)
1 1 7 793 200
2 5 35,2 764,8 200
3 10 70,4 729,6 200
4 15 105,6 694,4 200
5 20 140,8 659,2 200
1

2. 6 25 176 624 200
Se lasă la temperatura camerei 5 minute
şi se citesc extincţiile la λ= 595 nm
(prebele sunt stabile o oră)
Referinţa: 800 µl H2O dist + 200 µl reactiv
Bradford
Blanc: 2400 µl H2O dist + 600 µl reactiv
Bradford
Se setează ABS 0 şi se citesc extincţiile faţă
de blanc
- Se fac încercări cu 5 µl probă de
încărcat cu 795 µl apă distilată şi 200 µl
reactiv Bradford pentru a vedea unde se
încadrează extincţia obţinută pe dreapta
trasată cu datele din tabel (pe abscisă
avem concentraţiile de BSA şi pe
ordonată avem extincţiile citite la
aparat). Ar trebui să obţinem o
concentraţie care să se încadreze în zona
de mijloc, dacă nu cresc cantitatea de
probă la 10 µl şi ajustez cantităţile de
apă şi reactiv de lucru astfel încât să
avem în final 1000 µl.
10 x Running Buffer (soluţia care se pune
în tancul de electroforeză)
Tris base (15 g/l) 75 g
Glicină (72 g/l) 360 g
SDS (5 g/l)……………25 g
Ad H2O până la 5l
NU UITA SĂ FACI DILUŢIA LA 1x
CÂND SE PUNE SOLUŢIA ÎN
TANC!!!!!!!!!!
Se toarnă soluţia în tanc până acoperă
în întregime tot ansamblul. Se setează sursa
la SET pentru Power suply la început la 100
V (restul de parametrii: 30 mA şi 3 sau 4 W
se setează automat dacă dau Run). Se creşte
voltajul la 150 V în momentul în care începe
să migreze.
Se inchide sursa intre cele 2 etape
(migrare si transfer)
Se iau din tankul de migrare
gelurile,se aseaza pe placa de transfer
( rosie) intre cate 2 bucati de hartie de filtru
–decupata pe marimea gelului - pentru
fiecare gel si o membrana de nitroceluloza (
culoare alba- nu albastra). Hartia si
membrana fiind umezite in prealabil in
buffer de transfer. Astfel nu mai este
necesara umezirea dupa ce se aseaza pe
placa de transfer in ordinea :
- Hartie de filtru X 2
- Membrana – marcata cu numarul probei
pe partea activa
- Gelul de transfer
- Hartie de filtru X 2
Se inlatura bulele de aer cu trafaletul.
Se pune capacul negru, dupa ce se sterge
putin excesul de apa.
Se porneste surse in parametrii : 380-400
mA, ceilalti parametrii se ajusteaza in
functie de acesta si le lasa la transfer 1,5
ore.
Se opreste surse, se scot membranele, se
arunca gelul si hartia.
Se spala membrana direct in TBS si apoi in
TBST intr-un recipient de marime mica.
Se prepara solutia de blocare : 100 ml
TBST + 5 mg BSA si se lasa la temp
camerei timp de 1-2 ore, maxim 18 h la 4 C.
Apoi se spala membrana cu TBST de 2-3
ori si se pune intr-un recipient cu 5-6 ml
ANTICORP PRIMAR ( 1:200) si se la over
night la 4C sau 4 ore la temperatura
camerei.
Se spala in TBST de 2-3 ori apoi se pun
2