RESUMEN EXPLICATIVO PARA APROBAR EL SEGUNDO PRACTICO DE LABORATORIO !! by: niko para mis compañeros de odonto <3

1. Métodos de estudio de biología celular
Laboratorio1
Cromatografía
1. Cromatografía de intercambio iónico: Se
coloca un gel con carga, las proteínas
con cargas complementarias pasan y las
retenidas son eluidas al neutralizar el gel
2. Cromatografía de filtración: se utilizan
matrices porosas que dejan pasar las
partículas mas grandes reteniendo las
pequeñas
3. Cromatografía de afinidad: se utilizan
esferas de gel con ligándos específicos
que retienen las proteínas especificas
que se necesitan (anticuerpo-antígeno)
Electroforesis ADN
- Separa moléculas eléctricamente
- Los separa según masa
- Se pude utilizar un gel de agarosa o de poliacrilamida
o Agarosa: mientras mas agarosa mas pequeños los poros
o Poliacrilamida: es una mezcla de archilamida y bisacrilamida
que se polimeriza catalizado persulfato de amonio y TEMED
- Se coloca un cátodo y un ánodo a cada lado del gel
- Las cargas arrastran las partículas a la carga complementaria

2. Reacción de polimerasa en cadena PCR
1. Denaturacion: consisten en separar las dos hebras
de ADN (por calor)
2. Annealing: se agregan partidores (oligonucleótidos),
luego ADNpolimerasa que genera el doble de
hebras y así se repite el proceso muchas veces
Utilidades
1. Determinar huellas dactilares de ADN
2. Análisis de fósiles
3. Mapeos de genoma
4. Aislamientos de genes específicos
5. Detección de microorganismo
Enzimas de restricción
- enzimas que cortan en lugares específicos de ADN
- solo cortan secuencias palindromicas (se leen al revés y al derecho =)
- son bloqueados por metil, ADNmetilado
Endonucleasas tipo I y tipo III
- cortas y mutilan, es decir, tiene actividad de restricción y modificación
- cortan 5-8 pares de base de error río arriba río abajo.
- Necesitan ATP
Endonucleasas tipo II
- Actividad de restricción
- Cortan de manera consistente y precisa
- Necesitan Mg
Aplicaciones
- hacer mapeos de plásmidos
- Fragmentar ADN genómico electroforesis
Tipos de cortes
- Pegajosos: son cortes irregulares que permiten la unión de otra
secuencia
- Romos: son cortes secos que no permiten unir otra cadena
Factores variables:
- Pureza de ADN: ADN muy contaminado (proteínas, fenoles,
cloroformos, etanol) inhiben la acción de Endonucleasas
- Temperatura y PH: sin la tº y el PH adecuado las Endonucleasas no
actúan
- DNAsas: degradan el ADN
- Grados de metilación: Mucha metilación inhibe la endonucleasa
- Buffer adecuado: coloca las condiciones óptimas para trabajo
enzimático.

3. Practico1
1) Aprendimos a utilizar micropipetas:
o p1000
o p200
o p20
2) Tipos de microtubos:
o Tapa rosca
o Tapa bisagra
3) Digestión de enzimas:
- Agregamos en un microtubo
o 1µl de plásmido
o 16µl de H2O
o 2 µl de buffer
o 1µl de enzima
- Prepara gel de agarosa 0.7%
- Buffer TBE= posee acido bórico
- Buffer TAE=mantiene PH 8 contiene azul de bromofenol y glicerol
- Bromuro de etidio=tiñe ADN
- Ponemos cátodos y ánodo al gel
- Luego tomamos nuestra muestra y ponemos la muestra en los
pocillos
- Poner en el primer pocillo un marcador
- Realizar electroforesis
Resultados
- Podemos examinar los resultados realizando
un grafico con el logaritmo de las pares de
base del marcador y la distancia medida
en la electroforesis
- Luego toma las medidas de tu muestra y
compáralas con el grafico
- A tu valor del grafico sácale el antilogaritmo
y te dará el valor de pares de base
Distancia(Cm) Log Kb Kb
0,5 1 10
1 0,954 9
1,5 0,903 8
2 0,845 7
2,5 0,778 6
3 0,698 5
3,5 0,602 4
4 0,477 3
4,5 0,301 2
5 0 1

4. Laboratorio 2
Transformación génica
- Incorporar a célula nuevos genes que se expresaran posteriormente
- Utilizado para mejoramiento de cultivos, transformación de bacterias y
terapias génicas.
- Los genes implantados pueden venir de plantas u animales.
Transformación bacteriana:
- transpaso de gen por medio de un plásmido a una bacteria
- E.coli k-12 GFP(Aequorea victoria) E.coli k-12 fosforescente
- Para ingresar el gen se utiliza un plásmido pGLO(gen GFP + Gen
arabinosa+ gen beta lactamasa)
- Las bacterias se mantienen en placas con aliento (peptona+levadura)
- Si se desea hacerlo en medio solidó de utiliza LB(Luria-bertani)
(peptona+levadura+agar), en este caso producen colonias
fácilmente identificables, el agar da el sustrato de fijacion
- Las colonias presentan clones de la misma bacteria
Para evitar la contaminación de la placa:
1. Técnicas de esterilización: Limpiar por química, radiación o calor, el
material y lugar
2. Uso de técnicas estériles: limpiar manos y preocuparse de no
contaminar la muestra
3. Uso de antibióticos: estos eliminan las bacterias no deseadas.
- El gen beta lactamasa es un gen que vuelve resistentes a las bacterias
a los antibióticos derivados de la penicilina
- Para ingresar el gen a la célula se debe permeabilizar para esto
ocupamos cationes divalentes(Mg++;Ca++), neutraliza las cargas
negativas del fosfato permitiendo el paso de el ADN
- Para que la célula asimile el gen se aplican golpes de calor de 40 a 42
grados para que el Plásmido se denature y una al ADN también
denaturado
- Generalmente para identificar si el gen fue aceptado se utiliza un
sistema reportero (cuando se activa el gen se activa el reportero)
como la luciferasa que produce luciferina(molécula que produce luz)
- Luego de esto se puede extraer el ADN(gel de Agarosa) o las
proteínas (gel de poliacrilamida)

5. Practico 2
- Tendremos bacteria en un tubo, debemos dejar 300 µl en un tubo y
300 µl en otro
- Marcarlos con + y –
- Al tubo + agréguele buffer TSS
o PEG (disminuye al mínimo la capa de solvatación)
o DMSOanticongelante
o Mg +2
o Medio LB(luria Bertani)
- Agregue 2 µl de el Plásmido pGlo al tubo +
o Gen GFP
o Gen Arabinosa
o Gen de β-lactamasa
- Caliente por 15 min a baño María
- Prepare cuatro placas con LB y agregue Ampicilina y arabinosa
según indique lo sig.:
-ADN: Bacterias sin plásmido
+ADN: bacterias con plásmido
LB: Luria-Bertani: medio utilizado que contiene Lavadura y peptona en
15% de agar.
AMP: Ampicilina; antibiótico
ARB: Arabinosa

6. Laboratorio 3
Purificación de proteínas recombinantes
- las proteínas de las bacterias a las cuales hicimos transformación
génica, se mantiene dentro de la célula
- para sacarlas debemos romper la membrana, para esto se utilizan
lisosomas(proteína defensiva de las lagrimas del ojo) y luego un
sistema de congelación y descongelación
- Posteriormente se separan las proteínas del resto por centrifugado
- luego se separan selectivamente las proteínas por cromatografía
- la proteína GFP es altamente hidrofobica, por esto se utiliza una
columna de interacción Hidrofobica con buffer salino (hidrofilito)
- las proteínas menos hidrofobicas bajan y las mas hidrofobicas quedan
atrapadas en la columna
- luego se baja la concentración se la salinidad haciendo bajar el resto
de las proteínas (bajando la salinidad)
- finalmente se aplica un buffer de lavado sin concentración salina
haciendo bajar proteínas mas hidrofobicas(GFP)
Electroforesis de proteínas
- se utiliza poliacrilamida
- se utiliza un gel concentrador (4%) y luego un gel separador
- proteínas se miden en Dalton o KiloDalton (Kd)
- las proteínas tienen distinta carga, distinta forma y distinta masa
- para hacer una electroforesis debemos dejar solo la variable de masa
- Las cargas se eliminan con un detergente Dodecil sulfato de
sodio(SDS) dándole a todos una carga negativa esta técnica se llama
SDS-PAGE
- Para eliminar la forma debemos desnaturarla para esto aplicamos
mercaptoetanol y ditriotreitol, esto las convierte en proteínas
globulares en ramdon coil
- Se utiliza un marcador que son proteínas con peso molecular
conocido
Practico 3
- Nos entregan bacterias centrifugadas
- Observar las bacterias brillar en UV
- Re suspender las bacterias en buffer TE(tris etna )(activa la lisosoma)
- Agregar 20 µl a un tubo “A” y guárdelo
- Al resto de la muestra agréguele una gota de lisosoma
- Homogenizar con sonificador por 30 seg en hielo
- Preparar una columna con buffer de equilibrio
- Centrifugar las bacterias lisadas a 10.000 G por 10 min
- Remueve el tubo de la centrifuga y ver en UV
- Tubo B: guarde 20 µl de sobrenadante del centrifugado
- Agregue 250 µl de sobrenadante a otro tubo y agregue 250 de
buffer de enlace: “muestra equilibrada”
- Marque 3 tubos “C”,“D” y “E”
- Cargue la columna con 250 µl de la muestra equilibrada y verter
a “C”, observe en UV
- Luego agregue 250 µl buffer de lavado y verter a “D”, observe en UV
- Luego agregue 250 µl buffer de elución y verter a “E”, observe en UV,
repita 3 veces en E1, E2 y E3

7. - Compare los tubos A, B, C, D y los tres E
Laboratorio 4
Huellas dactilares en proteínas de músculos
- Evolución es el cambio colectivo de genes que presenta cambios en
las proteínas las que causa diferencias entre los individuos
- El ADN mantiene los cambios de una generación a otra
- La acumulación de cambios puede llevar a producir cambios en la
especie
- La evolución dice que todos venimos de un ancestro común
- Similitudes en genes puede significar que tienen un ancestro común u
homología (las estructuras derivan de de una estructura anatómica
común en un ancestro)
- Las proteínas de los organismos superiores presentan gran diversidad
ya que tienen diferentes dominios
- (King y Welson) los chimpancés muestran un 98,4% de genes igual al
hombre
- Todos los organismos presentan proteínas de canales iónicos,
activadoras de genes, replicadoras de genes, proteínas musculares,
entre otras.
- Las moléculas de actina y miosina se conservan a pesar de la gran
variedad de animales que existe.
- La similitud entre las proteínas indica una cercanía en el ancestro
común

8. - Y así mismo una diferencia una divergencia
Peces
- Nosotros trabajaremos con peces ya que son especies altamente
diversificadas ya que surgieron hace muchos millones de años
Clasificación:
o Agnata: Peces sin mandíbula, sin escamas y sin aletas, de
esqueleto cartilaginoso, son ancestrales, anguilas y lampreas
o Condrichtyas: tiburones, rayas, piel gruesa y sin escamas
verdaderas, aletas eficientes y sin vejiga natatoria.
o Ostrychtias: son los mas diversos, aletas pareadas, rayos móviles
y cola, esqueleto óseo y escamas
 Sarcoptrygians: se creían extintos, son los mas parecidos
a los reptiles y anfibios
 Actinoptrygian: peces de aletas rayadas, peces
modernos.
- Para examinar se utiliza el musculo y se ven las proteínas dentro de
este y se comparan las similitudes en las proteínas musculares
utilizando el estándar de miosina y actina.
- Los animales mas especializados presentan gran variedad en las
proteínas mientras que la miosina y actina son altamente
conservativas
- Las bandas de miosina(210Kd) y de actina(43Kd) son comunes en casi
todas las especies
Practico 4
- Tome los trozos de musculo entregado y muélalos sacando un trozo
del porte de una lenteja de cada uno en un tubo distinto P(pavo) y
R(rata)
- Agregue 250 µl de Buffer de carga
- Agite suavemente con golpecitos
- Incube la muestra por 5 min
- Centrifugue por 5 min
- Luego de centrifugar traspase 20 µl de buffer al tubo de tapa rosca.
- Aplique el SDS-page
o Azul de bromofenol (teñir)
o Glicerol (densidad)
o Mercaptoetanol (denaturar)
o SDS(carga negativa)
- Caliente a baño María
- Prepare el gel con gel de concentración
y separador
- Coloque la muestra en el gel y realice la electroforesis
- Luego tiña con azul de coomassie (bio-safe)
- Realice un grafico
Cm Log Kd Kd
0,5 2 100
1 1,875 75
1,8 1,698 50
2,3 1,397 25
3 1 10

9. Estudio del polimorfismo Xhoi en el gen del inhibidor del activador del
plasmigeno tipo-1 PAI-I
Polimorfismo
- Del Genoma del ser humano solo presenta un 5%(exones) para
codificar proteínas
- El otro 95% se le llaman intrones
- Dentro de los intrones pueden existir sectores que son diferentes entre
los individuos de una especie Polimorfismos:
Estudio de polimorfismo
- Para estudiar los polimorfismo es necesario tener muchas copias del
gen para esto aplicamos la técnica de PCR
- La PCR utiliza una proteína llamada TAQ ADNpolimerasa esta proteína
esta presente en bacterias que viven a altas temperaturas.3´-5´.
Existen distintos tipos de polimorfismo
1) Polimorfismo de longitud: la longitud de un intron varia entre un
individuo y otro, se pueden estudiar realizando un PCR y una
electroforesis
2) Polimorfismo STR: se pueden estudiar realizando un PCR y una
electroforesis
3) Polimorfismo de nucleótido único(SNP): solo varia un nucleótido
- El polimorfismo Xhoi en el gen del inhibidor del activador del
plasmigeno tipo-1(PAI-I) pertenece a los SNP

10. - Este intron presenta una secuencia palindromica que es cortada por
enzimas de restricción pero si sufre un cambio de una de una guanina
por una adenina no se forma la cadena palindromica y no es cortada
por la enzima
- Entonces al aplicar enzimas de restricción
- Luego realizamos electroforesis
- Los individuos que tengan el intron con guanina presentaran dos
bandas
- Los individuos que tengan el intron con adenina presentaran una solo
banda
- Y los individuos heterocigotos presentaran tres líneas
Equilibrio de Hardy –Weinberg
- Genotipos observados: numero de individuos con determinado
genotipo
o 7 A/G
o 9 A/A
o 7 G/G
- Frecuencia genotípica: numero de individuos con determinado
genotipo/n° de individuos
o A/G: 7/23=0,304
o A/A: 9/23=0,391
o G/G: 7/23=0,304
- Frecuencia alelica
o A: 25/46=0,543
o G: 21/46=0,457
- Equilibrio de Hardy –Weinberg
P(A) Q(G)
P(A) P2 PQ
Q(G) PQ Q2
P2+2PQ+ Q2=100%
P2+2PQ+ Q2=1
- Frecuencia fenotípica esperada
o P2=(0,543)2 =0,295
o 2PQ= 2 x 0,543 x 0,457=0,496
o Q2 = (0,457)2= 0,209
La frecuencia dentro de un grupo de 23 individuos osea que la cantidad de
individuos de cada genotipo es 23 por la frecuencia
- Numero de individuos esperados
o 0,295 x 23= 6
o 0,496 x 23= 11
o 0,209 x 23= 7
Esto no coincide con nuestra muestra pero para comprobarlo aplicaremos
Chi- cuadrado (técnica estadística, que no nos interesa XD)
Genotipo N° de
individuos
N° de
individuos
esperdos
(Obs-esp)
2/esp
Resultados
A/A 9 7 (9-7) 2/7 0,571
A/G 7 11 (7-11) 2/11 1,455
G/G 7 5 (7-5) 2/5 0,8
Ʃ= 2,826

11. Para que sea valido debería darnos inferior a 3,84 con un grado de libertad
de un 1 con 95% de confianza.
Si sobrepasa el valor de equilibrio esta errado.