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7.- MICROSCOPIO
El Microscopio óptico compuesto
PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO
Sistema óptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen
del objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de
ésta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico
o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el
brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser
monocular, binocular.
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,
cambiar los objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y
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micrométrico que consigue el enfoque correcto.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya
debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el
de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el
tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a
través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo
nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar
de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el
objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy
poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:
incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con
aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de
inmersión.
Empleo del objetivo de inmersión:
. Bajar totalmente la platina.
a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el
aceite.
b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio
camino entre éste y el de x40.
c. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
d. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de
inmersión.
e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la
lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota
ascendiera y se adosara a la lente.
f. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo
entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que
con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
g. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se
puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de
aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y
repetir la operación desde el paso 3.
h. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se
coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este
momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe
retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
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i. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel
especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está
perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en
posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no
sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su
funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma
prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del
polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el
microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda
en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos
recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo
sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo,
hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que
abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso
se pueden dañar las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico,
micrométrico, platina, revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada
a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar
nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está
observando a través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún
líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño
humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión
práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general
de los mismos.
UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO
1. Colocar una preparación .
2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo.
3. Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de su
trayectoria.
4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x.
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5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable.
6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el
microscopio lo permite.
7. Enfocar la preparación.
8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal.
9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos.
10. Ajustar el enfoque.
11. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del
condensador. 12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del
campo, no tocarlo mas. No tocar mas la altura del condensador.
13. Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador.
14. Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos
ajustar el diafragma a 2/3 abierto. (2/3 del campo iluminado).
15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo
modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del
condensador.
Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del
condensador a la apertura del objetivo.
MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO DIARIO (cada vez que se usa)
Limpiar el aceite de inmersión de lentes y otras superficies del microscopio. El aceite de
inmersión debe conservarse cerrado.
Apagar la fuente de luz del microscopio
Cubrir el microscopio con su funda.
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8.- Preparados en fresco
I. GOTA:
SE REALIZAN A TRAVÉS DE SUSPENSIONES DE CÉLULAS O
MICROORGANISMOS
Materiales:
Porta y cubre
Gotero(pipeta)
Muestras de agua estancadas.
Microscopio
Procedimiento:
1) Se prepara el microscopio para el uso respectivo.
2) Con el gotero se saca la muestra.
3) Se le coloca en el porta objetos, una gota.
4) Luego se le coloca el cubre.
5) Y se procede a la observación.
6) Primero a 4x, 10x, 40x
Se coloca en
el porta
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El listado de los protozoarios esta al final de la técnica de la gota pendiente
II. GOTA PENDIENTE:
SON AQUELLAS QUE SE REALIZAN POR LA ACCIÓN DE LA
TENCIÓN SUPERFICIAL QUE TIENE SUSPENSIONES DE LOS
MICROORGANISMOS.
Materiales:
Laminas escavadas
Agua estancada
Microscopio
Pipeta (o gotero)
Porta y cubre objetos
Procedimiento:
1) al no encontrar laminas escavadas, realizamos una artesanalmente, usando cera
de vela y con ayuda de un sacabocados.
2) Al no encontrar una lamina excavada, realizamos la misma operación que en la
anterior muestra:
a) Se coloca una gota en el cubre objetos que previamente a sido
untada un poco con vaselina cruda o cera.
b) Se le coloca en forma invertida en el porta objetos que
artesanalmente fabricamos.
c) Procedemos al observación
Al colocar el porta el
liquido echado se
extiende por todo el
cubre
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Se echa cera
de vela
Se le hace un
hueco con el
saca bocados
Se coloco vaselina
después se coloco la
gota de la muestra
Vista de
horizonte
Se coloca el
cubre con la gota
de la muestra
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EJEMPLOS DE PROTOZOARIOS OBSERVADOS A GOTA Y GOTA PENDIENTE
nombre Foto
Espirilos
Bacilos
cianobacteria colonial
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(h) Stentor
(i)
(j) Cothurnia (?)( μm)
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polymorpha(1000-2000
μm)
“La diferencia de la gota y gota pendiente es que en la gota es menor tiempo de
observación y en la gota pendiente se puede observar”
III. SCOTCH TAPE:
PERMITE MUESTREAR ENDOPARÁSITOS DE ANIMALES, PLANTAS. PARA EXTRAER
HONGOS
Materiales:
Porta objetos
Cinta scotch
Muestra de tomate moho
Microscopio
Procedimiento:
1) Sacar la muestra del tomate con la cinta scotch
2) Colocar la muestra en el porta, extraida por la cinta scotch
3) Proceder a la observación.;
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Al
microscopio
Naranja tomate
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CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOS
Sección 1.02 INTRODUCCIÓN
Los hongos constituyen un grupo muy heterogéneo de organismos eucariotas, heterótrofos no
fotosintéticos y con pared celular. Basándose en la apariencia macroscópica de la colonia se
pueden diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas se
denominan levaduras; si producen crecimientos aéreos, velludos, algodonosos o pulverulentos
se llaman hongos filamentosos o mohos.
Existe un tercer grupo que se desarrolla como levaduras cuando crece a 37ºC y como hongo
filamentoso a 25ºC. Este fenómeno se denomina dimorfismo.
El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo. El talo puede ser
unicelular (en levaduras). En hongos filamentosos el talo incluye una parte vegetativa, el
micelio, compuesto por hifas y una parte reproductora.
Las hifas son tubos que contienen núcleos y citoplasma. Pueden presentar septos (micelio
tabicado) (fig.1) o no (micelio no tabicado) (fig.2).
Los septos presentan poros que conectan los distintos segmentos de la hifa. A veces las
levaduras constituyen cadenas de células denominadas pseudomicelio (fig.3).
Pueden existir elementos de resistencia como los esclerotes que son masas endurecidas de
micelio presentes en algunos géneros de Ascomycetes y Basidiomycetes.
Los hongos se pueden reproducir asexuada y sexualmente. En algunas especies coexisten las
dos formas de reproducción en el mismo organismo que se denomina entonces holomorfo. El
holomorfo tiene a la vez una forma de multiplicación asexuada, el anamorfo o estado imperfecto
y una sexuada, el teleomorfo o estado perfecto.
La reproducción asexuada puede ocurrir por propagación vegetativa a partir de fragmentos de
micelio, o por formación de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.).
La reproducción sexuada se caracteriza por la unión de dos núcleos que dan lugar a esporas
sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.).
Los hongos pueden ser homotálicos si poseen en el mismo micelio núcleos complementarios
que pueden conjugarse o heterotálicos cuando requieren núcleos provenientes de micelios
diferentes.
En general la reproducción asexuada es más importante para la propagación de la especie. En
muchos hongos la reproducción sexuada se da solo una vez al año. Hay un grupo de hongos a
los que no se les conoce reproducción sexuada. Existe otro grupo que no forma esporas de
ningún tipo y solo se reproduce por fragmentación del micelio.
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IV. SQUASH
MATERIALES:
Raíz de las habas
cubre y porta objetos.
Microscopio
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aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO:
1. Realizar la identificación de los nódulos.
2. Después de haber ubicado la identificación se procede a la colecta.
3. Realizar el lavado de los nódulos
4. Proceder al chancado o aplastado al nódulo de la raíz.
5. Bueno se observa que hay presencia de liquido lechosos y partículas pequeñas se
desecha las partículas y los demás se utiliza
6. Primero se hace la extensión
7. Segundo la fijación a fuego a mechero.
8. Tercero la coloración:
i) Coloración simple:
ii) Coloración compuesta:
9. Cuarto: después de ese procedimiento observar al microscopio
9.- preparados en fresco
I. Coloración simple:
Se denomina así, porque solo se utiliza un colorante, generalmente básico.
Con este tipo de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o
estructuras celulares.
Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas cuando el colorante es
fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro o
coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los
microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tiñe y
los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro.
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Materiales:
Azul de metileno
Fucsina
Cristal violeta
Microscopio
Porta y cubre objetos
Procedimiento:
Se agrega azul de metileno
En otra muestra fucsina
En otra muestra Cristal de violeta
II. Coloración compuesta
es aquella donde usas mas de un (1) colorante. Con esta tincion tu vas a poder ver morfologia,
tamaño, organizacion de las bacterias y ademas categorizar los microorganismos en varios
grupos, segun su afinidad con el colorante que tu estas utilizando. Hay varios tipos de tincion
diferencial pero las que uno mas usa son la TINCION DE GRAM O COLORACION DE
GRAM y la COLORACION DE ZIEHL NEELSEN.
Con la TINCION DE GRAM tu puedes diferencias las bacterias en dos grupos:
BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y BACTERIAS GRAM NEGATIVAS. Eso va a
depender de si retienen o no el colorante CRISTAL VIOLETA o el colorante
SAFRANINA. La capacidad que tengan de retener un colorante o no va a depender de
la composicion de la pared celular de la bacteria.
Las GRAM POSITIVAS cuando realizar el procedimiento de tincion de gram, puede
ver que luego de añadir lugol, el colorante cristal violeta se mantiene en el interior de la
bacteria. Las GRAM NEGATIVAS al añadir lugol pierden la coloracion del cristal
violeta y si le añades otro colorante, por ejemplo la safranina, adoptaran ese color.
Materiales:
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Procedimiento:
Primero se agrega cristal de violeta(esperar 1 minuto)
Lavar
Segundo Lugol(dejar 1 minuto)
Lavar
Safranina (dejar 1 -30 segundos)
Lavar
Observar al microscopio
Bacterias Escherichia coli (Gram
negativas)
Bacterias Clostridium perfringens (Gram
positivas)
III. Coloración neutra:
Tinción de las extensiones de sangre periférica:
El frotis, una vez seco, se fija y se tiñe mediante colorantes adecuados. Generalmente,
en los laboratorios hematológicos se emplean colorantes basados en la tinción de
Romanowsky, basado en una combinación de eosina y azul de metileno.
Con la tinción de los elementos formes de la sangre se pueden distinguir los siguientes
aspectos morfológicos de las células:
1.- La forma, dimensión y contorno de los hematíes (de color rosa pálido), leucocitos
(células nucleadas) y plaquetas (pequeños corpúsculos).
2.- El núcleo: de color púrpura
3.- El citoplasma: de color azulado o gris en los linfocitos y monocitos.
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4.- Granulaciones: mezcla de colores pardos (neutrófilos), anaranajadas (eosinófilos) y
azul oscuro (basófilos).
Aunque cada laboratorio emplea su receta, los colorantes y los métodos de tinción más
empleados son los siguientes:
Tinción de Giemsa:
1.- Secar el frotis.
2.- Fijar con alcohol absoluto durante 3 minutos.
3.- Sumergir en solución de Giemsa (1 volumen de colorante y 9 de PBS) durante 10
minutos.
4.- Lavar con abundante agua y dejar secar antes de observar al microscopio.
Colorante de Giemsa: 1 g de polvo de Giemsa + 66 mL de glicerina calentado a 50
grados durante 2 horas, añadir 66 mL de actohol metílico absoluto, dejar a
temperatura ambiente 7-14 días (maduración). Filtrar antes de su empleo.
Tinción de May-Grünwald-Giemsa:
1.- Secar el frotis.
2.- Fijar en solución de May-Grünwald (1 volumen de colorante y 1 volumen de PBS)
durante 2 minutos.
3.- Sumergir en solución de Giemsa durante 15-20 minutos.
4.- Lavar en abundante agua y dejar secar.
Colorante May-Grünwald: 0,3 g de polvo de May-Grünwald + 100 mL de acohol
metílico absoluto calentado a 56 grados hasta la disolución completa del colorante,
dejar enfriar a 4 grados durante 24 horas (agitación intermitente). Filtrar antes de su
empleo.
Tinción de Wright:
1.- Secar el frotis.
2.- Teñir con colorante de Wright durante 1 minuto.
3.- Teñir con una mezcla de colorante en 2 ó 3 volúmenes de tampón (PBS) durante 10
minutos.
4.- Lavar en abundante agua y dejar secar antes de observar al microscopio.
Colorante Wright: 1 g de polvo de Wright + 600 mL de alcohol metílico absoluto
calentado a 56 grados hasta la disolución completa del colorante. Dejar enfríar.
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Colorantes usos
Azul de
metileno
El azul de metileno es un colorante que se usa para tratar
una enfermedad llamada metahemoglobinemia.
Es un compuesto químico heterocíclico aromático con
fórmula molecular: C16H18ClN3S.
El azul de metileno se usa como tintura para teñir ciertas
partes del cuerpo antes o durante la cirugía. Su uso es
principalmente como antiséptico y cicatrizador interno.
También se utiliza como colorante en las tinciones para la
observación en el microscopio.
Esta sustancia tiene forma de cristales o polvo cristalino y
presenta un color verde oscuro, con brillo bronceado. Es
Inodoro o prácticamente inoloro. Es estable al aire. Sus
soluciones en agua o en alcohol son de color azul profundo. Es
fácilmente soluble en el agua y en cloroformo; también es
moderadamente soluble en alcohol.
Fucsina Tinte natural de naturaleza lipidica. La fucsina es la materia
prima para el colorante clorhidrato de rosalina, el cual es
formado tras su desecación. A la Fucsina también se le conoce
como Magenta, Rojo anilina, Roseína y Rubina. Al colorer
con fucsina permite demostrar la presencia de carbohidratos en
el tejido.
Rojo de
congo
La coloración con rojo Congo funciona sobre la base de enlaces por puente de
hidrógeno con el componente de hidrato de carbono del substrato. El amiloide,
teñido por el rojo Congo, muestra un llamativo bicromatismo bajo la luz
polarizada, los sedimentos muestran sectores verdes luminosos sobre fondo
oscuro, mientras que otros materiales, como colágeno, que también son
teñidos por el rojo Congo, no muestran este efecto.
Coloración de Wringht
Materiales:
Sangre
Lanceta
Algodón
Alcohol
Porta y cubre objetos
Colorante Wright
Agua destilada puente de tinción
Microscopio.
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Procedimiento:
1) Lavarse la mano, desinfectar la mano
2) Ingresar la lanceta en el pulpejo del dedo 90º
3) La primera gota se desecha
4) La segunda se utiliza y se le coloca en el porta
5) Se procede al frotis
6) Colocamos el colorante winghr
7) Dejamos en el puente de tinción.
8) Cubrimos con colorante
9) Adicionamos agua destilada(gotas de colorante =gotas de agua)
10) Dejar secar
11) Después colocar el aceite de inmersión para observar a 100x
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10.-Microscopio Estereoscopio
Se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como
ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la
imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios
estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por
lo que a veces se confunden ambos términos. Existen dos tipos de diseño, denominados
respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo común (o Galileo).
El diseño convergente consiste en usar dos microscopios idénticos inclinados un cierto
ángulo uno con respecto a otro y acoplados mecánicamente de tal forma que enfocan la
imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseño económico,
potente y en el que las aberraciones resultan muy fáciles de corregir, presenta algunas
limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner
accesorios) y la observación durante tiempos largos resulta fatigosa.
El microscopio estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños
relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar)
ni tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. Este tipo de microscopios
permite una distancias que van desde un par de centímetros a las decenas de ellos desde
la muestra al objetivo, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogía y en la industria
(microelectrónica, por ejemplo) como en medicina (microscopios quirúrgicos) e
investigación, fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto
visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial). En la fotografía se aprecia una
concha de 4 cm de diámetro.
Podríamos decir que un microscopio estereoscópico sirve para las disecciones de
animales.
Los estereoscopios permiten hacer estudios de objetos y especímenes demasiado
pequeños para ser estudiados a simple vista, pero demasiado grandes para ser estudiados
bajo el microscopio compuesto. Su magnificación va desde cerca de 5x hasta más de
60x. Los estereoscopios también son conocidos como microscopios de disección, pues
en muchas ocasiones son usados para disecar los especímenes o muestras, separando de
ellos aquellas partes que serán examinadas mediante otros tipos de microscopía.
Materiales:
Estereoscopio
Insectos
Glicerina
Porta y cubre
Esmalte
Cinta Scott
Procedimiento:
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1) Primero el insecto tiene que estar muerto en alcohol
2) Se procede al observado
3) Par insectos más pequeños como pulgas piojos o hormigas se procede lo siguiente:
a) Se hace derretir la glicerina
b) Se le coloca al porta junto con el insecto.
c) Se coloca el cubre y se procede al esmaltado de las costados para que no este
cerrado herméticamente y no entre cualquier organismo, que le perjudique
d) Se procede al observado