Este documento presenta 10 prácticas para el reconocimiento y manejo de nemátodos fitoparásitos en el laboratorio de fitopatología. La Práctica 1 describe la observación de nemátodos fitoparásitos y de vida libre bajo el microscopio. La Práctica 2 presenta diferentes métodos de muestreo de nemátodos en el campo como muestreo dirigido, no dirigido y sistematizado. La Práctica 3 cubre técnicas de extracción de nemátodos del suelo.

1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA
ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE
MANUAL DE PRÁCTICAS DE NEMATOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA RAMA DE FITOPATOLOGÍA
ING. MENA ADRIANO JORGE DANIEL
JUAN JOSÉ RÍOS, AHOME, SINALOA. JUNIO DEL 2008

3. INDICE
Introducción 1
Instrucciones para el uso de los laboratorios de fitopatología 3
PROGRAMA DE TRABAJO 4
PRÁCTICA #1. Observación y reconocimiento de los nemátodos fitoparásitos
en el laboratorio 4
PRÁCTICA #2. Técnicas de muestreo para detectar nemátodos fitoparásitos 6
PRÁCTICA #3. Métodos para la extracción de nemátodos del suelo 12
PRÁCTICA #4. Métodos para la extracción de nemátodos de la raíz 16
PRÁCTICA #5. Manipulación de nemátodos 18
PRÁCTICA #6. Preparaciones permanentes de nemátodos 21
PRÁCTICA #7. Identificación de géneros de nemátodos fitoparásitos 23
PRÁCTICA #8. Cuantificación de población de nemátodos 25
PRÁCTICA #9. Cortes y montajes de modelos perineales de Meloidogyne 27
PRÁCTICA #10. Identificación de géneros de nemátodos fitoparásitos con
manejo de claves 31
Bibliografía 33
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5. INTRODUCCIÓN
La siguiente antología tiene como finalidad facilitar el siguiente material de estudio;
ya que la vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de
enseñanza-aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que
se reproduce para el caso particular de la Nematología.
Como sabemos los nemátodos son animales con una organización muy sencilla,
que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen
nemátodos Saprófagos que favorecen la descomposición de la materia orgánica,
Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de
animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y
pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas.
Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce,
suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas
cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y
agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de
fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc.
Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el
suelo y/o el interior de las raíces de las plantas.
Son de gran importancia económica ya que les causan serios daños a las plantas
cultivables afectando su rendimiento, se encuentran ampliamente distribuidos en
el suelo, son de fácil diseminación, causan problemas permanentes en el suelo,
son polífagos (fitófagos) y de difícil erradicación una vez establecidos en el suelo o
la planta.
El presente trabajo se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones prácticas
para que los estudiantes que estén cursando la materia de Nematología,
adquieran los conocimientos teórico-prácticos del manejo de nemátodos en el
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6. laboratorio de fitopatología. De tal manera que se incluyen las técnicas de
muestreo para detectar nemátodos fitoparásitos, también se incluyen los métodos
para la extracción de nemátodos del suelo y de la raíz, manipulación de
nematodos, así como las preparaciones permanentes de nemátodos y muchas
más que se verán mas adelante.
Agradezco a los doctores Apodaca Sánchez Miguel Ángel y Quintero Benítez José
Alberto, que gracias a la gran experiencia de ambos, contribuyeron con sus
comentarios y sugerencias para la recopilación e integración de las practicas del
presente trabajo. También expreso mi agradecimiento al Ing. Jesús Guadalupe
Loredo Vega y al profesor Marco A. Uribe Domínguez por su gran apoyo en la
organización y ordenamiento de la información que contiene este trabajo.
Las criticas constructivas de los colegas y estudiantes son bienvenidas, ya que se
pretende la mejoría permanente de este trabajo.
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7. INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DE
FITOPATOLOGÍA
El laboratorio constituye un lugar de trabajo para la enseñanza y la investigación;
los mayores peligros que presenta no lo son ni el fuego ni las descargas eléctricas,
sino el descuido y la irresponsabilidad de los usuarios.
Para la conservación y mejor servicio de los laboratorios de fitopatología, las
personas que deseen usarlo deberán apegarse a las siguientes disposiciones:
LIMPIEZA
Los materiales de desecho deberán depositarse en el recipiente de basura, no
dejarlos nunca sobre la mesa o tirarlos al suelo.
El material de vidrio que se use, deberá llevarse inmediatamente al lavadero para
que el ayudante lo tenga limpio para su uso inmediato.
El material utilizado por los alumnos en actividades extraclase, deberá ser lavado
por el mismo.
Cuando no se utilicen las mesas de trabajo, deberán permanecer libres de polvo y
otros materiales: no dejar materiales innecesarios sobre ellas.
Cuando el caso lo amerite, se deberá cubrir el material (tubos, cajas de petri,
material vegetal, etc.) con un papel polietileno, indicando su nombre y la fecha en
que lo dejan.
Después de hacer uso de algunas substancias y otros materiales de uso general,
regresarse a su gaveta, revisando que no hayan quedado residuos de estas
substancias sobre la mesa.
NOTA: EL MATERIAL QUE NO REÚNA ESTAS CONDICIONES, PODRÁ SER
DESECHADO POR EL AYUDANTE O ENCARGADO DE LIMPIEZA
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8. PROGRAMA DE TRABAJO
PRÁCTICA #1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS
FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
Como sabemos los nemátodos son animales con una organización muy sencilla,
que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen
nemátodos Saprófagos (vida libre) que favorecen la descomposición de la materia
orgánica, Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos
parásitos de animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que
parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas.
Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce,
suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas
cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y
agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de
fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc.
Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el
suelo y/o el interior de las raíces de las plantas.
OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemátodos
fitoparásitos de los de vida libre en el laboratorio.
MATERIALES Y MÉTODOS
Usando los nemátodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj
una alícuota (2-5 mm) de la suspensión nemátodos-agua, enseguida se pasan al
microscopio de disección para ser observados e identificar los nematodos
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9. fitoparásitos de los de vida libre. Y después se observan en el microscopio
biológico.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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10. PRÁCTICA #2. TÉCNICAS DE MUESTREO PARA DETECTAR NEMÁTODOS
FITOPARÁSITOS (PRÁCTICA DE CAMPO)
INTRODUCCIÓN
Antes del inicio del muestreo es recomendable la decisión de los propósitos u
objetivos a fin de estar en condiciones de aplicar el método de muestreo mas
aplicado.
Puesto que el “universum” en el que es posible encontrar a los nemátodos puede
ser: 1). En el suelo (ya sea en un terreno agrícola o una muestra de suelo) y/o 2).
Tejido vegetal (un cultivo o una planta), el examen de muestras de suelo y de
raíces es una de los primeros pasos para diagnosticar un problema en un cultivo
en el que estos especimenes se están considerando como factores limitantes en la
producción. Las especies presentes y el numero que se extraigan, nos
proporcionara información útil sobre si son parcial o totalmente los responsables
del pobre desarrollo del cultivo.
OBJETIVOS: Que el alumno realice diferentes tipos de muestreos y se capacite
para aplicar el mas adecuado al cultivo afectado por nemátodos fitoparásitos.
MATERIALES Y METODOS
1.- MUESTREO EN UN TERRENO CON CULTIVO ESTABLECIDO
A).- MUESTREO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando detectamos
manchones de plantas bien definidos que manifiesten síntomas aparentemente
por ataque de namátodos (reducción de tamaño, amarillamiento, estaca
producción, etc.) y queremos saber si son nemátodos los que están causando esta
sintomatología.
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11. El método consiste en tomar 3 submuestras (plantas enfermas) dentro del
manchón a partir del centro hasta la orilla y por separado se toman otras 3
submuestras fuera de él (plantas aparentemente sanas). Cada submuestra
consistirá aproximadamente de 100-200 grs. de rizosfera (asociación de suelo
mas raíces) por punto de muestreo. La profundidad del muestreo será entre 10-30
cms. Donde se localizan la mayor cantidad de raíces jóvenes y en activo
crecimiento; aquí es donde los nemátodos son más abundantes.
Las muestras se colectarán en bolsas de polietileno a las que se le colocarán una
etiqueta para su identificación.
B.- MUESTREO NO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando se quiere conocer
la fauna nematológica asociada a un cultivo el cuál no muestra síntomas todavía o
bien está afectado de manera general.
El método consiste en recorrer una sección del lote en zig-zag y establecer 5
puntos de muestreo (plantas) a una distancia de 20 pasos (metros) uno de otro.
En cada punto de muestreo se toman aproximadamente 100 grs. de rizosfera
(asociación de suelo más raíces) a una profundidad de 10-30 cms. Eliminando la
capa superficial del suelo (unos 10 cms.). Las muestras se colectan en bolsas de
polietileno y se le coloca una etiqueta de identificación.
2.- MUESTREO SISTEMATIZADO 8X8
Este método se utiliza cuando se quiere conocer la fauna nematológica existente
en un terreno antes de establecer un cultivo.
El método consiste en colectar pequeñas submuestras cada 8 pasos (metros) a lo
largo del terreno y otros 8 a lo ancho, pero regresando en línea paralela al
recorrido anterior, con esto estamos prácticamente cuadriculando el terreno y en
los puntos de intersección, tomamos las submuestras a una profundidad entre
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12. 10-30 cms. de donde se tomarán de 50-60 grs. de suelo. La muestra se colectara
en una bolsa de polietileno y se le colocará su etiqueta de identificación.
En el caso de que el muestreo sea para detectar nemátodos formadores de
quistes, se procede de igual manera que en el caso anterior, solo que las
submuestras se obtienen de la superficie del terreno.
3).- MUESTREO EN HUERTAS FRUTALES (AGUACATE, MANGO, VID,
CITRICOS, PLATANO, ETEC.)
A).- MUESTREO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando detectamos
manchones de árboles bien definidos que manifiesten síntomas aparentemente de
estar afectados por nemátodos, como son: reducción del crecimiento,
amarillamientos, hojas pequeñas y escasas, baja producción, etc.
El método consiste en tomas 3 submuestras (árboles enfermos) dentro del
manchón a partir del centro hasta la orilla del manchón y por separado se toman
otras 3 submuestras fuera de él (árboles sin síntomas). En cada árbol (punto de
muestreo) se toman 4 submuestras a 1 m. de distancia del tronco del árbol hacia
fuera en dirección de los puntos cardinales.
La profundidad del muestreo será en el lugar donde se encuentren el mayor
número de raíces jóvenes y en crecimiento activo, lo cual puede variar entre los
10-40 cms. dependiendo del árbol frutal. La cantidad de rizosfera (suelo más
raíces) obtenida por submuestras será aproximadamente de 100 grs. Las
muestras se colectarán en bolsas de poliétileno y de etiquetaran para su
identificación.
B).- MUESTREO NO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando se quiere conocer
la fauna nematológica asociada a una huerta de un frutal, donde todavía no hay
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13. síntomas evidentes de ataque de nemátodos o bien se ve afectado de manera
general.
El método consiste en recorrer una sección en zig-zag y establecer 5 puntos de
muestreo (árboles) a una distancia de 20 pasos (metros). Otra forma seria
muestreando 1 de cada 10 árboles revisados de la huerta. La obtención de las
muestras en cada punto de muestreo sería siguiendo la misma metodología
explicada anteriormente en el método dirigido.
¿QUÉ DATOS DEBEN TOMARSE EN EL MUESTREO?
Es importante que el técnico anote cierta información que le será de utilidad en la
interpretación de los resultados o para que si es necesario un nuevo muestreo le
sea fácil localizar el lugar. Debe informarse del tipo de manejo del cultivo
(fertilización, aplicación de plaguicidas, riegos, etc.), las características del suelo
(textura, ph, etc.), tipo de malezas, así como la localización exacta, fecha, cultivo
(anterior, actual), colector y otra información que le sea útil. Para esto deberá tener
una libreta de campo y etiquetas para colgar, en estas ultimas anotará el numero
de muestra (identificación), fecha de muestreo, cultivo y variedad.
¿CÓMO DEBEMOS MANEJAR LAS MUESTRAS?
Las muestras al ser transportadas del campo al laboratorio deben cuidarse que no
le peguen directamente los rayos solares y no se golpeen porque muchos
nemátodos morirán por deshidratación. En el laboratorio deben ser procesadas
inmediatamente, y si no conservarlas en el refrigerador a unos 4 ºC.
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14. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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15. REGISTRO DE MUESTRAS NEMATOLÓGICAS
No. de muestra ........ Fecha .................. Cultivos y variedad ....................................
Ubicación del lote muestreado ...................................................................................
Nombre del propietario ..............................................................................................
Dirección y teléfono ...................................................................................................
Fecha de siembra ó transplante ................................................................................
Método de siembra ................................. Densidad de siembra ...............................
Material de siembra: Certificado ............................ No certificado ............................
Forma de riego: Goteo ......... Aspersión .......... Gravedad .......... Inundación ..........
Frecuencia de riegos .................................. Fertilización (material y dosis) ..............
....................................................................................................................................
Control de plagas y enfermedades ............................................................................
....................................................................................................................................
Ph del suelo: Alcalino ........................ Neutro ........................ Acido .........................
Tipo de suelo: Arcilloso ............ Limoso ............. Franco ............. Arenoso ..............
Topografía del suelo: Plano ................... Ladera ................... Ondulado ..................
Síntomas (en follaje y raíz) ........................................................................................
....................................................................................................................................
Fecha aproximada de inicio del problema .................................................................
Superficie: Afectada ...................................... Muestreada ........................................
Numero de muestras por hectárea ..................... Tipo de muestreo .........................
Producción anterior ..................................... Producción actual ................................
Otras observaciones de campo .................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
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16. PRÁCTICA #3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL
SUELO (ECTOPARÁSITOS)
INTRODUCCIÓN
Las muestras traídas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para
obtener los nemátodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su
identificación y conteo. Hay nematodos fitoparásitos que se alimentan de las
raíces como ectoparásitos, los que siempre estarán en el suelo; pero otros se
introducen al sistema radical (endoparásitos) del cual se alimentan e incluso
algunos se mueven hasta las partes áreas. El método de extracción será de
acuerdo al tipo de nemátodos mencionados anteriormente.
OBJETIVOS: Qué el alumno se adiestre en las diferentes técnicas para la
extracción de nemátodos del suelo (nemátodos de vida libre y fitoparásitos).
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra que se recogió en el campo se esparce sobre un pedazo de plástico,
se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las raíces para
procesarlas posteriormente y extraer los nemátodos endoparásitos. Una vez
mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras
formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plástico.
MATERIALES Y MÉTODOS
1).- MÉTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de
goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de diámetro,
enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presión
en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Después se procede a llenar con
agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla.
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17. Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero,
fecha y lugar de colecta
Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre
que de antemano esté amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial
(kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se
humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando
que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24
horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los
nemátodos parásitos y saprófitos que pasaron por el papel facial y la malla.
Si se desea, se pueden observar directamente los nemátodos al microscopio de
disección, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensión en un vidrio de
reloj, luego se observan. En caso contrario o después de realizado lo anterior, se
procede a matarlos y fijarlos para su preservación por tiempo indefinido.
2).- MÉTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo
distribuido en el plástico, se toman muestras en diversos puntos agregándose a
una probeta que contiene 200 cc de agua hasta aforar a 300 cc. El contenido de la
probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen
desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la
solución y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el
material pesado y los nemátodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta
A, se pasa a través de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta
B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 (ó
500) y lo que queda en él se pasa al embudo de Baermann.
3).- MÉTODO DE FLOTACIÓN (TAMIZ-CENTRÍFUGA): Lo que queda en el tamiz
de 325 ó 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la
centrifuga a los que previamente se les agregó 0.5-1.0 g de kaolín, el cual se
mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la
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18. sedimentación de los nemátodos junto con las partículas de suelo (favorecido por
el kaolín). Después se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgánica
suspendida.
El sobrenadante eliminado se sustituye por solución sucrosa (45 g. de solución
sucrosa o azúcar refinada en 100 cc. de agua destilada) y se mezcla con la
muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa
por el tamiz de 325 ó 500 mallas donde los nemátodos quedan retenidos
procediéndose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para
eliminar el azúcar del cuerpo de los nemátodos. Con la ayuda de una piceta se
pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemátodos para hacer
observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de
identificación y conteo.
4).- MÉTODO PARA EXTRAER DEL SUELO A NEMÁTODOS FORMADORES
DE QUISTES: De la muestra completamente seca (si es de cultivo en pie se debe
secar a temperatura ambiente por unos 15 días) se toman 1000 g. que se colocan
sobre un tamiz de 8 mallas por pulgada cuadrada sobre la boca del flotador de
Fenwick lleno de agua.
Se hace pasar el suelo a través del tamiz utilizando una corriente de agua. Lo que
hace que el material pesado se vaya al fondo del deposito, floten los quistes
mezclados con restos de material orgánico, que son arrastrados hacia fuera al
derramarse el agua haciéndolos caer en dos tamices, uno (el superior) de 20
mallas y el otro (inferior) de 60 mallas. El primero retendrá todo los materiales
grandes y el segundo partículas pequeñas junto con los quistes, en caso de existir.
El material retenido en el tamiz de 60 mallas se pasará a un vaso de precipitado
utilizando una piceta el cual contiene agua y se le colocó previamente una tira de
papel absorbente. Se agrega una pequeña cantidad de jabón detergente con el fin
de romper la tensión superficial y propiciar que la materia orgánica y quistes se
14

19. adhieran al papel. Esta se extrae y se coloca sobre una tira de vidrio para
observarse al microscopio estereoscópico y colectar los quistes si la muestra los
contiene.
RESULTADOS Y DISCUCIÓN
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20. PRÁCTICA #4. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA
RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)
INTRODUCCIÓN
Paralelamente al grupo de los nemátodos ectoparásitos (es decir, aquellos que
se alimentan externamente de la raíz y cuyo hábitat es el suelo), existe el grupo de
los endoparásitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y
que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino más bien de lo que
ocurre en la planta. Así pues, podemos encontrar nemátodos desde la raíz, tallos y
hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema
para la agricultura porque son un grupo mucho más peligroso que el anterior.
Para la extracción de estos nemátodos, existen algunos métodos que por su
sencillez y efectividad vale la pena conocerlos.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los métodos de extracción más
sencillos y prácticos que se conocen para extraer nemátodos endoparásitos.
MATERIALES Y MÉTODOS
1).- OBSERVACIÓN DIRECTA: Se usa en raíces con agallamiento, se utilizan
agujas de disección para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles,
machos y masas de huevecillos de los nemátodos que causan agallas
(Meloidogyne spp. y Nacobbus spp.).
2).- INCUBACIÓN: Las raíces previamente lavadas o el follaje son cortados en
pequeñas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejándose reposar
por unas 24-48 horas para que los nemátodos salgan de los tejidos.
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21. 3).- LICUADORA CENTRÍFUGA: Las raíces lavadas se licuan a alta velocidad
durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotación para
nemátodos ectoparásitos.
4).- EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para
ectoparásitos, solo que aquí usamos en lugar de suelo, pequeñas piezas de raíces
previamente lavadas.
5).- LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de
raíces; los trocitos de raíz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar
durante un minuto. El material licuado se pasa a través de un tamiz de 325 mallas,
recogiendo el material en un vaso de precipitado. Después observar al
microscopio de disección.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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22. PRÁCTICA #5. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS
INTRODUCCIÓN
La manipulación de los nemátodos previo a su identificación y conteo una vez que
han sido extraídos por las técnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy
importante porque lleva implícitos el matado, fijado y pesca de estos organismos.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca las técnicas de manipulación más usadas
para realizar la identificación y conteo de nemátodos en un análisis nematológico
de una muestra.
MATERIALES Y MÉTODOS
1).- MATADO: Existen varios métodos para realizar el matado de los nemátodos
pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsión. Hay 2 formas generales
para realizar esta operación, ellas son:
A).- MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alícuota
de la suspensión nemátodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a
la flama de una lámpara de alcohol. Después se observan al microscopio de
disección para verificar su muerte.
B).- MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de
500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 ºC se retira de la flama y se
introduce durante 3-4 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc.
de agua con nemátodos. También se puede matar dejando hervir el agua
introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto.
2).- FIJACIÓN: Una vez que los nemátodos han sido matados, se deja enfriar el
agua con nemátodos y se le agrega el fijador (F.A. 4:10) en una porción de 1:1.
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23. Fijador F.A. 4:10
Formol al 40% .................... 10 cc.
Acido glacial acético ............10 cc.
Agua destilada .....................10 cc.
Nota: Con este fijador los nemátodos rara vez se distorsionan, pero tienden a
tornarse café y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven
transparentes después de unos cuantos días.
3).-PESCA DE NEMÁTODOS: Después de la extracción, matado y fijación de los
nemátodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de
agua para observarlos, estudiar sus características e identificación bajo el
microscopio biológico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de
una varita de bambú con la punta bien adelgazada. La técnica para pescar
nematodos es la siguiente:
1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua.
2.- Se coloca una alícuota de la suspensión agua-nemátodos matados y fijados en
un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscópico.
3.- Se localiza un nemátodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la
varita de bambú se lleva al nemátodo hacia la superficie lentamente y una vez en
la superficie, se saca rápidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos.
4.- Nuevamente se busca otro nemátodos y se sigue el mismo procedimiento
hasta trasladar por lo menos 5 nemátodos al portaobjetos.
5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemátodos. Enseguida se
observa al microscopio biológico.
6.- Se estudian las características de cada nemátodo para su identificación y su
posterior cuantificación.
19

24. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
20

25. PRÁCTICA #6. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS
INTRODUCCIÓN
En nemátodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente
gónadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los
especimenes pueden ser aclarados procesándolos a lactófenol ó glicerina, los
cuales son medios de montaje apropiados. Además es muy importante con fines
académicos o de investigación al conservar preparaciones permanentes de
nemátodos.
OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de
nemátodos para su conservación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Transferir nemátodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga
0.5 ml. de la siguiente solución:
Solución I:
Etanol 96% .................... 20 partes
Glicerina ........................ 1 parte
Agua destilada .............. 79 partes
Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su
capacidad con etanol 96% y déjelo cuando menos durante 12 horas en una estufa
a 35-40 ºC. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemátodos
en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solución II (5
partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colóquelo
durante 3 horas en una estufa a 40 ºC para que se evapore lentamente el etanol
hasta que los nemátodos queden en glicerina pura.
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26. Los nemátodos así deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura
(purificarla dejándola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que
contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de
ángel, después se coloca un cubreobjeto y el borde de éste se sella con esmalte
de uñas transparentes.
Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos:
1.- Nombre científico 4.- No. de hembras y machos
2.- Localidad 5.- Colector
3.- Hospedante 6.- Fecha
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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27. PRÁCTICA #7. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS
FITOPARÁSITOS
INTRODUCCIÓN
Los nemátodos fitoparásitos abarcan un gran número de géneros y especies de
gran importancia agrícola. El conocimiento de la sintomatología, morfología,
biología y control es de interés fundamental para el parasitólogo.
El control de los nemátodos fitoparásitos, se basa en una identificación correcta
del nemátodo en cuestión, de ahí que sea importante conocer las características
morfológicas más importantes de los principales géneros de estos patógenos.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y diferencie las características morfológicas
de los principales géneros de nemátodos fitoparásitos de importancia agrícola.
MATERIALES Y MÉTODOS
1.- Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o suelo procesado, los
montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente.
2.- Usando los montajes permanentes disponibles en el laboratorio, observar al
microscopio biológico los especimenes, con los objetivos 10x y 40x.
3.- Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más
importantes: forma, tamaño, tipo de estilete, tipo de esófago, unión del bulbo basal
con el intestino, posición de la vulva, tipo de cola, características del sistema
reproductor de la hembra, etc.
4.- Se estudiarán los siguientes géneros:
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28. a).- Meloidogyne g).- Helicotylenchus
b).- Globodera h).- Mononchus
c).- Heterodera i).- Rhabditis
d).- Punctodera j).- Ditylenchus
e).- Nacobbus k).- Otros
f).- Xiphinema
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1.- Se presentan los dibujos tal como se hicieron en el laboratorio.
2.- Indique cómo diferenciar entre sí los géneros observados, para ello consulte la
literatura al respecto.
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29. PRÁCTICA #8. CUANTIFICACIÓN DE POBLACIÓN DE NEMÁTODOS
INTRODUCCIÓN
Las poblaciones de nemátodos en el suelo y raíces aumentan o disminuyen a
través del tiempo y son afectadas por las condiciones fisiológicas del hospedante,
la presencia de otros organismos, el tipo de suelo y por influencias ambientales y
edáficas.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca una metodología para cuantificar
poblaciones de nemátodos, en una muestra de suelo o raíces.
MATERIALES Y MÉTODOS
En un vaso de precipitado se toman 20 ml. de la suspensión agua con nemátodos
del método de extracción desarrollado; enseguida se extrae una alícuota de 1 ml.
usando una jeringa hipodérmica y se vierte en un vidrio de reloj, previamente
cuadriculado marcando cuadros de 5 mm. por lado. Si los nemátodos están vivos
se matan bajo la flama de una lámpara de alcohol durante 12 segundos. Después
se deja enfriar y se coloca el vidrio de reloj bajo el microscopio de disección; se
cuentan los nemátodos en forma ordenada en cada cuadro. Esta operación se
repite con 5 alícuotas de 1 mm. del mismo vaso de precipitado para sacar un
promedio. Después se obtiene mediante una regla de tres simple, el número total
de nemátodos en los 20 ml. que representan la muestra procesada.
Cuando en una muestra tenemos varios géneros se cuantifica cada uno por
separado.
Ejemplo: Se quiere conocer el número de nemátodos contenidos en una muestra
de 1 kg. de suelo procedente de una huerta de cítricos. Para la extracción de los
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30. nemátodos en el laboratorio se empleo el método tamiz-embudo, se procesaron
200 ml. de suelo. A las 48 horas se tomaron 20 ml. de agua con nemátodos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1.- Los resultados presentarlos en cuadros.
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31. PRÁCTICA #9. CORTES Y MONTAJES DE MODELOS PERINEALES DE
Meloidogyne
INTRODUCCIÓN
La identificación de las especies del género Meloidogyne spp. esta basada
primordialmente en el tipo de modelo perineal que presentan las hembras; por tal
motivo es importante cortar y montar adecuadamente la región genital de estos
nematodos.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca una de las metodologías para identificar
especies de Meloidogyne.
MATERIALES Y MÉTODOS
1.- Para la extracción de nemátodos del género Meloidogyne se observa la raíz
afectada con nódulos, y con 2 agujas de disección se extraen las hembras
(globosas) endoparásitas.
2.- Sobre un portaobjetos, poner una gota de agua o acido láctico.
3.- Colocar una hembra de Meloidogyne sobre la gota.
4.- Con una aguja hipodérmica (para insulina), realizar un corte perineal (región
del ano y vulva) debajo de la línea ecuatorial. Se elimina la parte anterior del
cuerpo.
5.- Se lava y limpia el corte cuidando no romper la estructura.
6.- Sobre un portaobjetos limpio, se deposita una gota de lactófenol y sobre este
se le colocan 4 cortes, de forma tal que la parte interna del modelo perineal haga
contacto con la superficie del portaobjetos.
7.- Colocar un cubreobjetos, sellar con barniz de uñas y etiquetar.
8.- Se observan al microscopio compuesto para su identificación, de acuerdo a las
estructuras que tiene en la parte anal y con base en claves taxonómicas para
especies de Meloidogyne se logra la identificación a nivel especie.
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32. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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33. CLAVES DE LAS ESPECIES MAS IMPORTANTES DEL GÉNERO Meloidogyne
BASADAS EN LA MORFOLOGIA DEL PATRÓN PERINEAL
1. Puntuaciones presentes en el área terminal de la cola M. hapla
Puntuaciones ausentes en el área terminal de la cola 2
2. Campo lateral marcado con profundas incisuras,
generalmente extendiéndose más allá del perineum M. javanica
Campo lateral no claramente marcado o terminado cerca
del perineum 3
3. Estrías del arco dorsal fusionadas y entremezcladas M. chitwoodi
Estrías del arco dorsal no fusionadas ni entremezcladas 4
4. Campo lateral cerca del perineum marcado por incisuras
gruesas, curvadas, elevadas y dobladas M. exigua
Campo lateral no marcado por estrías curvadas y
dobladas 5
5. Arco dorsal alto y cuadrado, estrías lisas a onduladas M. incognita
Arco dorsal bajo y redondeado 6
6. Estrías en el arco dorsal cerca del perineum gruesas y
toscas M. artiellia
Estrías en el arco dorsal cerca del perineum no gruesas ni
toscas 7
7. Estrías en el arco dorsal redondeadas formando
hombreras M. arenaria
Arco dorsal sin hombreras evidentes 8
8. Fasmidias grandes M. naasi
Fasmidias muy pequeñas M. graminicola
MORFOLOGÍA DEL PATRÓN PERINEAL DE LAS HEMBRAS DE Meloidogyne
2.1.- Meloidogyne incognita 2.19.- Meloidogyne hapla
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34. 1.1.- Morfología general de un 2.7.- Meloidogyne javanica
modelo perineal 2.13.- Meloidogyne arenaria
PRÁCTICA #10. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS
FITOPARÁSITOS CON MANEJO DE CLAVES
INTRODUCCIÓN
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35. Es muy importante que el estudiante adquiera a través de la práctica, la habilidad
para identificar los géneros de nemátodos más comunes, distinga sus rasgos
distintivos y determine su clasificación, la sintomatología que causan en las
plantas y los principales hospederos. Lo anterior es importante porque con
frecuencia los nemátodos son más dañinos de lo que puede imaginarse, por lo
que su determinación e identificación permiten al agrónomo aplicar las medidas de
control más eficientes.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y desarrolle la metodología necesaria para
identificar géneros de nemátodos, mediante el manejo de claves.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la realización de esta práctica es necesario contar con las “claves para la
identificación de nemátodos” de Fernando de la Jara A. y Filiberto Zerón B.
El desarrollo de la misma se basará en el manejo de las claves.
1.- Elaborar montajes a partir de muestras de nemátodos matados y fijados, los
montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente.
2.- Observar detalladamente las características del nemátodo bajo el microscopio
biológico con el objetivo 40x.
3.- Siga cuidadosamente la secuencia de la clave hasta llegar al género al que
pertenece el nemátodo en estudio.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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36. BIBLIOGRAFÍA
AGRIOS, G. N. (1995). Fitopatología, 2da. Ed. Limusa. México. 838 pp.
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37. CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. Ed; Trillas. México. 109
pp.
GERARDO, A. M. (2002). Manual de prácticas de Micología. Juan José Ríos, Sin;
México. 35 pp.
JESSE, R. (1978). Fitonematología tropical. Campo experimental de la
Universidad de Puerto Rico, Puerto Rico. 256 pp.
MEREDITH, J. A. (1973). Algunos métodos de campo y laboratorio para trabajar
con nemátodos. Facultad de Agronomía. Universidad Central de Venezuela.
Maracay, Venezuela. 79 pp.
PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan
José Ríos, Sin; México. 20 pp.
THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York,
Estados Unidos. 553 pp.
YEPEZ, T. G. (1972). Los nemátodos enemigos de la agricultura, Imprenta
Universidad de Caracas; Universidad Autónoma de Venezuela, Facultad de
Agronomía. Venezuela. 220 pp.
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