2. تحضير البيئات البكتيرية •
Bacterial media Preparation •
للحصول على بيئات مناسبة، لنمو األحياء الدقيقة في المختبر، •
يتطلب توفير مواد مغذية مناسبة، الالزمة الستمرار نموها،
وتكاثرها، وتزويدها بالطاقة،والمطلوبة للتفاعالت الميتابوليزمية
والحركة.
ومن أهم مكونات بيئات نمو الميكروبات التالية:- •
الماء. •
مصدر للطاقة. •
مصادر مغذية مناسبة، التي تمد الميكروبات بالكربون، والنيتروجين •
واألكسجين، واأليدروجين والفسفور ، بجانب وجود العناصر
الغذائية الدقيقة والفيتامينات ،ولكنها بكميات قليلة ، وبعض
األحماض األمينية، وأي مواد أخرى، على حسب متطلبات
الميكروبات المختلفة.
3. • والهدف األساسي من تحضير البيئات المغذية، والمعقمة، هو
تدعيم نمو المستعمرات البكتيرية.
وتزرع البكتيريا في البيئات، ألغراض عديدة، ومن أهمها :- 1.
الحصول على نوع واحد من البكتيريا، بصورة نقية . 2.
المحافظة علي البكتيريا، لفترة طويلة من الوقت، بالمختبر . 3.
تنميتها، للحصول علي كميات كبيرة منها، وذلك لتحضير 4.
اللقاحات.
إجراء اختبارات الحساسية لألدوية، والكيماويات. 5.
• وقد روعي في تجهيز البيئات المستخدمة لتنمية البكتيريا،
توفير جميع االحتياجات والمتطلبات الغذائية الالزمة لنمو
األجناس، المختلفة من البكتيريا (النمو والتكاثر بالنسبة
للبكتيريا لهما معنى واحد) ، وبما ال يؤثر في خواصها الطبيعية
والبيولوجية . هناك بعض
4. • هناك بعض من الميكروبات، يمكن أن ينمو طبيعيا، على أي
نوع من البيئات، حتى التي تحتوي على مواد غذائية بسيطة،
بينما نجد أنواعا أخري منها ، يحتاج إلي بيئات خاصة،
والبعض اآلخر ال ينمو علي بيئات صناعية . ومن أهم المواد
التي تدخل في تركيب البيئات البكتيرية التالية :-
1. الماء: غالبا يكون ماء الصنبور مناسبا، في تحضير
البيئات البكتيرية، وخصوصا إذا كان يحتوي على قليل
من األمالح والمعادن. وأما إذا كان مصدره غير مناسب،
عندها يستعمل الماء المقطر .
2. اآلجار : Agarيحضر من األعشاب البحرية، على هيئة
مسحوق ، ويضاف اآلجار الياباني بتركيز 2%، أما
اآلجار النيوزيلندي بتركيز 1-2% .ويمكن حفظ اآلجار
في حالته السائلة، بوضعه في حمام مائي، عند درجة
حرارة 54م .
5. الببتون : Peptoneوهو خليط من عدة ببتيدات، 3.
وأحماض أمينية، كمصدر للنيتروجين . يحضر من
مسحوق جاف من اللحم األحمر، الخالي من الدهن، وكذلك
من عضالت القلب، بعد إجراء عملية الهضم بإنزيم الببسين
والتربسين، الذي تساعد علي تحلل البروتين، وكذلك يؤخذ
أيضا من حبوب فول الصويا.
مستخلص اللحم ( المرق) : كمصدر لألمالح المعدنية، 4.
وعوامل النمو من فيتامينات وأحماض أمينية . ويتم
تحضيره بغلي لحم البقر، الخالي من الدهن، لفترة قصيرة
وترشيحه.
مواد السكرية والنشوية: كمصدر للكربون والطاقة 5.
واألحماض.
كلوريد الصوديوم، بتركيز 5.0% . 6.
6. مستخلص الخميرة: يجهز من خميرة سكارومايسيس 6.
سيرفيسيا، بواسطة الحرارة المنخفضة عند 55° م ،أو
بإضافة بعض اإلنزيمات للتحليل البروتين، أو بواسطة حامض
هيدروكلوريد.
الدم :Bloodويؤخذ من الخيول أو األغنام، لتحضير الكميات 7.
الكبيرة، أما بالنسبة لتحضير الكميات الصغيرة، فيؤخذ من
األرانب، ويعقم، ويضاف بتركيز 5-01%.
المصل :Serumويتم الحصول عليه، بحفظ الدم في الثالجة 8.
لفترة من الزمن، بعدها يفصل المصل، باستخدام جهاز الطرد
المركزي، بسرعة 0003 دورة / دقيقة، ولمدة دقيقتين،
ويسحب السائل األصفر الطافي، بواسطة ماصة، ويضاف
بتركيز 5- 02%.
خالصة الكازين: ويتم الحصول عليها من تحلل بروتين اللبن . 9.
7. • هذا ويجب مراعاة طرق وشروط تعقيم البيئات، وحفظها
بشكل عام، فان اغلب البيئات يتم تعقيمها في درجة 121م،
وتحت ضغط بخاري 51 رطال، ولمدة 51 دقيقة ( في
الموصدة .)Autoclave
• أما المواد التي تتأثر بالحرارة، مثل: المصل والمواد السكرية
والمضادات الحيوية وغيرها، فيمكن تعقيمها بالترشيح( التعقيم
بالترشيح)، وتضاف بعدها إلى الوسط، بعد أن يبرد ( 54-
05° م ).
• لتحضير بيئات نمو الميكروبات، تحتاج إلى عناصر غذائية
مختلفة، لتساعد وتدعم نموها، وتكوين مستعمراتها، وفي
نفس الوقت، يجب أن تكون معقمة، لتفادي التلوث
بالميكروبات، غير المرغوبة فيها،
8. ويمكن تقسيم البيئات إلى ثالثة أقسام كالتالى:- •
بيئة سائلة، وتعرف بالمرق. •
بيئة صلبة. •
بيئة شبه صلبة. •
ويجب أن تكون مكوناتها الغذائية، متقاربة مع البيئات األصلية، •
لنمو البكتيريا في الطبيعة.
البيئة األساسية لنمو البكتيريا •
)Nutrient Agar (NA بيئة اآلجار المغذي •
)Nutrient Broth (NB بيئة المرق المغذي •
)Tryptic Soy Broth (TSB مرق تريبتك الصويا •
)Tryptic Soy Agar (TSA بيئة آجار تريبتك الصويا . •
9. • أنواع البيئات المغذية
• هناك عدد كبير من البكتيريا، غير ذاتية التغذية، وتنمو جيدا
على بيئة اآلجار المغذي، أو المرق المغذي، ومن جهة
أخرى قد تنمو بعض أنواع البكتيريا نموا ضعيفا، على مثل
هذه البيئات، ولنمو مثل هذه األنواع ؛ تحتاج إلى بيئات
خاصة تحتوي على فيتامينات، أو منشطات النمو الخاصة
( صعبة النمو ،)Fastidiousتعرف بالبيئات الغذائية
الخاصة، وتقسم على حسب استخدامها إلى التالي:-
1. البيئات المقوية -:Enriched Mediaتستخدم في
تنمية البكتيريا غير ذاتية التغذية،ضعيفة النمو على
البيئات العادية.
10. 2. البيئات االختيارية -:Selective Mediaتسمح بنمو نوع معين،
من البكتيريا ،وتثبط نمو نوع اآلخر غير المرغوب فيه، مثل :-
• بيئة بيسموث سلفايت آجار ،Bismuth sulfite agarتثبط
البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام، ومعظم البكتيريا السالبة لصبغة
الجرام، والتي تستعمل لعزل بكتريا السالمونيال تيفي
.Salmonella typhi
• بيئة اآلجار األخضر الالمع ،Brilliant green agarالتي تثبط
البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام، ومعظم البكتيريا السالبة لصبغة
الجرام، والتي تستعمل لعزل سالالت من السالمونيال
.Salmonella species
• بيئة سابراود جلوكوز آجار Sabouraud glucose agarدرجة
أسها اإليدروجين 6.5، تثبط معظم البكتيريا ، وتستعمل لعزل
الفطريات.
11. 3. البيئات التفريقية -:Differential Mediaيحتوي هذا
النوع من البيئات على نوع معين من الكيميائيات، التي
تؤدي إلى ظهور نوع معين أو مختلف من النمو، أو تحدث
تغيرا في مظهر النمو، المعروف لبعض أنواع من
البكتيريا النمو على بيئات العادية، وهذا قد يساعد الباحث
على تمييز بين األنواع من البكتيريا المختلفة، في حالة
نموها على نفس البيئة التفريقية، مثل:-
• بيئة جار الدم، للتعرف على بكتيريا ستريبتوكوكس
بيوجينيس Streptococcus pyogenesوغيرها،
والتي لها القدرة على تحليل الدم.
12. 4. يمكن الجمع بين البيئة االختيارية والتفريقية معا مثل:-
• بيئة ملح مانيتول آجار :Mannitol salt agarالتي
تحتوي على 5.7% ملح (كلوريد الصوديوم) Kومانيتول،
باإلضافة لوجود دليل، لتقدير درجة األس الهيدروجيني،
الذي يقوم بالكشف عن التغير في لون الميناتول المتخمر
إلى حامض، وتستعمل مثل هذه البيئة االختيارية التفريقية
لنمو الميكروبات، التي لها القدرة على مقاومة تركيزات
الملح العالية، وفي الوقت نفسه لها القدرة على تخمر
الميناتول، إلنتاج الحامض (تفريقية) ، ومن أهم البكتيريا
التي تقوم بمثل هذا العمل العنقودية الذهبية
.Staphylococcus aureus
13. 5. بيئة ماكونكي آجار: التي تحتوي على أمالح المرارة bile
saltsوالبلورات البنفسجية، لتثبيط البكتيريا الموجبة
لصبغة الجرام، وتحتوي على سكر اللبن الالكتوز، للمقارنة
بين الميكروبات التي لها القدرة على تخمر سكر اللبن، (
تكوين مستعمرات وردية اللون) من عدمه ( مستعمرات
عديمة اللون)، بجانب هناك بعض أنواع من بكتيريا الموجبة
لصبغة الجرام، ال تستطيع النمو على سكر اللبن( وفي هذه
الحالة تعتبر مثل هذه البيئة اختيارية).
6. بيئات االختبار -:Assay Mediaتستخدم مثل هذه البيئات،
ألغراض تقدير كمية الفيتامينات، واألحماض األمينية
والمضادات الحيوية.
14. • بيئات عد البكتيريا Bacterial Enumeration Media
:- تستعمل في عد البكتيريا، في كثير من المواد الغذائية،
وغيرها، وتعتمد مثل:- اللحوم واأللبان ومنتجاتها
مكوناتها على نوع البكتيريا المراد عدها.
• بيئات التعرف على البكتيريا Characterization Media
-:Bacterialهناك عدد كبير من البيئات الغذائية،التي
تستخدم في تحديد نوع، ونمو وقدرة بعض البكتيريا على
أحداث تغييرات كيميائية في البيئة.
15. • تحضر مثل هذه البيئات على أشكال مختلفة منها:-
1. العميق .Deep
2. المرق .Broth
3. اآلجار المائل Slantأو في األطباق ( أطباق بيتري ).
• تحضر البيئة األساسية لنمو الميكروبات، على شكل
مسحوق ،Powderمثال على ذلك تحضر بيئة اآلجار
المغذي كاآلتي:
وزن 32 جم من مسحوق اآلجار المغذي. •
يضاف لتر من الماء المؤين . Deionized •
يسخن الخليط حتى درجة الغليان، مع التحريك المستمر. •
يفرغ الخليط في أنابيب، أو في زجاجات Bottles •
تعقم األنابيب، أو الزجاجات بالبخار، في معقم. •
16. • ومن أهم صفات بيئة اآلجار
المغذي التالية:-
تكون على هيئة سائل ساخن( 1.
أنظر شكل (81) الزجاجة من
ناحية اليسار).
تتصلب عند تبريدها، عند 2.
انخفاض درجة حرارتها إلى
54 ºس.
بعد غليها، يجب تفريغها في 3.
زجاجات حجمها 001 مل.
شكل(81) علي اليسار زجاجة تحتوي بيئة اآلجار المغذي
بعد تسخينها بالحرارية مباشرة ( سائل)، والزجاجة على تفرغ كل زجاجة من اآلجار 4.
اليمين تحتوي على بيئة اآلجار سخن وبرد (صلب) مع أربعة
من أطباق بيتري المحتوية على بيئة اآلجار المغذي. حجمها 001 مل، في أربعة
أطباق بيتري(أنظر شكل81).
17. • عند صب البيئة وهي ساخنة، يتكثف بخار الماء على
السطح الداخلي للطبق، والذي يسبب كثير من المشاكل لنمو
البكتيريا المراد تنميتها انظر شكل(91).
شكل (91) الحظ تكثف بخار الماء داخل الطبق بسبب
صب البيئة عند درجةحرارة أعلى من 05 ºس.
18. 6. عند صب البيئة بطريقة سليمة وعند درجة 54 ºس؛ لن
يتكثف بخار الماء داخل الطبق(شكل02).
• شكل(02) طبق بيتري يحتوي على بيئة اآلجار المغذي
صبت البيئة فيهبطريقة سليمة عند درجة 54 ºس.
19. • يمكن صب بيئة اآلجار المغذي في األنابيب كما هو موضح
في شكل (12).
• شكل(12) صب بيئة اآلجار المغذي في األنابيب
يحتوي األنبوب على اليسار آلجار وصب مائال ويحتوي األنبوب في
الوسط على مرق اآلجار( البيئة سائلة عند التبريد) ويحتوي األنبوب
على اليمين على بيئة اآلجار المتصلب بعد تبريده.
20. • اآلجار المائل Slant agar
• اآلجار المائل، عبارة عن البيئة المغذية المائلة،
داخل أنبوبة االختبار، بسبب وضعها على سطح
مائل، أثناء تبريد البيئة، لتتصلب على هذا
الوضع(شكل 32)، والهدف من استخدام اآلجار
المائل في زراعة األحياء الدقيقة، خاصة الهوائية ،
أوغير الهوائية، واالختيارية، لمالحظة تكوين
الصباغات، الناتجة من نمو بعض أنواع األحياء
الدقيقة، وتستعمل أيضا في حفظ البيئات الميكروبية.
21. • طريقة العمل:
تصهر ثالث أنابيب آجار المغذي في ماء يغلي. 1.
تبرد عند سطح مائل. 2.
بعد عملية التصلب؛ يلقح سطح آجار في األنبوبة األولى ببكتيريا 3.
إشيريشيا كوالي، بناقل (إبرة التلقيح)
تحرك اإلبرة برفق، على سطح اآلجار المائل الصلب، من أسفل إلى 4.
أعلى، بدون جرح السطح شكل (32).
بنفس الطريقة تلقح األنبوبة الثانية، ببكتيريا ميكروكوكس لوتيوس 5.
Micrococcous luteus
تستعمل األنبوبة الثالثة كمراقب. 6.
تحضن األنابيب الثالثة، عند 03 ºس لمدة ثالثة أيام. 7.
يالحظ نمو البكتيريا المختلفة، على البيئات المختلفة، ويالحظ الفرق 8.
بينهما شكل(42).
