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Listerien in Lebensmitteln in Österreich




Dr. Ariane Pietzka
Leiterin Nationales Referenzlabor für Listerien
Zentrum für lebensmittelbedingte Infektionskrankheiten / Institut für medizinische
Mikrobiologie und Hygiene
Listerien-Referenzlabor: Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis?
Graz, 19.Oktober 2012
www.ages.at              Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH
Was sind Listerien?

• Stäbchenförmige Bakterien
• Größe: 0.4 x 1-1.5 µm
• Grampositiv
• nicht-sporenbildend                   Listeria monocytogenes



• fakultativ anaerob
• Benannt nach britischem Chirurgen
 Joseph Lister (1827 –1912)

                                             Joseph Lister




www.ages.at                           Bildquellen: Wikimedia Commons
Was sind Listerien?
• Bekannte Species:
       - L. fleischmannii
       - L. grayi
             o L. murrayi
       - L. innocua
       - L. ivanovii
             o L. ivanovii subspec. ivanovii
             o L. ivanovii subspec. londoniensis
       - L. monocytogenes - pathogen für Mensch und Tier
             o 13 Serotypen (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, [4ab], 4c, 4d,
               4e, 7)
               3a, 3b, 3c, 4a, 4c ,4d, 4e, 7  sehr selten in LM, selten Listeriose
               verursachend
       - L. marthii
       - L. rocourtiae
       - L. seeligeri
       - L. welshimeri
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Besonderheiten / Eigenschaften
von Listerien?
• Verursachen Listeriose
• Risikogruppen:
      - Immunsupprimierte (Vorerkrankungen)
      - Schwangere
      - Ältere
• Aufnahme v.a. durch verzehrfertige Produkte – kein Erhitzen vor dem
  Essen
       -   z.B.:
       -   Geräucherter Fisch, Meeresfrüchte
       -   Salat (bereits gewaschen / geschnitten)
       -   Käse
       -   Rohwurstprodukte
       -   Speiseeis
• Möglichkeiten der Kontamination des Lebensmittels:
    - Rohmaterial
    - Gesamter Herstellungsprozess (Reifung, Schlachtung,
      Schneidemaschinen, Gerätschaften,…)
    - Verpackung des Produkts
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Besonderheiten / Eigenschaften
von Listerien?
• Sehr anspruchslos
       - Sauerstoffanspruch: aerob bis mikroaerophil, Vermehrung unter
         Vakuum und modifizierter Atmosphäre möglich
       - Vermehrung auch bei Kühlschranktemperatur
       - Fähigkeit zur Biofilmbildung auf rostfreien Stahloberflächen, Böden,
         Kühlräumen,…

• Vorkommen: ubiquitär (Boden, Pflanzen, Kompost, Silage,
  Abwässer, Kot von Haus- und Nutztieren,…)
• Befall führt nicht zum Verderb von Lebensmitteln
       - Aussehen und Geruch des Lebensmittels bleibt unverändert




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Lebensmittelsicherheit

 • Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien
   für Lebensmittel
   - gültig für Listeria monocytogenes

 Lebensmittelkategorie                            Grenzwerte      Stufe, für die das Kriterium gilt

 Verzehrfertige Lebensmittel für Säuglinge oder   In 25 g nicht   In Verkehr gebrachte Erzeugnisse
 für med. Zwecke                                  nachweisbar     während der Haltbarkeitsdauer
                                                  (n=10)
 Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für    In 25 g nicht   Bevor das Lebensmittel die unmittelbare
 Säuglinge und für med. Zwecke), die die          nachweisbar     Kontrolle des Lebensmittelunternehmers
 Vermehrung von L. monocytogenes                  (n=5)           (Hersteller) verlassen hat
 begünstigen können
                                                  100 KBE/g       In Verkehr gebrachte Erzeugnisse
                                                  (n=5)           während der Haltbarkeitsdauer

 Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für    100 KBE/g       In Verkehr gebrachte Erzeugnisse
 Säuglinge und für med. Zwecke), die die          (n=5)           während der Haltbarkeitsdauer
 Vermehrung von L. monocytogenes nicht
 begünstigen können



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LMSVG Lebensmittelsicherheits-
und Verbraucherschutzgesetz
• LMSVG §38 Abs.6 Pflichten der Unternehmer
      - Im Rahmen der Eigenkontrolle betreffend das Vorliegen
        von Zoonosen und Zoonoseerregern…,… die Isolate dem
        gemäß §75 zuständigen Referenzlabor zu übermitteln
        oder deren unverzügliche Übermittlung durch das
        untersuchende Labor zu veranlassen.
• LMSVG §74 Pflichten des Labors
      - Labors die im Rahmen von §38 Abs.1 Z6 das Vorliegen von
        Zoonosen und Zoonosenerregern untersuchen, haben
        Isolate unverzüglich, längstens jedoch binnen zwei
        Tagen, dem gemäß §75 zuständigen Referenzlabor
        anonymisiert und unter Hinweis auf die
        Produktgruppe zu übermitteln
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LMSVG Lebensmittelsicherheits-
und Verbraucherschutzgesetz
• LMSVG §75 Aufgabe des Nationalen Referenzlabors
      - Koordination der Tätigkeiten der Agentur, der
        Untersuchungsanstalten der Länder sowie der gemäß §73
        autorisierten Personen
      - Durchführung von Laborvergleichstests
      - Weiterleitung von Informationen des
        Gemeinschaftsreferenzlabors (EU-RL) an das BMG, die
        Agentur, die Untersuchungsanstalten sowie an die gemäß
        §73 autorisierten Personen




www.ages.at
Einsendeformular für Listeria
monocytogenes Isolate




                    http://www.ages.at/ages/ueber-uns/oeffentliche-
                      gesundheit/referenzzentralen/rl-listerien/



www.ages.at
Listerien in Lebensmitteln
• Betroffene Lebensmittel:
     - Rohes Fleisch, Rohwurst,
       Rohmilch, Käse, (Räucher)-Fisch,
       Fleisch- und Geflügelerzeugnisse,
       Frischgemüse, Ready-to-eat
       Salate,…
• Österreich 2012: 239 Isolate                              Sonstige LM
 (Zeitraum Juli-September)                            OLB
                                                              ~9%                   Fleisch, Wurst
                                                                                        ~ 47 %
     - 112 Fleisch/Wurst Isolate                      ~9%
     - 45 Fisch, Meeresfrüchte,             Salat, Gemüse
       Umfeldproben Fisch-Schlachtung           ~1%
     - 35 Frischkäse, Milch, Schnittkäse,
       Käseschmierwasser                     Käse
     - 3 Salat, Gemüse (RTE,                 ~ 15 %
       Fertigprodukte)
     - 22 Oberflächen (OLB),
       Wischproben
     - 22 sonstige (Lebensmittel, nicht
       genau definiert)                                      Fisch, Meeresfrüchte
                                                                    ~ 19 %


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Ablauf am NRL
Als L. monocytogenes identifizierte Isolate:
       -      Serotypisierung (Multiplex-PCR)
              o   Unterscheidung in 4 Serogruppen
       -      inlB -Typisierung
              (High-Resolution Melting (HRM), Sequenzierung)       Wachstum von L. mono auf

              o   Weitere Unterscheidung der PCR-Serogruppen          Rapid L´Mono Agar



       -      Goldstandard:
              Pulsed-Field-Gel-Elektrophorese (PFGE)
              o   Weitere Unterscheidung der inlB – Sequenztypen
•     Pflege der Daten in einer Datenbank (Bionumerics,
      Applied Maths)
•     Versand von Prüfberichten an einsendende Labors
•     Stammsammlung

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Typisierung I

• Serotypisierung mit PCR (Doumith et. al. 2004)
     - 4 Serogruppen L. monocytogenes (lanes 1-10)
              o   1/2a, 3a
              o   1/2b, 3b, 7
              o   1/2c, 3c
              o   4b, 4d, 4e                                                     L. innocua

       - Listeria species (lanes 11-16)                                              L. welshimeri

                                                                                              L. ivanovii
                                                                                                   L. seeligeri




              1/2a 1/2b   1/2c   4b    3a   3b   3c      4d   4e   7   4a   4c



                                      L. monocytogenes

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Serotypisierung (PCR)
Verteilung der PCR-Serogruppen innerhalb verschiedener Produktgruppen:

                   Fleisch, Wurst                                     Fisch, Meeresfrüchte



              5%   3%
                                                                      7%

        23%                                                    20%                                 1/2a, 3a
                                          1/2a, 3a
                                                                                                   1/2c, 3c
                                          1/2c, 3c
                                                                                                   4b, 4d, 4e
                                          4b, 4d, 4e
                                                                                                   1/2b, 3b, 7
                                          1/2b, 3b, 7
                                                               2%
                                    69%                                                      71%




                                                        Käse




                                                                18%


                                                                      1/2a, 3a

                                                                      1/2b, 3b, 7




                                    82%



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Typisierung II:inlB-Sequenztypen
 High-Resolution Melting (HRM)




www.ages.at
High-Resolution Melting
   • inlB: Genabschnitt mit Serotyp-spezifischen Unterschieden in der
   DNA-Sequenz

   • Unterschiede in der DNA-Sequenz führen zu verschiedenen
   Schmelzkurven beim High-Resolution-Melting

                                       Virulenzgen: inlB (Internalin B)
                                                                                                                                     Forward Primer
                                                                       inlB-F


                                                                                                    339


                                 343                           351                                  359




                                                                                                                500 bp PCR-Produkt
  Codons mit                                       367         371   373                                  380
Punktmutationen
    (SNP´s)                                  386 387     390         393              396 397 398         400


                       401       403                     410   411                          417


                       421 422              426 427                             435                 439


                       441               445 446                                455       457       459


                                            466          470               inlB-R



                                                                                                                                     Reverse Primer
   www.ages.at    inlB Sequenz (Accession Nr.: NC 012488) L. monocytogenes 4b
High-Resolution Melting
       Amplification (PCR)                                   High Resolution Melting
              Amplification Curves                                       Melting Curves




                                                                                                      Normalization


                                                                   Normalized Melting Curves




                                                                                                      Temperature-
                                                                                                         Shift
  Normalized and Temp-Shifted Difference Plot                 Normalized and Shifted Melting Curves


                                           Difference Plot




www.ages.at
High-Resolution Melting




Difference Plot:
18 verschiedenen inlB–Sequenztypen (ST) von 192 L. monocytogenes Isolaten
Fünf phylogenetische Gruppen (PG)
Serotypen: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4d, 4e, und 7
Basislinie: inlB ST-2

www.ages.at
High-Resolution Melting
  Verteilung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten:

                inlB ‐Sequenztypen bei Isolaten aus Fleisch/Wurst
                                                          inlB‐ST 19
  1/2b, 3b, 7                                                 1%
     3%                                                                inlB‐ST 21
                                                                           6%
4b, 4d, 4e                                          inlB‐ST 16
   5%                                                   4%                          inlB‐ST 7
                                                                                       14%
                                             inlB‐ST 15
                                     1/2a, 3a 19%
                                       69%
1/2c, 3c
  22%
                                              inlB‐ST 13
                                                  1%
                                                                              inlB‐ST 8
                                                   inlB‐ST 12
                                                                                17%
                                                      2% inlB‐ST 9
                                                              6%




  www.ages.at
Typisierung III: Pulsed-Field-Gel-
Elektrophorese
• Genetischer Fingerprint
• Schnitt des gesamten Genoms mit 2
  Restriktionsenzymen
       - AscI
       - ApaI
• Vergleich der Muster mit eigener Datenbank
  (Bionumerics, Applied Maths)
       - Abgleich mit Humanisolaten




www.ages.at
Pulsed-Field Gelelektrophorese
  Unterscheidung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten:

                                                                    3 PFGE-Muster
                                                       inlB‐ST 19
   1/2b, 3b, 7                                             1%
                                                                     inlB‐ST 21           9 PFGE-Muster
      3%
                                             inlB‐ST 16                  6%
4b, 4d, 4e                                       4%
                               4 PFGE-Muster                                      inlB‐ST 7
   5%
                                                                                     14%
                                          inlB‐ST 15
                               1/2a, 3a      19%
                                 69%
1/2c, 3c
  22%                                 inlB‐ST 13
                                          1%
                                            inlB‐ST 12                      inlB‐ST 8
                                                2% inlB‐ST 9                  17%
                                                       6%
                                                                                         1 PFGE-Muster

                                                  3 PFGE-Muster


  www.ages.at
Akademischer Luxus oder Public
Health Erfordernis?
• „Multinationaler Listerioseausbruch“ 2009/2010
                                                   Foto: AGES




www.ages.at
Listerioseausbruch 2009/2010
verursacht durch „Quargel“

               Produktrückruf: 23. Januar 2010

               66 L. monocytogenes Isolate aus Quargel untersucht:
                  - Klon 1: 2 Isolate
                  - Klon 2: 64 Isolate




                       Ende November 2009:
                       Wechsel der Schutzkultur



www.ages.at
Listerioseausbruch 2009/2010
 verursacht durch „Quargel“

               PFGE_AscI                       PFGE_ApaI
                                                                Patientenisolat      Serotyp 1/2a
Klon I                                                          Isolat aus Quargel   inlB-ST 15


               14 Patientenisolate

                           -12 aus Österreich (davon 3 †)
                           - 2 aus Deutschland (davon 2 †)


               PFGE_AscI                       PFGE_ApaI
                                                                Patientenisolat      Serotyp 1/2a
Klon II                                                         Isolat aus Quargel   inlB-ST 9


               20 Patientenisolate

                           -13 aus Österreich (davon 2 †)
                           - 6 aus Deutschland (davon 1 †)
                           - 1 aus der Tschechischen Republik
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Listerioseausbruch 2009/2010
verursacht durch „Quargel“
• Dezember 2009: Kassabons der Patienten werden gesammelt
       - Hinweis auf Quargelkauf bei 3 von 7 Patienten
       - Regelmäßiger Quargelkonsum bei 8 von 9 befragten Patienten
       - Fall-Kontroll-Studie ergab eindeutigen Zusammenhang
• Molekulare Subtypisierung bestätigt epidemiologische
  Untersuchungen – liefert Nachweis für Quargel als Verursacher
  des multinationalen Listerioseausbruchs
• Zusammenhang Klon I/ Klon II identifiziert




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Akademischer Luxus oder Public
Health Erfordernis?
• Aufgaben des NRL´s:
• Abklärung epidemiologischer Fragen auf nationaler /
  internationaler Ebene - Datenweitergabe
       - Seit Januar 2012: Pro Quartal – Abgleich der Typisierungen von
         Patientenisolaten mit Lebensmittelisolaten
              o   Regelmäßige Überwachung gewährleistet
              o   Schnellere Reaktion im Fall eines Ausbruchs
• Gewährleistung eines raschen Datenaustauschs mit
  Nachbarländern
• Internationaler Methodenabgleich mit EU-RL
• Führen einer Stammsammlung
• Nationale Referenzlabor für Listeria monocytogenes
   Public Health Erfordernis
www.ages.at
Danke!
Core Unit Molekularbiologie Wien
 Werner Ruppitsch
 Anna Stöger
Lebensmittelmikrobiologie Graz
 Sigrid Fleck
 Kathrin Hauser
 Silke Konrath
 Andrea Kormann-Klement
 Claudia Schlagenhaufen
 Hildegard Stangl
Referenzlabor Graz
 Manuela Fest
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 Birgit Moik
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„Listerien in Lebensmitteln in Österreich“ – Ariane PIETZKA (AGES Graz)

  • 1. Listerien in Lebensmitteln in Österreich Dr. Ariane Pietzka Leiterin Nationales Referenzlabor für Listerien Zentrum für lebensmittelbedingte Infektionskrankheiten / Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Listerien-Referenzlabor: Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis? Graz, 19.Oktober 2012 www.ages.at Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH
  • 2. Was sind Listerien? • Stäbchenförmige Bakterien • Größe: 0.4 x 1-1.5 µm • Grampositiv • nicht-sporenbildend Listeria monocytogenes • fakultativ anaerob • Benannt nach britischem Chirurgen Joseph Lister (1827 –1912) Joseph Lister www.ages.at Bildquellen: Wikimedia Commons
  • 3. Was sind Listerien? • Bekannte Species: - L. fleischmannii - L. grayi o L. murrayi - L. innocua - L. ivanovii o L. ivanovii subspec. ivanovii o L. ivanovii subspec. londoniensis - L. monocytogenes - pathogen für Mensch und Tier o 13 Serotypen (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, [4ab], 4c, 4d, 4e, 7) 3a, 3b, 3c, 4a, 4c ,4d, 4e, 7  sehr selten in LM, selten Listeriose verursachend - L. marthii - L. rocourtiae - L. seeligeri - L. welshimeri www.ages.at
  • 4. Besonderheiten / Eigenschaften von Listerien? • Verursachen Listeriose • Risikogruppen: - Immunsupprimierte (Vorerkrankungen) - Schwangere - Ältere • Aufnahme v.a. durch verzehrfertige Produkte – kein Erhitzen vor dem Essen - z.B.: - Geräucherter Fisch, Meeresfrüchte - Salat (bereits gewaschen / geschnitten) - Käse - Rohwurstprodukte - Speiseeis • Möglichkeiten der Kontamination des Lebensmittels: - Rohmaterial - Gesamter Herstellungsprozess (Reifung, Schlachtung, Schneidemaschinen, Gerätschaften,…) - Verpackung des Produkts www.ages.at
  • 5. Besonderheiten / Eigenschaften von Listerien? • Sehr anspruchslos - Sauerstoffanspruch: aerob bis mikroaerophil, Vermehrung unter Vakuum und modifizierter Atmosphäre möglich - Vermehrung auch bei Kühlschranktemperatur - Fähigkeit zur Biofilmbildung auf rostfreien Stahloberflächen, Böden, Kühlräumen,… • Vorkommen: ubiquitär (Boden, Pflanzen, Kompost, Silage, Abwässer, Kot von Haus- und Nutztieren,…) • Befall führt nicht zum Verderb von Lebensmitteln - Aussehen und Geruch des Lebensmittels bleibt unverändert www.ages.at
  • 6. Lebensmittelsicherheit • Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel - gültig für Listeria monocytogenes Lebensmittelkategorie Grenzwerte Stufe, für die das Kriterium gilt Verzehrfertige Lebensmittel für Säuglinge oder In 25 g nicht In Verkehr gebrachte Erzeugnisse für med. Zwecke nachweisbar während der Haltbarkeitsdauer (n=10) Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für In 25 g nicht Bevor das Lebensmittel die unmittelbare Säuglinge und für med. Zwecke), die die nachweisbar Kontrolle des Lebensmittelunternehmers Vermehrung von L. monocytogenes (n=5) (Hersteller) verlassen hat begünstigen können 100 KBE/g In Verkehr gebrachte Erzeugnisse (n=5) während der Haltbarkeitsdauer Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für 100 KBE/g In Verkehr gebrachte Erzeugnisse Säuglinge und für med. Zwecke), die die (n=5) während der Haltbarkeitsdauer Vermehrung von L. monocytogenes nicht begünstigen können www.ages.at
  • 7. LMSVG Lebensmittelsicherheits- und Verbraucherschutzgesetz • LMSVG §38 Abs.6 Pflichten der Unternehmer - Im Rahmen der Eigenkontrolle betreffend das Vorliegen von Zoonosen und Zoonoseerregern…,… die Isolate dem gemäß §75 zuständigen Referenzlabor zu übermitteln oder deren unverzügliche Übermittlung durch das untersuchende Labor zu veranlassen. • LMSVG §74 Pflichten des Labors - Labors die im Rahmen von §38 Abs.1 Z6 das Vorliegen von Zoonosen und Zoonosenerregern untersuchen, haben Isolate unverzüglich, längstens jedoch binnen zwei Tagen, dem gemäß §75 zuständigen Referenzlabor anonymisiert und unter Hinweis auf die Produktgruppe zu übermitteln www.ages.at
  • 8. LMSVG Lebensmittelsicherheits- und Verbraucherschutzgesetz • LMSVG §75 Aufgabe des Nationalen Referenzlabors - Koordination der Tätigkeiten der Agentur, der Untersuchungsanstalten der Länder sowie der gemäß §73 autorisierten Personen - Durchführung von Laborvergleichstests - Weiterleitung von Informationen des Gemeinschaftsreferenzlabors (EU-RL) an das BMG, die Agentur, die Untersuchungsanstalten sowie an die gemäß §73 autorisierten Personen www.ages.at
  • 9. Einsendeformular für Listeria monocytogenes Isolate http://www.ages.at/ages/ueber-uns/oeffentliche- gesundheit/referenzzentralen/rl-listerien/ www.ages.at
  • 10. Listerien in Lebensmitteln • Betroffene Lebensmittel: - Rohes Fleisch, Rohwurst, Rohmilch, Käse, (Räucher)-Fisch, Fleisch- und Geflügelerzeugnisse, Frischgemüse, Ready-to-eat Salate,… • Österreich 2012: 239 Isolate Sonstige LM (Zeitraum Juli-September) OLB ~9% Fleisch, Wurst ~ 47 % - 112 Fleisch/Wurst Isolate ~9% - 45 Fisch, Meeresfrüchte, Salat, Gemüse Umfeldproben Fisch-Schlachtung ~1% - 35 Frischkäse, Milch, Schnittkäse, Käseschmierwasser Käse - 3 Salat, Gemüse (RTE, ~ 15 % Fertigprodukte) - 22 Oberflächen (OLB), Wischproben - 22 sonstige (Lebensmittel, nicht genau definiert) Fisch, Meeresfrüchte ~ 19 % www.ages.at
  • 11. Ablauf am NRL Als L. monocytogenes identifizierte Isolate: - Serotypisierung (Multiplex-PCR) o Unterscheidung in 4 Serogruppen - inlB -Typisierung (High-Resolution Melting (HRM), Sequenzierung) Wachstum von L. mono auf o Weitere Unterscheidung der PCR-Serogruppen Rapid L´Mono Agar - Goldstandard: Pulsed-Field-Gel-Elektrophorese (PFGE) o Weitere Unterscheidung der inlB – Sequenztypen • Pflege der Daten in einer Datenbank (Bionumerics, Applied Maths) • Versand von Prüfberichten an einsendende Labors • Stammsammlung www.ages.at
  • 12. Typisierung I • Serotypisierung mit PCR (Doumith et. al. 2004) - 4 Serogruppen L. monocytogenes (lanes 1-10) o 1/2a, 3a o 1/2b, 3b, 7 o 1/2c, 3c o 4b, 4d, 4e L. innocua - Listeria species (lanes 11-16) L. welshimeri L. ivanovii L. seeligeri 1/2a 1/2b 1/2c 4b 3a 3b 3c 4d 4e 7 4a 4c L. monocytogenes www.ages.at
  • 13. Serotypisierung (PCR) Verteilung der PCR-Serogruppen innerhalb verschiedener Produktgruppen: Fleisch, Wurst Fisch, Meeresfrüchte 5% 3% 7% 23% 20% 1/2a, 3a 1/2a, 3a 1/2c, 3c 1/2c, 3c 4b, 4d, 4e 4b, 4d, 4e 1/2b, 3b, 7 1/2b, 3b, 7 2% 69% 71% Käse 18% 1/2a, 3a 1/2b, 3b, 7 82% www.ages.at
  • 15. High-Resolution Melting • inlB: Genabschnitt mit Serotyp-spezifischen Unterschieden in der DNA-Sequenz • Unterschiede in der DNA-Sequenz führen zu verschiedenen Schmelzkurven beim High-Resolution-Melting Virulenzgen: inlB (Internalin B) Forward Primer inlB-F 339 343 351 359 500 bp PCR-Produkt Codons mit 367 371 373 380 Punktmutationen (SNP´s) 386 387 390 393 396 397 398 400 401 403 410 411 417 421 422 426 427 435 439 441 445 446 455 457 459 466 470 inlB-R Reverse Primer www.ages.at inlB Sequenz (Accession Nr.: NC 012488) L. monocytogenes 4b
  • 16. High-Resolution Melting Amplification (PCR) High Resolution Melting Amplification Curves Melting Curves Normalization Normalized Melting Curves Temperature- Shift Normalized and Temp-Shifted Difference Plot Normalized and Shifted Melting Curves Difference Plot www.ages.at
  • 17. High-Resolution Melting Difference Plot: 18 verschiedenen inlB–Sequenztypen (ST) von 192 L. monocytogenes Isolaten Fünf phylogenetische Gruppen (PG) Serotypen: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4d, 4e, und 7 Basislinie: inlB ST-2 www.ages.at
  • 18. High-Resolution Melting Verteilung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten: inlB ‐Sequenztypen bei Isolaten aus Fleisch/Wurst inlB‐ST 19 1/2b, 3b, 7 1% 3% inlB‐ST 21 6% 4b, 4d, 4e inlB‐ST 16 5% 4% inlB‐ST 7 14% inlB‐ST 15 1/2a, 3a 19% 69% 1/2c, 3c 22% inlB‐ST 13 1% inlB‐ST 8  inlB‐ST 12 17% 2% inlB‐ST 9 6% www.ages.at
  • 19. Typisierung III: Pulsed-Field-Gel- Elektrophorese • Genetischer Fingerprint • Schnitt des gesamten Genoms mit 2 Restriktionsenzymen - AscI - ApaI • Vergleich der Muster mit eigener Datenbank (Bionumerics, Applied Maths) - Abgleich mit Humanisolaten www.ages.at
  • 20. Pulsed-Field Gelelektrophorese Unterscheidung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten: 3 PFGE-Muster inlB‐ST 19 1/2b, 3b, 7 1% inlB‐ST 21 9 PFGE-Muster 3% inlB‐ST 16 6% 4b, 4d, 4e 4% 4 PFGE-Muster inlB‐ST 7 5% 14% inlB‐ST 15 1/2a, 3a 19% 69% 1/2c, 3c 22% inlB‐ST 13 1% inlB‐ST 12 inlB‐ST 8 2% inlB‐ST 9 17% 6% 1 PFGE-Muster 3 PFGE-Muster www.ages.at
  • 21. Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis? • „Multinationaler Listerioseausbruch“ 2009/2010 Foto: AGES www.ages.at
  • 22. Listerioseausbruch 2009/2010 verursacht durch „Quargel“ Produktrückruf: 23. Januar 2010 66 L. monocytogenes Isolate aus Quargel untersucht: - Klon 1: 2 Isolate - Klon 2: 64 Isolate Ende November 2009: Wechsel der Schutzkultur www.ages.at
  • 23. Listerioseausbruch 2009/2010 verursacht durch „Quargel“ PFGE_AscI PFGE_ApaI Patientenisolat Serotyp 1/2a Klon I Isolat aus Quargel inlB-ST 15 14 Patientenisolate -12 aus Österreich (davon 3 †) - 2 aus Deutschland (davon 2 †) PFGE_AscI PFGE_ApaI Patientenisolat Serotyp 1/2a Klon II Isolat aus Quargel inlB-ST 9 20 Patientenisolate -13 aus Österreich (davon 2 †) - 6 aus Deutschland (davon 1 †) - 1 aus der Tschechischen Republik www.ages.at
  • 24. Listerioseausbruch 2009/2010 verursacht durch „Quargel“ • Dezember 2009: Kassabons der Patienten werden gesammelt - Hinweis auf Quargelkauf bei 3 von 7 Patienten - Regelmäßiger Quargelkonsum bei 8 von 9 befragten Patienten - Fall-Kontroll-Studie ergab eindeutigen Zusammenhang • Molekulare Subtypisierung bestätigt epidemiologische Untersuchungen – liefert Nachweis für Quargel als Verursacher des multinationalen Listerioseausbruchs • Zusammenhang Klon I/ Klon II identifiziert www.ages.at
  • 25. Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis? • Aufgaben des NRL´s: • Abklärung epidemiologischer Fragen auf nationaler / internationaler Ebene - Datenweitergabe - Seit Januar 2012: Pro Quartal – Abgleich der Typisierungen von Patientenisolaten mit Lebensmittelisolaten o Regelmäßige Überwachung gewährleistet o Schnellere Reaktion im Fall eines Ausbruchs • Gewährleistung eines raschen Datenaustauschs mit Nachbarländern • Internationaler Methodenabgleich mit EU-RL • Führen einer Stammsammlung • Nationale Referenzlabor für Listeria monocytogenes  Public Health Erfordernis www.ages.at
  • 26. Danke! Core Unit Molekularbiologie Wien Werner Ruppitsch Anna Stöger Lebensmittelmikrobiologie Graz Sigrid Fleck Kathrin Hauser Silke Konrath Andrea Kormann-Klement Claudia Schlagenhaufen Hildegard Stangl Referenzlabor Graz Manuela Fest Christian Kornschober Anna Lennkh Birgit Moik Iris Strutz www.ages.at