1. Die quot;Flavr Savrquot; Tomate
&
Gene-silencing

2. Flavr Savr
• erstes gentechnisch verändertes Gemüse
• entwickelt 1988 von Calgene Inc. (USA)
• Paradebeispiel zu Sicherheitstests für Genfood
• 1994 auf dem Markt
• 1997 Produktion eingestellt
quot;Anti-Matsch Tomatequot; - Reifungsprozeß unterbrochen
Smith CJS et al. (1988) Antisense RNA inhibition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes. Nature 334:724-726.
Sheey RE et al. (1988) Reduction of polygalacturonase activity in tomato fruit by antisense RNA. PNAS 85: 8805-8809.

3. Wieso Flav(ou)r Sav(ou)r Tomaten?
Flavr Savr Normale
Markt (1993)
längere Reifung 8 Mt (verarbeitet)
= 0,5 Mt (frisch)
besserer Geschmack
4 Milliarden US$/J

4. ...reife Tomaten
Ethylen Polygalacturonase Abbau von Pektin

5. Polygalacturonase inaktivieren
Polygalacturonase (PG)
(Tomate)
PG mRNA
Anti-Sense RNA
• Abbau der PG mRNA
• PG-level = 6%
A. tumefaciens - Binärer Vektor

6. Umfangreiche Sicherheitstests
1.) FDA (Food & Drug Administration): Kan-Resistenz ist unbedenklich
2.) Inhaltsstoffe unverändert
• Vitamine
• Proteine
• Mineralstoffe
• Toxine
(Solanin, Tomatin)

7. Warum so wenig erfolgreich?
Business-Träumereien wissenschaftliche Realität
• nicht schadensfrei transportfähig (unrentabel)
• Tomatensorte hat: wenig Geschmack
geringen Ertrag
geringe Resistenz
• Anti-GM-Food Proteste
1995-1997: Calgene von Monsanto (USA) aufgekauft
Anti-Sense Konstrukt in höherwertige Sorten einbringen

8. GM-Tomaten in Großbrittannien
Zeneca (Syngenta): Tomaten mit verzögerter Reifung
• Tomatenpüree mit hoher Viskosität
(kein Erhitzen nötig)
• eindeutig gelabelt
• sehr populär (60% Marktanteil)
• 1996-1999 am Markt

9. 60 Tage
Alternative Ansätze
Ethylen-Synthese blockieren
Methionin
Antisense
ACC-Synthase
78 Tage quot;Co-Suppressionquot;
S-Adenosyl-Methionin quot;Antisensequot;
ACC-Synthase
1-Amino-Cyclopropan-1-Carboxylsäure (ACC)
Antisense
ACC-Synthase
78 Tage
(+ Ethylen)
Ethylen
DNA Plant Technology Corp. (USA) - quot;Endless Summerquot; (1995)

10. Der Mechanismus hinter Flavr Savr:
quot;Silencingquot;
• Produktion von Anti-Sense RNA
• Sense-mRNA in der Zelle abgebaut
• Expression von Transgenen in Pflanzen
(starke, konstitutive Promotoren)
• keine Expression des Transgens
1990
• endogenes Gen supprimiert

11. Gene-Silencing
Post-transcriptional gene silencing (PTGS)
Transcriptional gene silencing (TGS)
(Co-suppression; RNAi)
1994

12. Produktion von dsRNA (1998)
• Transkription durch IR
• gegenläufige Transkription
(sense-antisense)
• RNA-abhängige
RNA-Polymerase (cRNA)

13. Welche Faktoren/Signale sind involviert?
1
3 4
2
quot;Dicerquot;: RNaseIII

14. Wozu Gene-silencing?
TGS
Inaktivierung von Retroviren, Retrotransposons und DNA-Transposons
• Methylierung: Transkriptionelle Inaktivierung
PTGS
Abwehr von Pflanzenviren
• 90% ssRNA-Viren
• dsRNA bei Replikation
• Abbau des Templates für Replikation & Translation
• Systemisches Signal

15. Transport viraler RNA durch Plasmodesmata

16. Virale Suppressoren des Silencing
• HC-Pro (helper component-proteinase)
Tobacco etch potyvirus quot;maintenancequot; supprimiert
- keine 25 nt dsRNA produziert
- Methylierung geht z.T. verloren
- Reaktivierung von gesilencten Genen
• 2b Protein
Cucumber mosaic virus (CMV) quot;Initiationquot; supprimiert
• p25 Protein
Potato virus X (PVX) quot;systemisches Signalquot; supprimiert
- 3 Movement-Proteine: p8, p12, p25

17. Wie quot;silencequot; ich ein Gen?
dsRNA
Agrobacterium tumefaciens
• sense & antisense, >300 bp
• splicebares Intron zwischen sense & antisense
• Vorraussetzung: transformierbare Pflanze
VIGS (Virus-induced gene silencing)
• Potato virus X (PVX), Tobacco rattle virus (TRV)
• Vorraussetzung: Wirtsspezifität

18. Methodische Ansätze zum Gene-Silencing
• Expression von Transgenen - Induzierbare Expression
- Verwendung von Suppressoren
• Gezielte Suppression von Genen - quot;knock-outquot;-Phänotyp
- Virus-Resistenz

19. nächste Woche:
quot;Advanced Backcross Breedingquot;