Anticuerpos antinucleares

INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

INMUNOFLUORESCENCIA
MONTES HIJAR EFRAIN

Microscopía de fluorescencia

La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve
a través de un filtro excitador que sólo permite que pase la
radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta
radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada
por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas
fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por
fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor.
Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a
través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de
barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia
de la radiación de excitación.

Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no llegue al
ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.
Filtros:Excitador: Transparente a λ cortas bloqueando λ más largas. Barrera: Transparente a
λ largas bloqueando λ cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.

Inmunofluorescencia

Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este
conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de
microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva
y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de
inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que
cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia

Clínica (Diagnósticos)
Utilidades
Investigación (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia)

Conjugación: Tendremos Ac marcado con fluoróforo y fluoróforo libre.
¿Cómo separamos?

Mediante tamiz molecular o diálisis

Imunofluorescência
• Baseia-se na capacidade das moléculas de
anticorpo se ligarem covalentemente a
fluocromos, mantendo a especificidade
contra o antígeno.
• Reagentes Utilizados:
– Anticorpos Marcados (Fluocromos –
Isotiocianato de Fluoresceína* )
– Glicerina Alcalina
– Corantes (Azul de Evans)

Imunofluoresência direta
• A reação Ag-Ac é detectada pela emissão
de fluorescência
• Pesquisa de antígeno
• • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado
a substância fluorescente (conjugado)*
• microscópio de fluorescência

IFI – Imunofluorescência
A- pesquisa de antígeno INDIRETA
• • amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *
• • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• • microscópio de fluorescência
• • * lavagens
B- pesquisa de anticorpos
• • Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *
• • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• • microscópio
• • determinação do título e classe do Ac

1. INTRODUCCION

LOS RESULTADOS DE ALGUNOS EXAMENES UTILIZADOS EN EL
ESTUDIO DE LAS ENFEMEDADES REUMATOLOGICAS:

 PUEDEN CONFIRMAR O NEGAR LA IMPRESION DIAGNOSTICA.

 PUEDEN SER DE UTILIDAD EN EL SEGUIMIENTO DE LOS PACIENTES.

 PUEDEN DETERMINAR EL PRONOSTICO DE LA ENFERMEDAD.

1. INTRODUCCION

EXAMENES IMPORTANTES EN REUMATOLOGIA:

 REACTANTES DE FASE AGUDA
 AUTOANTICUERPOS
 COMPLEMENTO
 LIQUIDO SINOVIAL
 ANTIESTREPTOLISINAS
 ACIDO URICO.

1. INTRODUCCION

AUTOANTICUERPOS

• LAS ENFERMEDADES REUMATOLOGICAS AUTOINMUNES SE
CARACTERIZAN POR PRODUCCION ABUNDANTE DE Ab´s

• LOS PRINCIPALES SON:
– LOS FACTORES REUMATOIDES (FR)
– EL ANTIPEPTIDO CITRULIANO CICLICO (anti-CCP)
– LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)
– LOS ANTICUERPOS ANTICITOPLASMA DEL NEUTROFILO (ANCA)
– LOS ANTICUERPOS ANTIFOSFOLIPIDOS.

2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
( ANA )

2. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ( ANA )

• CELULAS LE: HARGRAVES, RICHMON Y MORTON (1948)

• ESTE HALLASGO DE AYUDA VALIOSA EN EL Dx DE LES, SIRVIO
DE ESTIMULO EN LA INVESTIGACION DE LOS AUTO Ab`s
CONTRA ANTIGENOS NUCLEARES Y CITOPLASMATICOS.

• POR CARENCIA DE SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR
PREDICTIVO, Y POR LAS DIFICULTADES TECNICAS, ESTE
PROCEDIMIENTO FUE REEMPLAZADO POR LA DETERMINACION
DE LOS Ab´s ANTINUCLEARES.


• SI BIEN, A LA FAMILIA DE LOS AUTO Ab´s SE LA CONOCE COMO
LA DE LOS Ab´s ANTINUCLEARES, SE SABE QUE ALGUNOS
ANTIGENOS LOCALIZADOS POR FUERA DEL NUCLEO TAMBIÉN
SON IMPORTANTES EN LA AUTOINMUNIDAD…

• … REALMENTE SON Ab´s DIRIGIDOS CONTRA Ag´s INTRA CEL´s.

• PARA DETECTARLOS:
 IFI
 UNA GRAN VARIEDAD DE SUSTRATOS:
• INICIALMENTE TEJIDOS DE RATON (RIÑON, HIGADO).
• ACTUALMENTE LAS CELULAS Hep-2.


CELULAS Hep-2

• SON CELULAS DE LINEAS EPITELIALES HUMANAS DEIVADAS DE
UN CARCINOMA LARINGEO.

• CONTINEN EL NUCLEO Y LOS NUCLEOLOS DE GRAN TAMAÑO LO
QUE PERMITE IDENTIFICAR UN AMPLIO RANGO DE ANTIGENOS
NUCLEARES Y CITOPLASMATICOS.

• CON EL EMPLEO DE LAS CEL´s Hep-2-2000, SE PUEDE DETECTAR
FACILMENTE EL anti-Ro, ADEMAS DE OTROS Ag´s CLASICOS.


• LA LECTURA SE INICIA CON DILUCIONES DE 1:40.

• UN TITULO > 1:640 + MANIFESTACIONES CLINICAS, SUGIERE
ENFERMEDAD AUTOINMUNE, PRINCIPALMENTE LES, Y SE DEBE
COMPLETAR EL ESTUDIO CON LA IDENTIFICACION DE LOS Ab´s
ESPECIFICOS.

• NO OBSTANTE, SU SOLA PRESENCIA NO ES Dx DE ENFERMEDAD.
SIGNIFICA QUE EXISTE UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA QUE
AMERITA EL SEGUIMIENTO ADECUADO DEL PACIENTE.

• UN TITULO < 1:80 + POCOS SINTOMAS ES POCO SUGESTIVO.


• LOS ANA SON MUY UTILES PARA:
– EL Dx
– SEGUIMIENTO Y PRONOSTICO (ALGUNOS)

• SE ENCUENTRAN PRINCIPALMENTE EN:
– LES
– ESCLEROSIS SISTEMICA
– ENFERM MIXTA DEL TEJ CONECTICO
– SIND DE SJÖGREN.


• UN PACIENTE CON ANA (-) Y SOSPECHA CLINICA DE ENFER
AUTOINMUNE, REQUIERE LA DETERMINACION DE AUTO Ab´s
ESPECIFICOS, ESPECIALMENTE anti- Ro.

• SIN EMBARGO, UN RESULTADO DE ANA PERSISTENTEMENTE
(-) ES UN ARGUMENTO EN CONTRA DE LES.


Too SON (+) LOS ANA

EN EL LUPUS INDUCIDO POR DROGAS.
(HIDRALAZINA, PROCAINAMIDA, INH Y CLORPROMAZINA)

EN ALGUNOS PACIENTES CON ENFERMEDADES CRONICAS.
EN LA ENFERMEDAD HEPATICA CRONICA.

OTRAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES REUMATOLOGICAS.

EDAD AVANZADA.


 APROX EL 3% DE LOS INDIVIDUOS SANOS PUEDEN TENER
ANA (+) 1:320, Y HASTA EL 32% CON ANA(+) 1:40.

 LOS Ab´s CONTRA Ag´s CITOPLASMATICOS OCURREN EN
ENFERMEDADES MUSCULARES CITOPLASMATICAS Y EN
ALGUNAS ENTIDADES HEPATICAS.

SENSIBILIDAD DE LOS ANA EN LAS ENFERMEDADES REUMATICAS Y NO REUMATICAS

07/09/12 28

3. PATRONES DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES


 LOS PATRONES QUE SE OBSERVAN A LA INMUNOFLUORESCE
SON LA CLAVE DE LA ESPECIFICIDAD DEL Ab´, PERO NO
DETERMINAN CON CERTEZA SU TIPO.

 LOS ANA PRODUCEN GRAN VARIEDAD DE PATRONES.

 LOS PATRONES PUEDEN VARIAR EN EL MISMO INDIVIDUO Y
SEGÚN LAS CIRCUNSTANCIAS.

 CON FREC SE ENCUENTRAN PATRONES MIXTOS EN UN
PACIENTE DADO.


 POR IFI (CELULAS Hep-2), SE IDENTIFICAN 6 PATRONES:

1. PATRON HOMOGENEO O DIFUSO
2. PATRON PERIFERICO O EN ANILLO
3. PATRON MOTEADO FINO
4. PATRON NUCLEOLAR
5. PATRON CENTROMERICO
6. PATRON CITOPLAMATICO.



 TODO EL NUCLEO SE COLOREA

 SE DEBE A Ab´s QUE REACCIONAN:
 CON EL COMPLEJO ADN-HISTONA (RIBONUCLEOPROTEINA O NUCLEOSOMA)
 ANTI-dsADN
 ANTI-ssADN



 UN TITULO ALTO (>1:640) ES SUGESTIVO DE LES O LUPUS
INDUCIDO POR DROGAS.

 CON LAS CELULAS HEp-2 SE DEBEN COLOREAR LAS FIGURAS
EN MITOSIS.



 EL NUCLEO SE COLOREA PRINCIPALMENTE EN LA PERIFERIE.

 SE PRODUCEN Ab´s CONTRA EL DNA NATIVO



 EN TITULOS ALTOS, ES CASI EXCLUSIVO DE LES.

 ESTE PATRON SE ASOCIA CON Ab´s CONTRA EL ds ADN O EL
ss ADN.

 DESAFORTUNADAMENTE, Ab´s CONTRA LA MEMBRANA
NUCLEAR PRODUCEN UN PATRON SIMILAR NO ESPECIFICO DE
LUPUS

 PERO LA AUSENCIA DE LAS CELULAS EN MITOSIS AYUDA A
ESTABLECER LA DIFERENCIA.



 LA COLORACION DEL NUCLEO ES RETICULAR O MOTEADA.

 LO OCACIONAN ANTICUERPOS QUE REACCIONAN CON UNA
GRAN VARIEDAD DE Ag´s NUCLEARES EXTRACTABLES (ENA)



 ESTOS Ab´s REACCIONAN PRINCIPALMENTE CON PROTEINAS
NUCLEARES NO HISTONA (PROTEINAS ACIDAS).
LAS MAS FREC:
 Sm
 U1 RNP
 LA SS-B
 Ro (SS-A)
 Scl-70
 ARN POLIMERASAS.



 ESTE PATRON SE ENCUENTRA EN
 LES
 ENFERMEDAD MIXTA DEL TEJIDO CONECTIVO
 ESCLEROSIS SITEMICA
 ARTRITIS REUMATOIDE
 SINDROME DE SJÖGREN

MENOS FREC EN OTRAS ENTIDADES.


4. PATRON NUCLEOLAR

 UNICAMENTE SE COLOREAN LOS NUCLEOLOS.

 POSIBLEMENTE LO OCACIONAN Ab´S QUE REACCIONAN CON
EL ARN NUCLEOLAR.

 EN TITULOS ALTOS ESTE PATRON ES MAS COMUN EN
ESCLEROSIS SISTEMICA.



 SE DEBE A Ab´s CONTRA LOS CENTROMEROS.

 ES SIMILAR AL PATRON MOTEADO PERO CON
CARACTERISTICAS ESPECIALES:
 LOS PUNTOS DE FLUORESCENCIA NUCLEAR SON UNIFORMES
 MAS GRANDES Y FACILES DE CONTAR (GENERALMENTE 40 A 60 POR
NUCLEO)

 LAS CELULAS EN MITOSIS TIENEN EL MISMO PATRON DE
FLUORESCENCIA EN LOS CROMOSOMAS.



 ESTE PATRON SE ENCUENTRA PRINCIPAMENTE EN EL SIND DE
CREST

 CON MENOR FREC EN LA ENFER DE RAYNOUD,
ESCLERODERMIA, CIRROSIS BILIAR PRIMARIA, LES Y AR.


6. PATRON CITOPLASMATICO

 LO OCACIONAN ANTICUERPOS CONTRA COMPONENTES DEL
CITOPLASMA (RIBOSOMAS, MITOCONDRIAS, AMINOACIL tARN
SINTETASAS Y PROTEINAS DEL COTOESQUELETO).

 SE ENCUENTRAN PRINCIPALMENTE EN ENFERMEDADES
INFLAMATORIAS DEL MUSCULO, ENFERMEDADES HEPATICAS Y
LES (anti-P ribiosomasl)

4 . ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES

4. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES EN LES

 LOS ANA SON LA CARACTERISTICA INMUNE DEL LES.

 SE ENCUENTRAN EN CASI TODOS LOS PACIENTES.

 LA MAYORIA DE LOS ANTIGENOS, BLANCO DE LOS Ab´s, SON DE
ORIGEN NUCLEAR.

 LOS Ag´s SE PUEDEN CATEGORIZA EN: ASOCIADOS A
CROMATINA O RIBONUCLEOPROTEINAS.


 EN LES PODEMOS ENCONTRAR LOS SIGUIENTES Ab´s:

 Anti-DNA
 Anti- Sm y anti-RNP
 Anti-Ro/SS-A y anti-LA/SS-B
 Antihistona
 Antirribosoma (anti-P ribosomal)
 Anticromatina
 Anti-Ku
 Ant-PCNA


1. ANTI-ADN

 ES UN ANTICUERPO DIRIGIDO CONTRA EPITOPES DEL ADN

 EXISTEN DOS TIPOS:
1. EL DE CADENA DOBLE O NATIVA: MUY ESPECIFICO DE LES.
OCACIONALMENTE POSITIVO EN TITULO BAJO EN LA AR SEVERA
O EN EL SIN DE SJÖGREN

2. EL CADENA SENSILLA O DESNATURALIZADO: SE ENCUENTRA EN
LES Y EN OTRAS ENTIDADES. TIENE POCA UTILIDAD Dx.


1. ANTI-ADN

 SE ENCUENTRA EN EL 60 – 70% DE PACIENTES CON LES
ACTIVO

 PRINCIPALMENTE CUANDO EXISTE COMPROMISO RENAL,
USUALMENTE ASOCIADO CON HIPOCOMPLEMENTARINEMIA,
LO CUAL SE DEBE A SU PODER NEFRITOGENICO (ALTA AFINIDAD,
CARGA CATIONICA, IgG Y CAPACIDAD DE FIJAR EL COMPLEMENTO)

 FLUCTUA CON LA ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD Y POR LO
GENERAL DESAPARECE CON LA TERAPIA.


1. ANTI-ADN

 OCASIONALMENTE SE ENCUENTRA EN PACIENTES EN
REMISION O INACTIVOS.

 ESTE Ab SE SOSPECHA CUANDO ELPATRON DE LA IFI, CON
CEL´s Hep-2, ES HOMOGENEO O PERIFERICO.


2. ANTI-Sm Y ANTI-RNP

 CONSTITUYEN UNA FAMILIA DE AUTOANTICUERPOS QUE
REACCIONAN CON PROTEINAS NUCLEARES NO HISTONAS.

 EL ANTIGENO SMITH (Sm) ABARCA UNA SERIE DE PROTEINAS
(B, B´, D, E, F, y G) QUE FORMAN COMPLEJOS CON LOS
FRAGMENTOS ARN (U1, U2, U4-6, U5); RECIBEN EL NOMBRE DE
snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) Y SON NECESARIOS
PARA FRAGMENTACION DEL PRECURSOR DEL mARN.



 EL Ab CONTRA EL ANTIGENO Sm ES ESPECIFICO DE LES.
PERO SOLO SE ENCUENTRA EN 10 – 30% DE CASOS.

 TIENE GRAN SIGNIFICADO Dx PRINCIPALMENTE CUANDO EL
anti-ADN ES (-).

 ASOCIADO CON EL anti-RNP PARECE SER PROTECTOR DE
NEFROPATIA.

 NO SE RELACIONA CON LA ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD NI
CON LAS MANIFESTACIONES ESPECIFICAS.


2. ANTI-RNP

 El ANTICUERPO anti-RNP SOLO SE UNE A UNA PROTEINAQUE
CONTIENE ARN U1.

 EN TITULO ALTO ES SUGESTIVO DE ENFERMEDAD MIXTA DEL
TEJIDO CONECTIVO Y CON FREC SE ASOCIA CON FENOMENO
DE RAYNAUD.

 TAMBIEN SE ENCUENTRA EN EL LES (30 – 60% DE LOS CASOS)
PERO NO SE CORRELACIONA CON LA ACTIVIDAD Y, EN TITULO
MAS BAJO, CON ESCLEROSIS SISTEMICA, EL SIND DE
SJÖGREN Y LA AR



 ESTOS DOS Ab´S SE SOSPECHAN CUANDO EN LA IFI EL
PATRON ES MOTEADO PERO USUALMENTE SE REQUIEREN
EXAMENES CONFIRMATORIOS POR ELISA

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