Pdf 用反义rna 技术创造高直链淀粉玉米材料

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中国农业科学 2009,42(9):3028-3035
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.09.003

用反义 RNA 技术创造高直链淀粉玉米材料
关淑艳，王丕武，刘广娜，刘慧婧，赵丽娜

（吉林农业大学生物技术中心，长春 130118）

摘要：
【目的】利用反义 RNA 技术调控玉米淀粉的生物合成过程，创造高直链淀粉玉米材料。
【方法】克隆玉
米淀粉分支酶（sbe2a）基因片段，以载体 pWGLL 为基础，构建高效反义表达载体，通过花粉管通道法将其导入玉
米自交系铁 7922 中。【结果】获得了 4 株转基因株系，GFP 表达检测、PCR 扩增和 Southern 杂交结果表明，目的
基因已整合到基因组中，且能够遗传。对 4 株转基因植株进行 RT-PCR 和淀粉分支酶活性检测，结果表明转反义
sbe2a 玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制，淀粉分支酶活性明显低于野生型，相差最多的降低 79.4%；直
链淀粉含量也发生明显的变化，最高的提高了 84.3%，且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。
【结论】采用反义
RNA 技术通过沉默内源 sbe2a，可获得高直链淀粉含量的玉米材料。
关键词：玉米；高直链淀粉；反义 RNA；淀粉分支酶基因 sbe2a

Reducing the Maize Amylopectin Content Through
Anti-Sense Manipulation
GUAN Shu-yan, WANG Pei-wu, LIU Guang-na, LIU Hui-jing, ZHAO Li-na
(Biotechnology Center of Jilin Agricultural University, Changchun 130118)

Abstract: 【Objective】 In order to control the biosynthesis process of maize starch and to develop transgenic maize with high
amylase starch content. 【Method】 RT-PCR was employed to clone the maize starch branching enzyme gene sbe2a and high
efficient anti-sense expression vector was constructed based on plant expression plasmid pWGLL. Then the vector was introduced
into maize inbred line Tie7922 by pollen tube pathway. 【Result】 Four transgenic plants were obtained. PCR amplification and
Southern blotting hybridization proved that the sbe2a had integrated into maize genome. RT-PCR and enzyme activity results showed
that both mRNA level of sbe2a and activity of starch branching enzyme decreased significantly in the transgenic plants than that in
the wild type plants and the maximum decrease level of enzyme activity was 79.4%. However the total starch content had no
significant difference between the transgenic plants and the wild type plants, while the content of amylose starch increased by 84.3%
compared to the wild type plants. 【Conclusion】 Anti-sense RNA is an efficient gene silencing method and can be used effectively
in the production of high-amylose maize by silencing endogenesis gene sbe2a.
Key words: maize; high-amylose starch; anti-sense RNA; starch branching enzyme gene sbe2a

电子芯片等行业。玉米高直链淀粉的另一个潜在用途
0 引言是生产光解塑料，用光解塑料取代传统塑料是解决“白
【研究意义】淀粉是玉米籽粒的主要成分，在人色污染”的有效途径[1-3]。目前，生产中使用的直链淀
类生活中占有重要地位。直链淀粉是重要的工业原料，粉主要来自玉米，而从普通玉米中提取直链淀粉成本
用途广泛，涉及到各个领域，如食品、医疗、纺织、很高，导致中国工业所需要的直链淀粉多从美国进口，
造纸、包装、石油、环保、光纤、高度印刷线路板、所以急需加强这一领域的研究。另外，中国的玉米种

收稿日期：2008-11-26；接受日期：2009-03-04
基金项目：国家转基因专项（J99-13-001）、吉林省财政厅项目和吉林农业大学科研启动基金项目（200619）
作者简介：关淑艳（1971－），女，吉林榆树人，副教授，博士研究生，研究方向为生物技术在作物遗传育种中的应用。Tel：13134316758；E-mail：
guanshuyan1971@yahoo.com.cn。通信作者王丕武（1958－），男，吉林蛟河人，教授，研究方向为生物技术在作物遗传育种中的应用。
Tel：0431-84532908；E-mail：peiwuw@yahoo·com·cn

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9期关淑艳等：用反义 RNA 技术创造高直链淀粉玉米材料 3029

质资源中高直链淀粉资源材料（直链淀粉含量达到酶（sbe2a）基因，构建反义表达载体，利用反义技术
50%以上）非常稀少。因此培育高直链淀粉玉米品种，抑制淀粉分支酶 sbe2a 的表达。以期提高直链淀粉的
对于拓展玉米淀粉应用领域，促进玉米产业发展及提含量，获得高直链淀粉含量的玉米材料，开辟高直链
[4-5]
高经济效益具有重要意义。【前人研究进展】淀粉淀粉玉米育种的新途径。
根据分子结构分为直链淀粉和支链淀粉，其合成过程
受到一系列酶的调控。淀粉分支酶是淀粉生物合成过
1 材料与方法
程中的一个关键酶，它催化葡萄糖以 α-1,6 键连接， 1.1 材料
[6-7]
形成分支结构。目前，对淀粉分支酶及其基因已从玉米淀粉分支酶基因来源于糯玉米自交系 W1，由
分子水平和生物化学方面进行了一些研究，淀粉分支吉林农业大学王玉兰教授馈赠；受体材料为玉米骨
[8-9]
酶基因的生理功能基本清楚。淀粉分支酶有 sbe(a) 干自交系铁 7922 、Mo17、030，质粒 pWGLL 均由
和 sbe(b)两大家族，
玉米 sbe 有 3 种同工酶：sbe1、sbe2b 本实验室保存。植物 RNA 提取试剂盒 ConcerTM
主要在胚乳中存在，sbe2a 主要在胚、胚乳、叶片和其 Plant RNA Reagent 和反转录试剂盒购白 Invitrogen 公
它营养组织中存在，它们共同参与支链淀粉的合司，克隆载体 pMD18-T、PCR 扩增试剂盒、限制性
成[10-11]。Gao 等由 sbe2a cDNA 推测的 sbe2a 氨基酸序内切酶、大肠杆菌 DH5α、T4 DNA 连接酶、DNA
列与从玉米胚乳纯化而来的 sbe2a 蛋白序列相吻 Marker 等购自 TaKaRa 和 Promega 公司，尼龙膜、地
[12]
合，而且 sbe2a 的活性大大高于 sbe2b。其中玉米的高辛标记和检测试剂盒购自 Roche 公司。直、支链淀
sbe2a 还可直接参与支链淀粉中短链的合成。Sbe2a 和粉标样购自 Sigma 公司，其它试剂都是国产分析纯产
[13]
sbe2b 功能不能互补。1991 年 Visser 等利用反义品。
RNA 技术，向马铃薯中导入反向连接的基因 gbss，导 1.2 玉米淀粉分支酶基因片段的克隆与序列分析
致 gbss 含量和活性下降，进而导致马铃薯块茎中直链根据已知 sbe2a 的 cDNA 序列（ GenBank ：
淀粉含量锐减。同样利用反义 RNA 技术，在木薯、 U65948）选择 sbe2a 编码区
，（coding seuqence，CDS）
水稻等植物中，也获得了低（或无）直链淀粉的转化内长度为 562 bp 的片段，通过分子生物学分析软件
体[14-16]。国际专利 WO9722703A2 报道了用玉米 sbe2b Primer Premier 5.0[24]（Premier，Canada）设计人工寡
转化玉米的研究，把 sbe2b 的 cDNA 基因或部分片段核苷酸扩增引物，然后，用植物 RNA 提取试剂盒提
正向或反向置于玉米 zein 蛋白启动子（胚乳特异启动取糯玉米自交系 W1 总 RNA，反转录得到 cDNA，以
子）下构建一系列植物表达载体，转化玉米，获得了反转录的 cDNA 为模版进行 PCR 扩增，所设计的引物
[17]
转基因植株。柴晓杰等成功地克隆并构建了 sbe2b 如下（画线部分为上游和下游引物加入的酶切位点
的反义表达载体，通过花粉管通道法成功地导入玉米 XbaⅠ和 ApaⅠ）：
自交系；利用反义 RNA 技术有效地调控了玉米淀粉 P1 上游引物：5′-CTCCTCTAGACGTGTAAAG
的合成途径，使支链淀粉的合成受到抑制，在总淀粉 ATACGGATGGAC-3′
含量基本不变的情况下，极大提高了直链淀粉的含 P1 下游引物：5′-TATAGGGCCCATAGGCGAGA
[18]
量。本研究切入点】
【由于反义 RNA
（antisense RNA， ATCCCACAT-3′。PCR 产物电泳回收后， pMD18-T
与
asRNA）技术提供了直接有效地人为控制基因表达的载体连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α。挑取白斑
[19-21]
方法，现已成为基因工程研究中的一项重要技术。碱裂解法提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定，得到重
反义技术具有专一性调节基因的活动，主要是作用于组克隆。然后送交基因测序公司测序，测序由大连宝
转录水平，可以专一性地调节某一基因的表达，这是生物公司完成，核酸序列分析用 DNASIS（Medprobe，
其它方法难以做到的，必将推动基因调控的研究，对 UK）软件。序列分析结果表明，该片段为 562 bp，与
于应用也将产生深远的影响。反义技术已广泛应用于 GenBank 中报道的序列相比较，有 1 个碱基的差异，
多种动植物基因组研究和代谢途径分析，并且在作物同源性达到 99.8%，可以肯定克隆到的序列就是玉米
改良中也得到了成功的应用，特别是在改良玉米淀粉淀粉分支酶基因片段。562 bp 的序列如下：
方面得到广泛应用，但在利用 sbe2a 改变玉米淀粉组 ATAGGCGAGA ATCCCACATCCAATGATGGC
[22-23]
成方面的应用研究却鲜有报道。【拟解决的关键 CTCGTGGACC ACCATGGAAG TAAT
问题】本研究利用基因工程技术，克隆玉米淀粉分支 GTGTACGGTGCCATCGAAACCATTC AAACC


3030 中国农业科学 42 卷

ATCCA AGGTATTATT TGATGAATGA CTA 采用改良的碱裂解法大量提取质粒[25]，制备浓度
TGAACAA TATCCATAAG CACTAGCAAG CC 为 500～1 000 µg·ml-1 的 DNA 导入液。当受体玉米自
AAGCTCAT GCGCTTTATC AATAAGAGAT T 交系铁 7922、Mo17、030 自花授粉 8～12 h 后，切去
TTAGGTCCT CTGGAGTCCC AAAACGGCTA 花柱，将 DNA 导入液滴于切口，迅速套袋，1 h 后复
CTTGGGGCAA AAAAATTCGT AACATGGTA 滴 1 次。同时以不含 DNA 的等量 SSC 溶液按同样处
C CCAAAGCTTG CATAATAAGA GTGTTCCT 理作对照。
GG ATTGCCATTA TCTGTACTGC ATTGTATC 1.5 转基因植株的筛选
CA AGCTTTTTAATTCTTGGAAG CACCTCAT 在反义表达载体 Actin 启动子的下游有荧光蛋白
CT CTGAAGTTAG CATATGTATT TATCTTTG GFP 基因，所以对 T1 代的转化植株取其叶片，用荧光
GT TCCGGGCTAC TCATTCCAAC ATGTGATT 显微镜进行 GFP 的检测，对有荧光现象的 T1 代植株
CA TATATCCGCA GTGACTTGGG CCGCTTA 取叶片，用改良的 CTAB 法提取 DNA[25]。按表达载
GGT TGAGGGTGTT TGAATACATA TTTCTC 体上的潮霉素序列设计引物，P2 上游：5'-GGTTTCC
CTCT TCAGGTGGGT CATAATATAT ACCGTT ACTATCGGCGAG-3' 下游： 5'-GGCGAAGAATCTC
GTAT GGTATTTCAC CTGGAGCCTG CACAG GTGCT-3'进行 PCR 扩增，初步筛选得到转基因株系，
AAAAC TTGATCCAGG CAGGAATGGAATCC 然后对 PCR 检测为阳性的植株，提取基因组 DNA，
TTAACA CCAGATGGTGTGTCCATCCG TATC 将其经 BamHⅠ酶消化后用 0.8%的琼脂糖凝胶进行分
TTTACA 离，再用 20×SSC 转移到尼龙膜，80℃固定 2 h 后与
1.3 反义表达载体的构建探针杂交。以载体上的潮霉素的 PCR 扩增片段（900
玉米淀粉分支酶基因反义表达载体 pWGLL- bp）经 DIG 标记后作为探针进行杂交。采用地高辛标
SBEⅡa 构建的流程，如图 1 所示。将上述含有淀粉分记和检测试剂盒进行探针标记、杂交和显色处理。
支酶基因（sbe2a）的克隆质粒 pMD18-T-SBEⅡa 经 1.6 转基因植株的 RT-PCR 分析
ApaⅠ和 XbaⅠ双酶切，回收目的片段。
将载体 pWGLL 取 T1 代淀粉分支酶活性下降的转基因植株授粉
作同样的双酶切，回收大片段与目的片段连接转化 20 d 的籽粒，用 RNA 提取试剂盒分别提取总 RNA，
E.coli DH5α 感受态细胞，在含卡那霉素（Kan，50 加入 DNAase（无 RNase）去除所提 RNA 中残存的基
-1
µg·ml ）的 LB 固体培养基上培养进行初步筛选，提因组 DNA。用紫外分光光度计对各样品 RNA 进行精
取阳性克隆的质粒进行酶切，获得重组质粒确定量后，用反转录试剂盒转录得到 cDNA 第一链，
pWGLL-SBEⅡa。将 pWGLL-SBEⅡa 转化大肠杆菌在对转基因植株 sbe2a mRNA 积累量检测时，以未转
DH5α 感受态细胞中，筛选出 2 个重组克隆。用小提化植株作为对照，以玉米 EF-1a 为内标。扩增 sbe2a
质粒试剂盒法小量提取质粒，以质粒为模板，再用引以 cDNA 第一链为模板进行 PCR 扩增，上游引物为：
物 P1 进行 PCR 扩增并通过限制性内切酶 ApaⅠ和 5'-CGTGTAAAGATACGGATGG AC-3'，下游引物为：
XbaⅠ进行酶切鉴定，得到一条约 562 bp 的特异带， 5'-ATAGGCGAGAATCCCACAT-3'，预期扩增片段的
表明目的片段确实插入到植物表达载体 pWGLL 的特大小为 562 bp；作为内标的 EF-1 a 基因的上游和下游
异型启动子（Actin 启动子）的下游。引物分别为 5'-GCTTCACGTCCCAGGTCAT C-3'和
1.4 反义表达载体的遗传转化 5'-TAGGCTTGGTGGGTATCATC-3'，扩增片段长度为
213 bp[26]。PCR 反应参数为：94℃预变性 5 min；94℃
30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共 28 次循环；72℃延
伸 10 min。
1.7 转基因植株的淀粉分支酶活性的检测
参照李太贵等[27]的方法进行。
1.7.1 粗酶液的提取分别取授粉 20、25、30 d 的
图1 重组质粒 pWGLL-SBEⅡa 的 T-DNA 区结构图转基因玉米籽粒 5 粒，称重，加入 0.05 mol·L-1 柠檬酸
Fig. 1 The structure map of T-DNA region of expression 缓冲溶液（pH 7.0），在冰浴中研磨匀浆（2 ml 研磨，
vector pWGLL-SBEⅡa 10 ml 洗研钵 2 次）然后在 18 000 r/min 下离心 20 min，
，



上清液即为粗酶液。
1.7.2 淀粉分支酶活性的测定取 1 ml 粗酶液+1 ml
0.2 mol·L-1 柠檬酸缓冲液（pH 7.0）+ 0.5 ml 0.1 mol·L-1
EDTA（振荡，使 α-淀粉酶失活）+0.5 ml 0.75%可溶
性淀粉，摇匀，在 37℃水浴中保温 40 min（加入
10%TCA 4 ml 终止反应，3 000 r/min 离心 8 min），
加 0.3 ml 碘液显色，10 min 后在 660 nm 处测光密度
值（O.D），以零时为对照，淀粉分支酶活性以 OD660
M：DNA 分子量标准（DL-2000）；1～3：PCR 产物；4：对照
下降的百分率表示：∆OD660=（OD660 零时－OD660 t M: DNA marker DL-2000; 1-3: PCR products; 4: Negative control
时）/OD660 零时×100%，最后以 3 次结果的平均值计
算淀粉分支酶活性。图2 玉米淀粉分支酶基因 sbe2a 的分离
1.8 转基因植株淀粉含量的检测
Fig. 2 Isolation of starch branching enzyme gene sbe2a
直链淀粉和支链淀粉含量测定采用何照范 [28] 的
双波长法。直链淀粉含量测定的主波长用 620 nm，参
比波长 480 nm，支链淀粉含量测定的主波长用 550
nm，参比波长 760 nm。以直链、支链淀粉含量之和
为总淀粉含量，最后以 3 次结果的平均值计算直链淀
粉含量。
1.9 转基因植株后代的遗传分析
T1 代套袋自交，从收获单株种子中随机取 20 粒
进行种植，提取单株 DNA 进行 PCR 检测、淀粉分支
酶活性及淀粉含量测定，分析 T2 代植株中外源基因遗 M： DNA 分子量标准（DL-2000） 1,2 ,3：
； pMD18-T-SBEⅡa/ ApaI+XbaⅠ
传。 M: DNA marker DL-2000; 1, 2, 3: pMD18-T-SBEⅡa/ ApaI+XbaⅠ

2 结果与分析图3 重组克隆的酶切鉴定
2.1 淀粉分支酶基因片段的克隆和序列测定 Fig. 3 Restriction enzyme analysis of the recombinant clone
以糯玉米自交系 W1 的 cDNA 为模板，通过引物
P1 进行 PCR 扩增，通过多次改变 PCR 反应条件以提粗略检测（图 4）。图 4 是部分有荧光现象的叶片，
高产物的特异性，最终得出最佳反应条件。扩增产物对有绿色荧光现象的 12 株 T1 代植株中取叶片，用改
在 1%琼脂糖凝胶上电泳，得到约 562 bp 大小，特异良的 CTAB 法提取 DNA，然后以这些植株叶片的总
性强，单一的扩增带，与预期结果一致（图 2）。扩 DNA 为模板，对潮霉素基因进行 PCR 扩增。结果发
增产物回收与载体连接转化大肠杆菌 DH5α，筛选出 5 现，只有 4 株铁 7922 的转化植株得到 900 bp 的特异
个阳性克隆，经酶切分析得到一条约 560 bp 的插入片性扩增条带。取 PCR 阳性铁 7922 的玉米的叶片提取
段，说明该目的片段已插入到载体上（图 3）。经测基因组 DNA，作 Southern 杂交，结果见图 5，图 5 中
序得知克隆的 562 bp 的目的片段与已发表的基因一致 3、4、5、6 泳道均有杂交带，证明外源基因已整合到
（GenBank 登录号：U65948）。基因组中。
2.2 转基因植株的筛选 2.3 转基因植株的 RT-PCR 分析
对用花粉管通道法转化的 T0 代玉米进行室内考提取 T1 代转基因玉米籽粒的总 RNA，以反转录
种，然后次年春天把收获的铁 7922 转化果穗从 10 穗的 cDNA 为模板，玉米淀粉分支酶基因片段（562 bp）
中每穗取 100 粒共 1 000 粒种植 40 行，Mo17 和 030 引物做 28 个和 30 个循环的 RT-PCR，同时以玉米
分别从 5 穗中每穗各取 100 粒共 1 000 粒种植 40 行。 EF-1a 作为内标（213 bp） 28 个和 30 个循环的 PCR，
做
当植株长到 5～6 片叶时，每行随机取 10 株共 800 株图中可以看出转基因植株内源 SBE mRNA 的含量下
取其叶片用刀片纵切，在荧光显微镜进行 GFP 基因的降比较明显（图 6）。



1～6：转化植株；7：非转化植株 1-6：Transformed plant; 7: Non- transformed plant

图4 转化植株的玉米叶片在荧光显微镜下的检测
Fig. 4 Fluorescence microscope analysis in transformed maize leaf

法，测定淀粉分支酶的活性。测定结果表明，转基因
玉米的分支酶活性比对照明显降低，说明淀粉分支酶
基因反义表达载体导入一定程度地表达了反义 RNA，
从而抑制了内源性淀粉分支酶 mRNA 的翻译，使淀粉
分支酶活性降低。转基因植株铁 7922-1、铁 7922-2、

1：未转化的植株；2：阳性对照；3～6：转基因植株（铁 7922-1，铁
铁 7922-3、 7922-4 测定 3 次的平均淀粉分支酶活性
铁
7922-2，铁 7922-3，铁 7922-4）的分别为 0.04059、0.03183、0.02005 和 0.03411 U，
1: Non-transgenic plant; 2: Positive control; 3-6: Transgenic plant (Tie
7922-1, Tie 7922-2, Tie 7922-3, Tie 7922-4) 对照的淀粉分支酶活性为 0.09734 U（图 7-a）；淀粉
分支酶活性分别降低了 58.3% 、 67.3% 、 79.4% 和
图5 转基因植株的 Southern 杂交 64.9%，平均降低了 67.5%（P＜0.01）。转基因植株
Fig. 5 Southern blot of transgenic plant 铁 7922-1、铁 7922-2、铁 7922-3、铁 7922-4 的淀粉
含量测定结果显示，总淀粉含量分别约为 670、680、
690 和 680 mg·g-1 DW（籽粒），直链淀粉含量分别为
38.5%、40.8%、51.5%和 43.2%，未转化的植株直链
淀粉含量为 27.9%
（图 7-b）最高比对照提高了 84.3%，
，
平均提高了 55.9%，平均比对照提高到了 1.6 倍，和
对照比差异显著（P＜0.05)。
2.5 转基因植株 T2 代遗传分析
2.5.1 转基因植株 T2 代 PCR 分析从收获的 T1 代转
基因铁 7922-1、铁 7922-2、铁 7922-3、铁 7922-4 株
系的单株种子中分别随机取 20 粒进行种植，提取单株
M：DNA marker DL-2000；1～4：转基因植株（铁 7922-1，铁 7922-2， DNA 进行 PCR 检测，转基因植株 T2 代的 PCR 结果
铁 7922-3，铁 7922-4）；5：未转化的植株表明，外源基因转基因后代中能够遗传（表），其分
M: DNA marker DL-2000; 1-4: Transgenic plant (Tie 7922-1，Tie 7922-2，
Tie 7922-3，Tie 7922-4); 5: Non-transgenic plant 离比基本符合孟德尔遗传规律。
2.5.2 转基因植株 T2 代的淀粉分支酶活性和淀粉含
图6 转基因植株的 RT-PCR 检测量分析对上述 T1 代铁 7922-1、 7922-2、 7922-3、
铁铁
Fig. 6 RT–PCR analysis of transgenic plants 铁 7922-4 株系中的 4 株内源 SBE mRNA 的含量下降
的株系铁 7922-1-1、铁 7922-2-1、铁 7922-3-1、铁
2.4 转基因植株 T1 代的淀粉分支酶活性和淀粉含量 7922-4-1 进行淀粉分支酶活性和淀粉含量分析，转基
分析因 T2 代植株的淀粉分支酶活性的分别为 0.04795、
取 T1 代授粉 20、 30 d 的转基因玉米铁 7922-1、
25、 0.03425、0.02257 和 0.03605U，对照的淀粉分支酶活
铁 7922-2、 7922-3、 7922-4 籽粒， 0.05 mol·L-1
铁铁用性为 0.1123U（图 8-a）；淀粉分支酶活性分别降低了
的柠檬酸缓冲液提取粗酶液，参照李太贵等 [27] 的方 57.3%、69.5%、79.9%、67.9%，平均降低了 68.7%（P



1～4：转基因植株（铁 7922-1，铁 7922-2，铁 7922-3，铁 7922-4）；5：未转化的植株
1-4: Transgenic plant (Tie 7922-1, Tie 7922-2, Tie 7922-3, Tie 7922-4); 5: Non-transgenic plant

图7 转基因植株 T1 代淀粉分支酶活性和籽粒中直链淀粉含量
Fig. 7 SBE activity and amylose contents in kernels of transgenic T1 plants

表转基因植株 T2 代 PCR 分析
Table Genetic analysis of T2 transgenic plants
T2 代穗行种子数出苗数 PCR 阳性株数 PCR 阴性株数阳性数/阴性数
T2 line Seed No· of T2 No· of seedlings Positive plant No· of PCR Negative plants No· of PCR Positive/ negative
Line 1 20 20 15 5 3.0﹕1

Line 2 20 19 14 5 2.8﹕1

Line 3 20 17 13 4 3.2﹕1

Line 4 20 18 14 4 3.5﹕1

＜0.01）。转基因植株铁 7922-1-1、铁 7922-2-1、铁 41.8%、51.3%和 42.5%，未转化的植株直链淀粉含量
7922-3-1、铁 7922-4-1 的淀粉含量测定，结果显示，为 28.7%（图 8-b），最高比对照提高了 78.7%，平均
-1
总淀粉含量分别约为 680、690、710 和 690 mg·g DW 提高了 50.8 %，平均比对照提高到了 1.5 倍，和对照
（籽粒），转基因植株的直链淀粉含量分别为 37.5%、比差异显著（P＜0.05）。

1～4：转基因植株（铁 7922-1-1、铁 7922-2-1、铁 7922-3-1、铁 7922-4-1）；5：未转化的植株
1-4: Transgenic plant (Tie 7922-1-1，Tie 7922-2-1，Tie 7922-3-1，Tie 7922-4-1); 5: Non-transgenic plant

图8 转基因植株 T2 代淀粉分支酶活性和籽粒中直链淀粉含量
Fig. 8 SBE activity and amylose contents in kernels of transgenic T2 plant



以上结果表明， 2 和 T1 代的淀粉分支酶活性和淀
T 将部分 sbe2a 片段反向插入植物表达载体导入玉
粉含量无显著变化，初步表明外源基因在转基因玉米米，经转录后与靶 RNA 进行碱基配对结合的方式参
后代中能够遗传。关于这些转基因材料后代的遗传分与基因表达的调控，进而抑制 sbe2a 表达。采用反义
析，还将进行进一步的研究。 RNA 技术得到了直链淀粉含量高达 51.5%的转基因植
株。反义 RNA 是一种高效的基因沉默手段，有效地
3 讨论调控了玉米淀粉的代谢途径，能够有效抑制靶标基因
反义 RNA 技术是一种调控基因表达的有效技术，表达，通过抑制 sbe2a 表达，有效提高玉米的直链淀
该技术已在植物基因工程研究中得到了广泛的应用。粉含量。
玉米淀粉分支酶有 3 种同工酶，sbe1、sbe2b 和 sbe2a，
它们共同参与支链淀粉的合成。sbe2b 和 sbe2a 对胚乳 References
直链淀粉含量的作用最大，其编码基因的突变（玉米 [1] 郭志鸿, 张金文, 王蒂, 陈正华. 用 RNA 干扰技术创造高直链

ae 突变体）可使玉米胚乳中直链淀粉的含量达到淀粉马铃薯材料. 中国农业科学, 2008, 41(2): 494-501.

51.5%。用常规育种方法来改良胚乳性状不但时间长， Guo Z H, Zhang J W, Wang D, Chen Z H. Using RNAi technology to
[30]
而且引起淀粉总含量的减少和产量降低。 produce high-amylose potato plants. Scientia Agricultura Sinica, 2008,

反义技术能在不破坏目的基因的前提下调控基因 41(2): 494-501. (in Chinese)

的表达，因此，它既是阐明基因功能的一种新手段，又 [2] Visser R G F, Jacobsen E. Towards modifying plants for altered starch

拓宽了通过基因工程改良动、植物品质和治疗疾病的 content and composition. Trends in Biotechnology, 1993, 11: 63-68.

途径。适当地应用反义 RNA 技术可以封闭某一特定 [3] Smith A M, Denyer K, Martin C. The synthesis of the starch granule.

基因的表达，人为地模拟基因的点突变，因而使该项 Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,

技术具有极广泛的应用前景。总之，反义 RNA 作为 1997, 48: 67-87.

分子生物学与基因工程一个热点，将在基础与应用研 [4] 柴晓杰, 王丕武, 关淑艳, 徐亚维. 应用 RNA 干扰技术降低玉米
[28]
究中开辟一个新的领域。已有研究证明，将反义蜡支链淀粉含量. 植物生理与分子生物学学报, 2005, 31(6): 625-630.

质基因导入水稻可明显降低转基因水稻种子的直链淀 Chai X J, Wang P W, Guan S Y, Xu Y W. Reducing the maize

粉含量。目前采用反义蜡质基因成功实现降低稻米直 amylopectin content through RNA interference manipulation. Journal
[31]
链淀粉含量的研究。本研究通过基因工程手段，克 of Plant Physiology and Molecular Biology, 2005, 31(6): 625-630. (in

隆并构建了 sbe2a 的反义基因表达载体，通过花粉管 Chinese)

通道法成功地导入玉米自交系。对转基因植株的 T1、 [5] Casey J, Slattery I, Kavakli H, Okita T W. Engineering starch for

T2 代检测结果显示，获得的转基因植株其淀粉分支酶 increased quantity and quality. Trends in Plant Science, 2000, 5(7):

活性比对照有明显下降，分别降低了 58.3%、67.3%、 291-298.

79.4%、64.9%和 57.3%、69.5%、79.9%、67.9%，说 [6] Clarke B R, Denyer K, Jenner C F, Smith A M. The Relationship

明构建的反义表达载体有效地表达了反义 RNA，抑制 between the rate of starch synthesis, the adenosine 5′-

了内源性淀粉分支酶 mRNA 的翻译，使淀粉分支酶活 diphosphoglucose concentration and the amylose content of starch in

性最大降低了 79.9%。而直链淀粉的含量却有明显的 developing pea embryos. Planta, 1999, 209: 324-329.

提高，最多提高了 84.3%。说明利用反义 RNA 技术能 [7] Denyer K, Johnson P. The control of amylose synthesis. Plant

够有效地调控玉米淀粉的合成途径，使支链淀粉的合 Physiology, 2001, 158: 479-487.

成受到抑制，在总淀粉含量基本不变的情况下，极大 [8] Ball S, Mhbjw V, Isser R. Progress in understanding the biosynthesis

提高了直链淀粉的含量，对转化的高直链淀粉玉米植 of amylose. Trends in Plant Science, 1998, 3: 462-467.

株进行纯化，得到高直链淀粉玉米自交系。利用抗性 [9] Nakamura T, Vrinten P, Hayakawa K. Characterization of a

好的转基因高直链淀粉株系和 ae 自交系进行基因聚 granule-bound starch synthase isoform found in the pericarp of wheat.

合，选育出高直链淀粉玉米杂交种，为玉米高直链淀 Plant Physiology, 1998, 118: 125-132.

粉的改良提供了新途径。 [10] Blauth S L, Yuan Y, Klucinec J D, Shannon J C, Thompson D,

Guilitinan M. Identification of mutator insertional mutants of
4 结论 starch-branching enzyme 2a in corn. Plant Physiology, 2001, 125:



1396-1405. Characterization of T-DNA insertion mutants and RNAi silenced

[11] Blauth S L, Kimk N, Klucinec J. Identification of mutator insertional plants of Arabidopsis thaliana UV-damaged DNA binding protein 2

mutants of starch-branching enzyme (sbe1) in Zea mays L. Plant (AtUV-DDB2). Plant Molecular Biology, 2006, 4: 227-240.

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[22] Koga A, Ishibashi T, Kimura S, Uchiyama Y, Sakaguchi K. （责任编辑于竞，孙雷心）


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