1) El documento describe los métodos para producir insulina humana recombinante utilizando ingeniería genética, incluyendo la inserción de los genes de la insulina humana en bacterias para que las produzcan a gran escala. 2) También resume los pasos históricos para dilucidar la estructura de la insulina y desarrollar la insulina recombinante, como un tratamiento más seguro para la diabetes. 3) La insulina recombinante producida por bacterias modificadas genéticamente es químicamente idéntica a la insul

1. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE
SAN MARCOS
Universidad del Perú, Decana de América
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
EAP DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
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Chuco Sutta Luis Alberto
Domínguez Parco Sandy
Espilco Villarruel Guadalupe
Evangelista Tenorio Eduardo
Hualan Sandoval Luis Félix
28 de Noviembre 2013

3. INGENIERÍA GENÉTICA
Es el conjunto de métodos y técnicas que permiten el
acceso y la manipulación del DNA
Técnicas que modifican las características hereditarias de un organismo en un
sentido predeterminado mediante la alteración de su material genético
La formación de nuevas combinaciones de genes por el aislamiento de un
fragmento de DNA, la creación en él de determinados cambios y la reintroducción
de este fragmento en el mismo organismo o en otro. Cuando los genes nuevos son
introducidos en las plantas o animales, los organismos resultantes pasan a llamarse
transgénicos.

4. RESEÑA HISTÓRICA
1953 Watson & Crick determinación de
estructura del ADN
1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana elucidaron
Código Genético
1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa
1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr
en bacterias además de desarrollar las técnicas
de clonaje de ADN en laboratorios
1982 Tabaco, la primera planta modificada
genéticamente
1983 palmiter y brinster produjeron un ratón
transgénico .
2000 26 de junio se presenta 90% borrador
genoma humano
2001 26 de enero borrador genóma del arroz
Oriza sativa

5. Ingeniería Genética
Síntesis de Nuevas Proteínas
Clonación
Producción de Proteínas
humanas
Nuevas
Plantas y
Animales
Nuevos
Antibióticos
Terapia
Génica

6. BENEFICIOS FUTUROS DEL DNA
RECOMBINANTE
La terapia por reemplazo de genes para el
tratamiento de enfermedades
hereditarias.
La obtención de evidencias mediante huellas de
DNA en casos de crímenes

7. CONSEGUIR PRODUCTOS AGRÍCOLAS MÁS DURADEROS Y NUTRITIVOS.
Alterar los genomas de los seres vivos para dotarles de alguna
cualidad que no tenían (plantas resistentes a heladas, frutas que
maduran antes, cultivos que crecen más,...).
ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condiciones
ambientales de estrés.
Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa .Los genes de
trehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado por
frio, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producción
en 20%.
El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar moléculas biológicas: lípidos,
enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés.
La composición química de los granos no cambia.

8. ADN RECOMBINANTE
PROPÓSITO
Enzimas Restricción
Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa
Une fragmentos de ADN
Vectores
Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación
Plásmidos
Clase común de vector
Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas
Gel Electroforesis
Para separar fragmentos de ADN
Secuenciación ADN
Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

9. 1
2
3
Creación de nuevas
combinaciones
de
segmentos
o
de
moléculas de ADN
que no se encuentran
juntas de manera
natural.

10. Los fragmentos de ADN se generan utilizando unas enzimas
denominadas ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN, que
reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias
nucleotídicas específicas.

11. Eco
RI:
Reconoce y se
une
a
la
secuencia
palindrómica
GAATTC
Enzima
desoxinucleotidil
transferasa terminal
para crear colas
complementarias
mediante la adición
de fragmentos de
poli-dA y de poli-dT

12. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes
transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Son
pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro
de las células hospedadoras.

13. Consiste en la captación por parte de
una célula receptora de una molécula o
fragmento de DNA desnudo y la
incorporación de esta molécula al
cromosoma del receptor en una forma
heredable. En la transformación natural,
el DNA procede de una bacteria
donadora.

14. 1) La partícula viral se fija a un sitio receptor
específico de la superficie bacteriana.
2) En la segunda, el material genético del
virus que con frecuencia es DNA bicatenario,
penetra entonces en la célula. Tras la
adsorción y la penetración, el cromosoma
viral obliga a la bacteria a fabricar ácidos
nucleicos y proteínas del virus.
3) La tercera fase comienza tras la síntesis de
los componentes virales. Se ensamblan fagos
a partir de estos componentes. El proceso de
ensamblaje puede ser complejo, pero en
todos los casos el ácido nucleico se introduce
(“se empaqueta”) en la cápside proteica
viral.
• Finalmente, los virus maduros son
liberados al medio mediante la lisis de la
célula huésped.

16. INSULINA
RECOMBINANTE

17. Historia
• Hasta 1983 toda la insulina utilizada para el
tratamiento de la diabetes era extraída de
páncreas de porcino y bovino, sin embargo, el uso
prolongado de este tipo de insulina provoca, en
algunos individuos, una respuesta inmune.
• Además la disponibilidad de páncreas de los
animales mencionados es limitada, por lo que es
deseable la obtención y uso de insulina humana.

18. • El objetivo sería conseguir que los genes
humanos, responsables de la producción de la
hormona insulina se expresaran en la bacteria.
• De este modo, las
bacterias
producirían
insulina
a
grandes
velocidades, pudiéndose
escalar el modelo en
tanques de fermentación
para la obtención de
grandes cantidades.

19. (3)

20. Existen dos rutas para la obtención de insulina
humana
utilizando
microorganismos
modificados por ingeniería genética:
•Una de ellas, consiste en producir por separado
ambas cadenas para , posteriormente, asociarlas
químicamente.
•La otra se basa en la producción de proinsulina
que es procesada hasta insulina madura
mediante métodos enzimáticos.

21. (4)

24. Historia
Hasta 1983
La insulina para
tratamiento de la diabetes
era extraída de páncreas de
porcino y bovino
Uso prolongado de este tipo
de insulina provoca, en
algunos individuos, una
respuesta inmune
-Disponibilidad de páncreas de los animales mencionados es
limitada, por lo que es deseable la obtención y uso de insulina
humana.
-Regular la diabetes mellitus (Deficiencia de insulina ), la más
común es la de tipo 2 (No insulinodependiente) se puede
controlar con dieta equilibrada.

25. LA ESTRUCTURA DE LA INSULINA
•
Sir Frederick Grant Banting
descubrió la insulina en el año de
1921 teniendo como antecedentes
los trabajos de Shafer.
•
Dilucidación de su estructura,
proeza realizada en 1954 por
Frederick
Sanger
y
sus
colaboradores de la Universidad de
Cambridge.
•
La insulina es una molécula muy
pequeña: sólo contiene 254 átomos
de carbono, 337 de hidrógeno, 65
de nitrógeno, 75 de oxígeno y 6 de
azufre.
•
24 aminoácidos posibles, 17 están
presentes en la insulina.

26. Trabajo de
Sanger
Secuencia crucial
• Un solo cambio en la posición
de un aminoácido dentro de
la molécula puede hacer
cambiar la funcionalidad de
la proteína.
Dilucidar no solo la
estructura total de la
molécula de insulina
• Sanger utilizó el método
tradicional para estudiar
grandes
moléculas:
romperlas en fragmentos y
colocarlas nuevamente juntas
como las piezas de un
rompecabezas.
También el orden en
el que se alinean las
distintas subunidades
de aminoácidos
• La rotura completa de la
molécula
sirve
para
identificar los aminoácidos,
pero no dice nada acerca de
como están ordenados.

28. Hidrólisis
fraccionada
Marcador
especial que
se une a los
grupos NH2
libre
Cromatografía
en capa fina
Dilucidación de la estructura
de la Insulina

29. El Marcador fue el DNP
(dinitrofenol) que se une al NH2
terminal y resiste la hidrólisis.
Fraccionando la molécula de
insulina , diferentes
péptidos, marcando estos con
DNP y produciendo la hidrólisis
fraccionado y total de estos
péptidos para identificar los
aminoácidos.
Hidrolisis Fraccionada
Fraccionar insulina en sus dos
cadenas. Puentes disulfuro, se
pueden romper selectivamente
por oxidación con acido
perfórmico.
La cadena de fenilalanina, con
30 aminoácidos era, con gran
diferencia, el polipéptido más
complejo
• Separó ambas cadenas por
electroforesis.
• Demostró que una cadena se iniciaba
con glicocola, mientras que la segunda
se iniciaba por fenilalanina.
Secuencia inicial de cadena de
glicocola : glicocola-isoleucinavalina-ácido glutámico-ácido
glutámico
se concentró inicialmente sobre
la cadena de glicocola

30. • El objetivo sería conseguir
que los genes humanos,
responsables
de
la
producción
de
la
hormona insulina se
expresaran en la bacteria.
• De este modo, las
bacterias
producirían
insulina
a
grandes
velocidades, pudiéndose
escalar el modelo en
tanques de fermentación
para la obtención de
grandes cantidades.

31. Rutas para
obtención de
Insulina Humana
utilizando
microorganismos
modificados por
ingeniería genética
Producción de
proinsulina que es
procesada hasta
insulina madura
mediante métodos
enzimáticos.
Producir por separado
ambas cadenas para ,
posteriormente,
asociarlas
químicamente.

32. PRODUCCION DE INSULINA
RECOMBINANTE
• Biólogos moleculares aislaban los genes
responsables de la producción del proinsulina
y pronto la industria farmaceútica vislumbró la
posibilidad de obtener insulina humana por
clonación de genes en bacterias.
• La estrategia seguida para la producción de
insulina humana recombinante fué la
siguiente:

33. 1
2
3
• En primer lugar, se sintetizaron químicamente las cadenas de ADN con las
secuencias correspondientes a las cadenas de glicocola y fenilalanina
• siendo necesarias 63 nucleótidos para la primera y 90 para la segunda
más un triplete para señalar el fin de la traducción
• Para facilitar la separación de los productos sintetizados, se añadió a cada
gen el triplete correspondiente a la metionina.
• Los genes sintéticos A y B se insertaron por separado en el gen bacteriano
responsable de la b-galactosidasa y presente en un plásmido

34. 4
5
6
• Los plásmidos recombinantes se introdujeron en E. coli donde se
multiplicaron, fabricando un ARNm que tradujo una proteína quimérica,
en la que una parte de la secuencia de la b-galactosidasa estaba unida
por una metionina a la cadena de glicocola o de fenilalanina de la
insulina.
• Como ninguna de las cadenas de insulina contiene metionina, esto se
aprovecho para separar las cadenas de la insulina del resto de proteína
quimérica rompiéndola con bromuro de cianógeno que destruye la
metionina
•Después de purificadas, las cadenas se unieron mediante una reacción
que forma puentes de disulfuro.

37. INSULINA DE TIPO HUMANO
INSULINA DE TIPO ANIMAL
Proviene de bacterias alteradas por medio de
ingeniería genética que producen una
insulina muy similar a la de los humanos, de
aquí que se le denomine insulina humana o
recombinante
Esta se puede obtener por extracción
del páncreas de diferentes especies
animales en particular la bovina
(buey) o la porcina (cerdo). (Lerman:
1994)
Menos inmunológicas
Permite alargar la supervivencia en
forma considerable,
Son física y químicamente equivalente a la
insulina pancreática humana
BENEFICIOS
Produce menos formación de anticuerpos.
Su producción es más rápida y se genera en
grandes cantidades.
Causa atrofia (desgaste de los tejidos grasos
debajo de la piel) en los sitios de inyección
dejando un ligero hundimiento, la hipertrofia
(hinchazón del tejido graso) abultamiento en
las zonas de inyección.
CONSECUENCIAS
El costo de esta es más caro por las empresas
que la han patentado.
Bajo costo ya que no esta patentada,
Adecuado control para los pacientes
que no toleran la insulina transgénica
No tienen problemas en su
administración puesto que se adapta
fácilmente a su cuerpo.
Puede provocar alergias causando
comezón en el lugar de la inyección,
por que la estructura química de esta
es diferente a la humana y por lo tanto
el sistema inmunológico no la reconoce
como una proteína propia, también
provoca lipodistrofia (trastorno en el
metabolismo de las grasas) o formación
de anticuerpos.