CICLO CELULAR, REGULACION DEL CRECIMIENTO CELULAR, INTEGRACION DE CELULAS EN TEJIDOS, APOPTOSIS

AMELOBLASTOMA

www.library.vcu.edu/.../46-ameloblastoma.jpg

 Es el tumor mas frecuente del
epitelio odontogenico
 Tiene un carácter benigno.
 Es invasor localmente.
 Tiende a recurrir

CLASIFICACION HISTOLOGICA
 Folicular.
 Plexiforme
 De células acantosas
 De células granulares
 De células basales.

 la proliferación celular tiene una
progresión ordenada durante su ciclo
 Esta proliferación depende de una
serie de complejos de proteínas
formados por:
› ciclinas
› quinasas dependiente de ciclinas
(cdk)

 Las ciclinas D aumentan en respuesta
a factores de crecimiento.
 Ciclina D1 forma complejo con la
quinasa dependiente de ciclina 4 o
6 (cdk4 o cdk6).
 Este complejo D1-cdk4 o D1-cdk6
regula la transición del G1 a fase S.

Crecimiento
celular,
síntesis de
proteínas,
preparación Separación
para mitosis de
cromosomas
hijos

Interf
ase

Célula
metabólicamen
te activa. Está
Síntesis, creciendo
replicación
de DNA

Factores
de
crecimient
o
aumentan Cíclina D1 /
D1 CDK4

 Se unen a complejos ciclina-CDK y son:
› 1. Inhibidores CDK4/6 que incluye la
proteína p16. inhibe la progresión a la
fase s.
› 2. Inhibidores universales CDK, incluye
proteína p21 y p27. detiene la fase G1.

P21 y P27,
detienen
P16
esta fase
inhibe

Cíclica D1 /
CDK4

 LA TOPOISOMERASA IIa (topo IIa) es una
enzima nuclear reguladora del DNA. Se
expresa en la fase S y la progresión G2-
M.

 El RNAm de la histona H3, alcanza su
pico durante la fase S.

Topo
IIa

P21 y P27,
detienen
P16
esta fase
inhibe
RNAm
de
histona Cíclina D1 /
H3
CDK4, regula

 La expresión de una ciclina: D1
 Inhibidores de quinasa
dependiente de ciclina, CKi:
proteínas p16, p21 y p27.
 Marcadores de fase de
proliferación: topo IIa y RNA m
de Histona h3.

 31 especímenes de pacientes con
ameloblastoma:
› 18 foliculares
› 13 plexiformes

 9 acantomatosos
 4 de células granulares
 2 de células basales

 8 Gérmenes dentales (en etapa inicial de
mineralización de la corona.

PREPARACION DEL TEJIDO
 Los especímenes fueron removidos
quirúrgicamente en 31 pacientes con
ameloblastoma.
 DX Histológicamente (OMS).
 Los tejido fueron fijados en formol al 10%
y embebidos con parafina.
 Cortes de 3mm
Inmunohistoquimicamente Hibridación
in situ.

Inmunohistoquimica

 Se desparafinaron.
 Sumergieron en Metanol con peróxido
de hidrogeno al 0.3%.
 Recuperan antígeno 0.01M citrato buffer
por 10 minen autoclave (121C 2 atm)
 Suero de conejo.
 Incubación con anticuerpos
primarios.4C

 Los anticuerpos confirmados por
inmunoblotting.
 Sterptavidin-biotin-peroxidasa(Histofine
SABPO )para ligar los anticuerpos
primarios.
 Los productos de reacción fueron
visualizados por inmersión en solución de
diamino benzidina ) 0.03% con peróxido
de hidrogeno por 2- 5 min.

 Los núcleos fueron marcados con
Methylgreen.
 Grupo control con tejidos de autopsias
de epitelio escamoso estratificado
normal.

Hibridacion in situ
 Desparafinadas, rehidratadas y
digeridas con pepsina al 0.4% N HCL 37C
por 10 minutos.
 Incubadas con Histona H3 RNAm
marcada con fluoresceína y con una
hebra de DNA a 55C.( Dako).
 Lavadas con citrato salino de sodio. 55C
por 30 Min.

Hibridacion in situ
 Reaccionaron con un anticuerpo
antifluoresceina por 45 Min.
 Los Núcleos fueron visualizados con
metilgreen.

J Oral Pathol Med 30: 309–15

D1 p16 p21 p27
Germen
epitelio interno del Esporádico Disperso
esmalte
Epitelio externo del Esporádico Disperso
esmalte
Estrato intermedio Poco –nada Presente

Retículo estrellado Poco-nada Presente
Lamina dental Poco-nada Disperso
Núcleos cel.. epiteliales presente presente presente Presente

Ameloblastoma
Folicular y Mucho en Mucho en células
células polihedricas.
columnares Algunas columna-
Plexiforme y cuboidales res y cuboidales
periféricas periféricas
Núcleos cel. presente presente Presente
ameloblastoma
Cel. queratinizadas Ausente presente Ausente Intenso

Basales Positivo Esporádico

Glandulares ausente presente Ausente Ausente

Proteina p16 en ameloblastoma


Proteina p21

Proteina p27

Topo II a (núcleos) RNAm de histona H3
(citoplasma)
Germen
epitelio interno del Algunas algunas
esmalte
Epitelio externo del Poco
esmalte
Estrato intermedio Poco

Retículo estrellado Poco
Lamina dental Poco
Núcleos cel. epiteliales presente

Ameloblastoma
Folicular y Mucho en células columnares Algunas células cuboidales y

Plexiforme y cuboidales periféricas columnares de la periferia

Núcleos cel. Presente
ameloblastoma
Cel. queratinizadas

Basales

Glandulares

J Oral Pathol Med 30: 309–15 Kumamoto et al.

 LA CICLINA D1 SE HA IDENTIFICADO COMO
UN PROTOONCOGEN.(Motukura T)
 SU SOBREEXPRESION SE HA ENCONTRADO
EN CANCERES HUMANOS.(Donnellan)
 CICLINA D1 FUE DETECTADA EN CELULAS
EPITELIALES BASALES DEL GERMEN Y DEL
AMELOBLASTOMA.
 ESTOS HALLAZGOS SUGIEREN QUE LA
CICLINA D1 ESTÀ IMPLICADA EN LA
PROLIFERACIÒN CELULAR.

 LA PROTEINA p16 QUE ES UN INHIBIDOR DE
QUINASA DEPENDIENTE DE CICLINA (CKI),
ACTUA COMO SUPRESOR TUMORAL.(Quelle
DE)
 EN ESTE ESTUDIO LA p16 FUE DETECTADA EN
CELULAS EPITELIALES DEL GERMEN Y DEL
AMELOBLASTOMA, LO QUE SUGIERE QUE EL
EPITELIO ODONTOGENICO ES REGULADO
AMPLIAMENTE POR LA PROTEINA p16 Y QUE
EN TUMORES BENIGNOS NO HAY
ALTERACIÒN DE ESTE GEN.

 la proteína p21 es un supuesto inhibidor
del ciclo celular en respuesta al daño
del DNA.(el-deiry)
 la expresión de p21 fue diferente en las
distintas etapas del desarrollo.(Bloch-
zupan)
 la encontraron en etapas iníciales, lo
que sugiere relación con la
diferenciación celular del epitelio
odontogenico.

 La proteína p27, frena el crecimiento
celular e induce apoptosis.(polyak,
toyoshima,ohnishi)
 En este estudio células poliédricas
centrales, columnares periféricas fueron
positivas para p27 en germen dental y en
ameloblastoma.
 Las células queratinizadas de
ameloblastomas eran positivas para p27.
(kumamoto)
 Sugiere que la proteína p27 es funcional en
células no proliferativas o en reposo.
(kumamoto)

 La topoisomerasa IIa y la histona RNAm H3
fueron los marcadores de la fase del ciclo
celular estudiados.
(yabuki,maeyama,handa)
 También son marcadores de proliferación
celular.
 En este estudio estos marcadores fueron
localizados en células basales del germen
y del ameloblastoma, indicando
proliferación celular en el epitelio
ondontogenico.

 Estos hallazgos sugieren que :
› La ciclina D1 está implicada en la
proliferación celular.

› Que en tumores benignos no hay alteración
de la proteína p16.

› La proteína p21 se relaciona con la
diferenciación celular del epitelio
odontogenico.

 Estos hallazgos sugieren que :

› Que la proteína p27 es funcional en células
no proliferativas o en reposo.

› Que marcadores del ciclo celular, la
topoisomerasa IIa y la histona RNAm h3
estudiados, indican proliferación celular en
el epitelio ondontogenico.

JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1,
enero de 2000,
David Pozo, MSc, PhD, Juan J. segura, MD,
DDS, PhD, Alicia Jimenesz-Rubio, MD,
DDS, PhD, Antonio Garcia-Peñada, MSc,
I. Bettahi, MSc, Juan M. Guerrero, MD,
PhD, and Juan R. Calvo, MD, PhD.

“ Para identificar el mecanismo receptor
involucrado en la señal de traducción de
las células de la pulpa dental y observar la
expresión de las diferentes subunidades de
la proteína G en la pulpa dental humana
normal”

JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200

La estimulación de la superficie celular, inicia una serie de
respuestas a la señalización
Intracelular que son descritas como

Cascada de
transducción de
señales
mas o menos
secuencial ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000,
JOURNAL OF

Las células de la pulpa dental

Receptores para múltiples ligandos unidos a distintos
modelos de señalización intracelular.

El receptor de la señalización unido proteína G y el
tirosin Kinasa son 2 de los mecanismos de
comunicación trasmembrana utilizado por
numerosos agentes extracelulares

Tales como neuropéptidos, factores de crecimiento y
aminas vasoactivas.
JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000,

Neuropeptidos factores de crecimiento Amina vasoactivas

SUPERFICIE CELULAR RECEPTORA

PROTEINA G Membrana pulpa
Receptor de membrana celular
Pulpa celular
citoplasma
Efector
intracelular

Segundo mensajero

CELULA ESPECIFICA


Sustancia P: Proceso inflamatorio, ya que interactúa con
diferentes poblaciones de células inflamatorias.
Bradiquina Vasodilatador dependiente , aumenta la
permeabilidad vascular y también está relaciona
con el mecanismo del dolor.
Neuroquina A Inflamación y el dolor

Péptidos relacionados gen calcitonin Neuropéptido relacionado
(CGRP): Inflamación, vascularización
Peptido intestinal vasoactivo (VIP): Propiedad vasodilatadora
Acido gama aminobutirico (GABA) Neurotransmisor de dolor.

JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000,

Todos los receptores asociados con proteínas
G, tienen una estructura similar.
Polipéptido que atraviesa 7
Veces la bicapa lipidica
4 segmentos extracelulares
4 segmentos citosolicos .

El segmento carboxiloterminal,
(C4)
El bucle C3: interacción con
proteína
G.
Figure 20-10


 Las proteínas G
constan de 3
subuniddes: alfa, beta
y gama

Durante la señalización
intracelular las
subunidades B y gama
permanecen juntas

La subunidad G alfa, es
una proteína GTPasa
interruptora que
alterna entre un Biología Celular y molecular , Lodish, 5 edición, editorial panamericana, 2005

estado activo GTP y

4 subfamilias: (Gs, Gq, Gi, G ) 12

Gs y Gq: median los efectos estimuladores,
como la secreción hormonal.

Gi y G : media la inhibición de los procesos,
12

como secreción hormonal

Premolares removidos atraumaticamente

Razones ortodonticas

Premolares sin caries, restauraciones o enfermedad periodontal

6 pacientes con edades entre 10 y 22 años


Cada diente fue examinado:

Test frió de etil cloruro de esmalte
Test guta percha caliente en esmalte
Test de percusión

Todos respondieron dentro de limites


Inmediatamente a las extracciones los
dientes se almacenaron a 80 ° para la
preparación de la proteina pulpar.


Para Ensayo Western Blot:

 Los dientes congelados fueron partidos
longitudinalmente

 La pulpa se coloco en tubos para
iniciar el procesamiento


 Descrita por Towbin et al. en 1979

 La técnica del Western Blot (también
llamado “inmunoblotting” debido a que se
utilizan anticuerpos para detectar el
antígeno específico de interés.

 La especificidad de la unión antígeno –
anticuerpo permite la detección de una
única proteína dentro de una mezcla

Western Blot
Western Blot

Pasos:

1) Separación de las macromoléculas mediante geles de electroforesis

2) Transferencia a una segunda matriz generalmente una membrana
de nitrocelulosa o
PVDF.

3) Bloquea la membrana para evitar la unión inespecífica a su
superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la detección
de la proteína de interés.

4) Se une a dicha proteína transferida un anticuerpo especifico
marcado con una enzima y, finalmente, se añade un sustrato
apropiado para dicha enzima con lo que se produce un producto

Los tejidos pulpares de 7 dientes
Se recolectaron, agruparon y lavaron:

Con 50 mm de tris – HCl (PH 7.5) a 4 °C, y colocados
en el mismo contenedor con 0.2 mg/ml de
bacitracin, 0.01 mg /ml de leupeptina, 0.1 mg/ml
de inhibidor de tripsina, 0.1 mg/ml de N – α – tosil –
L – liseneclorometil ketona y 1mm de fenilmetil
sulfonifloruro ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 200
JOURNAL OF

Las suspensiones fueron centrifugados a
30.000 x g para 20 min a 4°C y fueron
disueltos en 60 mM de contenedor HCL,
que contenia glicerol al 10 %, SDS al 1% 1
mm de EDTA, 1mm ditiotreitol y lubrol al
0.05%.


 Las proteínas fueron medidas por el
método de Bradford

Utilizando suero de albúmina bovina como
estándar


 Un procedimiento simple para la determinación de
la concentración de la proteína en soluciones es el
análisis de la proteína de Bradford que fue descrito
primero por Bradford (Bradford y otros., 1976).

 Se basa en la unión de un colorante, Comassie
Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas.

 El colorante, en solución ácida, existe en dos
formas una azul y otra naranja.

 Las proteínas se unen a la forma azul para formar
un complejo proteína-colorante con un
coeficiente de extinción mayor que el colorante
libre.

 Este método es sensible , simple, rápido, barato y
pocas sustancias interfieren en su determinación.
Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas.

 Las proteínas de pulpa humana se
disolvieron en un contenedor de
muestra SDS y calentado por 3 minu a
94°C.

 Los geles acumulados y resueltos
contenian acrilamida al 5% y al 12%.


Las muestras y las marcas de peso molecular
preteñido fueron separados por SDS- PAGE
y transferidos electroforeticamente desde
los geles a las membranas nitrocelulares.


 SDS-PAGE es la electroforesis de proteínas más
ampliamente usada. Su nombre significa la
electroforesis en geles de poliacrilamida que se
realiza en presencia de SDS ('SDS-poliacrilamide
gel electroforesis').

 Fue descrito por Laemmli (Lammeli (1970), Nature,
277, p. 680)

 Se trata de un tipo de electroforesis
desnaturalizante en la que las muestras se
desnaturalizan por calor en presencia de agentes
desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que
destruye los puentes disulfuro, SDS que
desnaturaliza y recubre a la proteína), y se separan
como cadenas polipeptídicas aisladas.

 La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una
corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas
según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa . (
proteínas o ácidos nucleicos)

 Las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente)
que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del
peso molecular.

 Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras
cruzadas, con una malla).

 Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas
se moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las
pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más
pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán.

Laminas de nitrocelulosa trasferida fueron cortadas
en secciones, incubadas por 1h, en un cuarto con
temperatura con 50mm de HCL (ph 8.0), 2mm de
CaCl 2, 80 mm Na Cl, y leche seca no grasosa.


Las secciones fueron enjuagadas e
incubadas en esta solución de bloqueo
que contenía anticuerpos de proteína G
diluidas en 1: 1,000 por 2h a un cuarto de
temperatura .


 Las laminas fueron lavadas 3 veces dentro de 30
min en un contenedor WB.

 Las laminas lavadas fueron incubadas Hcl (ph: 7.5),
100mm de Nacl en un contenedor de TBST
anticuerpos de peroxidasa de inmunoglobulina .

 Posteriormente las laminas fueron lavadas 2 veces
dentro de 20 min en TBST.


El análisis de las proteínas de la pulpa dental humana,
separados por SDS- PAGE y transferidos a una membrana
nitrocelulosa revelaron que los productos gen, G alfa q, Bc ,
G alfa s, Gil- 2, y Gio-3 se expresaron en la Pulpa Humana.


 Demostraron que los productos G alfa q/
alfa 11, Beta c, G alfa s, Gil, G io-3,

Se expresaron en la Pulpa Humana


 Este estudio mostró la expresión gen
funcional de las subunidades del
receptor unido proteínas G en la pulpa
dental humana.


G alfa s : juega un papel mayor en la señal
de transducción del receptor unido a
proteínas G.

Gil -2 y Gio - 3 : mostró un peso molecular r G
alfa q/ alfa elativo en la pulpa. (10) Calvo JR,
Pozo D, Guerrero JM,

G alfa q/ alfa 11: ambas mostraron un peso
molecular relativo. (11) Mochizuki N, Urasawa K, Sanchez A,
SDS - PAGE
Insel P.

 No solo la identificación de alfa s, alfa i,
alfa q, es crucial para la transducción de
señales en la pulpa humana.

 La presencia de complejo B gama es
importante porque incrementan la afinidad
de las subunidades alfa para GDP.


Pulpa inflamada
Examinación histológica

Células inflamatorias
(13) Okijit T, Kawashima N, Kosaka T, Matsumoto A, Kobayashi C, Suda H.

*Neuropeptidos
*Péptidos
Interacción entre irritantes exógenos y *Comp de sist complementario
Células de la pulpa dental puede liberar *Aminas vasoactivas citocinas
Mediadores químicos endógenos

Dependen de las proteínas G
Para mediar la comunicación entre
RECEPTOR - EFECTOR

(14) Torabinejead M.

Fibras del nervio peptidergico

Secretan ligandos

Sustancia P , CGRP: han estado implicados en,
regulacion de flujo de sangre, vasodilatación y
respuesta inflamatoria.

VIP, la sustancia P y CGRP: juegan un papel
importante en el progreso de la inflamación. (15) Kim
S.

?????????????????(16) Segura JJ, Guerrero JM, Pozo D, Calvo JR,

 La señal receptora unida a la proteína G es el
mecanismo de comunicación de los
neuropéptidos con la membrana.

 La pulpa humana contiene la maquinaria
necesaria para responder a Neuropéptidos
liberados por las fibras del nervio peptidergico (17)
Calland JW, Harris EH, Carnes DL


1. JOURNAL OF ENDONTICS, VOL 26, No 1, enero de 2000.
2. Biología Celular y molecular , Lodish, 5 edición, editorial
panamericana, 2005.
3. Introduccion a al Biologia Celular, Bruce Alberts, 2 edicion,
editorial panamericana, 2006.
4. La celula, Geoffrey M. Cooper, 2007
5. J Oral Pathol Med 2001: 30: 309-15, Hiruyuki Kumamoto,
Kenji Kimi, Kiyoshi Ooya, Departemnet of Oral Patology,
Tohoku University School of Dentistry, Sendal, Japan.
6. http://es.wikipedia.org/wiki/Bradiquinina
7. http://encolombia.com/foc-C.htm

MATRIZ EXTRACELULAR
“Red organizada de materiales extracelulares que está mas
allá de la vecindad de la membrana plasmática”
“Asociación amorfa de:
PROTEINAS Y POLISACÁRIDOS”

Gerald Karp- Cell and Molecular Biology

Compleja e interactiva asociación de
macromoléculas y pequeñas moléculas, en
constante equilibrio dinámico, con
capacidad para regular la expresión de
genes de las células contenidas en ella

Mariotti A, Periodontology 2000; 1993

MATRIX
EXTRACELULAR

?
COMPOSICION
Colágenos

MOLECULAS
M
O
Proteínas
R
F
DE ADHESION No
FACTORES
O
colágenas
DE
G
CRECIMIENTO
E
Proteoglicanos
N
O
MOLECULAS
S
DE ADHESION

MATRIZ EXTRACELULAR
(Componentes)

FIBRILAR
COLÁGENO
(glicoproteína) NO FIBRILAR
SYNDECAN
HEPARAN SULFATO BETAGLICANOS
PROTEOGLICANOS
KERATAN SULFATO BYGLICAN
(Proteína + polisacáridos)
DERMATAN SULFATO

TENASCINA
OTRAS FIBRONECTINA
PROTEINAS LAMININA
TROMBOSPONDINA
ENTACTINA

COLAGENO

GLY – X – Y – GLY – X – Y - GLY

PROLINA
GLICINA
HIDROXIPROLINA

 La síntesis del colágeno se inicia en el citoplasma formándose
cadenas aisladas que son llevadas al retículo endoplásmico donde
los residuos de lisina y de prolina son hidroxilados, mediante sendas
enzimas que requieren Fe+3 y vitamina C como cofactores () . La
hidroxilación de la prolina hace termoestable a la proteína,
mientras que la hidroxilacion de la lisina permitirá el
entrecruzamiento de varias triples hélices. En este punto, las glicosil-
transferasas del retículo endoplásmico glicosilan algunos restos de
hidroxilisina. La triple hélice es ensamblada entonces quedando los
extremos como polipéptidos libres, que pueden plegarse para
formar las estructuras globulares. Las triples helices son
transportadas al aparato de Golgi donde son modificadas por
sulfatación, fosforilándose algunas serinas. El procolágeno resultante
terminado es excretado de la célula a través de vesículas
secretoras
 La conversión del procolágeno en colágeno tiene lugar
extracelularmente. Los telopéptidos terminales son hidrolizados por
proteasas específicas y las triples hélices se ensamblan en fibrillas,
momento en el que pueden participar otras proteínas del tejido
conjuntivo como la laminina. Algunos de los restos de hidroxilisina
son convertidos a aldehidos reactivos por la lisil-oxidasa, aldehidos
que reaccionan con otros restos de lisina o hidroxilisina para formar

CARACTERISTICAS ESPECIALES
DE LA MOLECULA DE COLAGENO

Es una triple hélice continua o interrumpida por
proteínas no colágenas

La secuencia es Gly-X-Y.
Glicina es esencial para conformar la hélice

Únicos con hidroxiprolina e hidroxilisina. (Y)

Contienen muchos enlaces cruzados intermoleculares.
Gran estabilidad

 Familia de glicoproteínas fibrosas.
 Fuerza tensil.
 Proteína individual en humano (25%)
 Se produce en fibroblastos , algunas
células del tejido conectivo , músculo
liso y epiteliales.

TIPO DISTRIBUCIÓN
 I Piel, hueso, tendón, córnea, vasos
sanguíneos (↑ rigidez).
 II Cartílago, discos intervertebrales (↑
elasticidad).
 III Piel fetal, vasos sanguíneos
 IV Membrana basal (NO FIBRILAR)
 V Placenta, piel
 IX, XII Y XIV Interrupción de la triple hélice
(Cartílago).

MEDIADORES QUE AFECTAN
SINTESIS DE COLAGENO

F. DE CRE CITOCINAS HORMONAS OTROS
CIMIENTO

PDGF ↑ IL-1α ↓ PGE2 ↓
Glucocorticoides ↓
TGF-β↑ IL-1β ↓
FGF ↑ IFN-γ ↓
IGF ↑ TNF-α↓

MATRIZ EXTRACELULAR
(Componentes)

PROTEOGLICANOS ó
GLICOSAMINOGLICANOS
(GAGs)
Contribuyen a la adhesividad
celular, mediante su interacción
con la superficie celular

MATRIZ EXTRACELULAR
(Componentes)

SINDECAN
Transmite señales a proteínas transmembranales, como las
integrinas, que a su vez interactúan con el citoesqueleto, el cual
facilita la interacción de los filamentos de actina
GAG (Heparan sulfato): media la unión con la fibronectina y el
colágeno
Gerald Karp- Cell and Molecular
Biology

Nidogen
Laminina
Tenascina

Fibronectina Vitronectina
PROTEINAS
Osteonectina NO Osteocalcina
COLAGENAS

Sialoproteína
Trombospondina
ósea

Elastina

MATRIZ EXTRACELULAR
(Otras Proteínas)

Glicoproteína de
adhesión celular,
se encuentra
formada por un
dímero de unidades
idénticas,
enlazadas entre sí
FIBRONECTINA por puentes
disulfuros.
Fijación de células a todas las matrices
que contienen colágeno fibroso

LAMININA

3(A)
3(B1)
3(B2)

Se localiza en la membrana basal y tiene un papel
fundamental en el desarrollo embrionario, durante el proceso
de implantación.

MATRIZ EXTRACELULAR
(Otras Proteínas)

• Red laminar de
componentes de la
matriz extracelular.
• Da sostén al epitelio.
 Deja pasar ciertas
moléculas.
 Adhesión celular.

MEMBRANA BASAL  Influye sobre la
(Laminina – Colágeno diferenciación celular y
tipo IV)
la reparación de los
tejidos.


OSTEOPONTINA

C

Formación y Thr
reabsorción ósea N

D
G
R
HA Ser-PO4
N-linked
olisaccharide

OSTEOCALCINA

N
C
Asp-Glu-
β- sheet Sheet

β-turn

HA Gla-helix

SIALOPROTEINA OSEA

Ser-PO4
Su expresión
C induce la
N Thr-PO4 emergencia de
osteoblastos
D
Tyr-SO4
G Esencial en la
R mineralización de
tejidos y
formación ósea
HA O-linked
oligosaccharide Predomina el
ácido glutámico

ADHESIÓN DE CÉLULAS A
SUBSTRATOS NO CELULARES

Las integrinas son un
conjunto de
glicoproteínas formadas
por la asociación de dos
subunidades, α y β.
Presentan peso
molecular que varía de
90 a 220 Kd. Son
mediadoras de las
interacciones célula
célula y célula-matriz;
muchas de estas
INTEGRINAS acciones son mediadas
por la secuencia RGD

MATRIZ EXTRACELULAR
La MEC es más que un material pasivo, protector e inerte.
Juega un papel clave en múltiples actividades
celulares.
PROTECCIÓN MECÁNICA

SELECTIVIDAD

MIGRACIÓN CELULAR

FUNCIONES PROLIFERACIÓN CELULAR

DIFERENCIACIÓN CELULAR

SEÑALIZACIÓN CELULAR

DISPOSICIÓN TRIDIMENSIONAL
DE TEJIDOS Y ÓRGANOS

MEC CELULA
CITOESQUELETO
MATRIZ NUCLEAR

MEC RECEPTORES DE MEMBRANA
Señales CITOPLASMA Citoesqueleto NUCLEO

Afectan GENES Expresión
ESPECIFICOS

Bisell, M., Hall H., Perry G: How does the extracellular matrix direct gene Expression ? J. Theor Biol 1982;99:31-68

HOMEOSTASIS DEL TEJIDO
CONECTIVO

SÍNTESIS DE DEGRADACIÓN
PROLIFERACIÓN
PROTEÍNAS DE DE PROTEINAS
CELULAR
LA MEC DE LA MEC

FAGOCITOSIS MMPs
TIMPs

FACTORES DE CRECIMIENTO Y
CITOCINAS FIBROGÉNICAS

CÉLULAS DEL
FIBROBLASTOS
SISTEMA INMUNE

Características de las células apoptóticas

Reducción del volumen celular
Compactación de las organelas
Condensación de la cromatina
Fragmentación del ADN
Exposición de fosfatidil-serinas en
el lado externo de la membrana
plasmática
Formación de “cuerpos
apoptóticos”

Vías principales de apoptosis en
mamíferos

Hengartner et al, Nature, 2000, 407: 770

Caspasa
s
cysteine-dependent aspartate-specific proteases

Activación por receptores de muerte

ApoReview: Introduction to Apoptosis. Andreas Gewies (2003)

ApoReview: Introduction to Apoptosis. Andreas Gewies (2003)

Miembros de la familia de Bcl-2

Los niveles relativos de los miembros anti/pro-
apoptóticos determinan el destino celular.

Los miembros antiapoptóticos se localizan en
membranas. Los proapoptóticos principalmente
en citoplasma y se translocan a la mitocondria
ante un estímulo de muerte.

Regulan la liberación desde la mitocondria de
proteínas que inducen la apoptosis.

Posibles mecanismos de acción de los
miembros de la familia de Bcl-2

Quiste radicular apical
(ARC), es la lesión quística
más frecuente en los
maxilares (Shear 1985).

Son un desorden
inflamatorio periapical
provocado por pulpa
dental necrótica e
infectada (Torabinejad 1983,
Shear 1985, Meghji 1996).

En tales circunstancias,
las toxinas bacterianas
(LPS – lipo-
polisacaridos) y
mediadores
inflamatorios (IL-1 y
PEG2), continuamente
se relacionan con la
reabsorción del hueso
alveolar y su sustitución
por tejido de
granulación
(granuloma apical. Gervasio et

Como los restos epiteliales
de Malassez son comunes en
esta área, otros mediadores
como IL-6 y EGF, liberados
dentro de los tejidos
periapicales, inducen la
proliferación de estas células
epiteliales.

Esto es el evento central
histogenético, para el
desarrollo de ARC
(Nickolaychuk 2002).

Cuando se forma la cavidad
central → QUISTE

El alargamiento de la
lesión ocurre por una
continua reabsorción
ósea y la presencia de
factores de
crecimiento desde el
tejido conectivo
inflamado o entrada
de liquido desde el
lumen por presión
osmótica (Torabinejad 1983
y Nickolaychuk 2002).

Aspectos morfológicos del epitelio han sido
considerados como reflejo funcional de la
actividad de ARC (Cury et al 1998).

Lesiones con una capa regular y fina de epitelio
escamocelular estratificado atrófico con infiltrado
inflamatorio en el tejido conectivo, son
consideradas quistes quiescent (detenidos).

Epitelio escamoso estratificado de células
epiteliales hiperplásicas de grosor irregular pero
creciente, a menudo en arcadas de proliferación,
y con infiltración severa de células inflamatorias en
la cápsula, se ha considerado como característica
de lesiones activas (Cury et al 1998 y Moreira et al 2000).

Muerte celular puede ser iniciada por señalización
celular
Dos mecanismos de muerte celular son conocidos:
necrosis y apoptosis (Searle et al 1982 y Loro et al 2003).
Necrosis: destrucción masiva del tejido celular,
ocasionada por señales ambientales que
sobrepasan la respuesta celular adaptativa.
Apoptosis: mecanismo de muerte celular
programada genéticamente que participa en el
control homeostático de la población celular
(Blagosklonny 2003, Satchell y col. 2003).
La supervivencia de la célula en los tejidos
depende de la llegada continua de señales
positivas (fuente de oxígeno).

La carencia de tales estímulos activa vías
apoptóticas para disminuir a la población celular
(Chu y cols. 2002, Blagosklonny 2003, Loro y cols. 2003,
Renton y cols. 2003).

Apoptosis ocurre en células individuales o
grupos pequeños de células y son iniciados por
señales específicas (hipoxia y aumento de la
actividad proliferativa) que activan las vías
intracelulares que conducen a cambios
mitocondriales, citoesqueléticos y nucleares.

La célula apoptótica se fragmenta y los
macrófagos u otras células vecinas la fagocitan,
sin la liberación de mediadores inflamatorios
(Blagosklonny 2003, Loro y cols. 2003).

Investigar la frecuencia de muerte celular
por apoptosis, en el epitelio de los
quistes radiculares y comparar su
frecuencia en lesiones presentando
estados funcionales distintos.

Muestra: 20 quistes radiculares apicales.
Todos los quistes mostraron una línea
epitelial completa en los cortes histológicos
evaluados.
Se clasificaron de acuerdo al estado
funcional del epitelio en hiperplásicos o
atróficos (Cury et al 1998).
La evaluación morfológica de apoptosis se
realizó en cortes histológicos de 5µm
coloreados con el método convencional
H&E (hematoxilina – eosina).

Dos investigadores fueron calibrados para evaluar
la alteraciones características de las células
Se evaluaron los siguientes parámetros:
* Contracción nuclear
* Hipercromasia de la cromatina
* Separación de células vecinas
30 secuencias de microscopia de campo de alto
poder fueron evaluadas, con un aumento de
1000x. Para establecer el recuento de células
apoptoticas y no apoptoticas.
El análisis estadístico se realizó por la técnica Jack-
knife y bootstrap que modelan muestras repetidas
y permiten establecer el ES y los IC

(Goldsworthy y otros. 1995, Loro y otros. 2003

La coloración inmunohistoquímica de
el Ag Bcl-2 fue realizado con el Ac
monoclonal “124” (Dako, Carpintería, CA,
EEUU). Diluido en 1: 75 en 5 mmol/L de
Buffer Tris-HCl con albúmina bovina al 1%.
Se hicieron cortes de tejido fino de 3 µm
revestidas con silano y rehidratada con
etanol, sometidos a la recuperación del Ag
por vapor EDTA Buffer, pH 8.2.
Luego incubado con el Ac primario por 18
horas a 4°C.

Células apoptóticas (AI) y Bcl-2 teñidas
inmunohistoquímicamente (Bcl-2I) fueron
determinadas como la razón entre
apoptóticas o células positivas bcl-2 y
el número total de células.
Comparación del promedio entre
grupos de epitelio hiperplásico y atrófico
se realizó usando t-test.
La posible correlación entre AI y Bcl-2I
se evaluó con el test de Spearman.
La significancia estadística se evaluó al
5%.

Células apoptóticas y Acs se observaron
en el epitelio de todos los quistes

El promedio de Al fue 0.134 (SD 0.188).
Apoptosis fue más frecuente en epitelio
atrófico (AI χ: 0.170 SD 0.247) que en
epitelio hiperplásico (χ: 0.098 SD 0.103) .
De igual manera bcl-2I fue encontrada
en epitelio atrófico (χ: 0.06 SD 0.03) que
en epitelio hiperplásico (χ: 0.04 SD 0.01).
Estas diferencias no fueron
estadísticamente significativas.

La detección inmunohistoquímica del
Ag bcl-2 fue observado como una leve
coloración café citoplasmática de
células individuales.
El promedio de bcl-2I fue 0.073 (SD
0.027).
Una correlación positiva y significante
fue encontrada entre Al y bcl-2I
(R = 0.71, p < 0.05)

El trabajo demostró la muerte celular
apoptótica en el epitelio de ARC.
Este proceso se observó en todas las
lesiones observadas.
Se demostró apoptosis en leucocitos del
tejido conectivo obtenido de las
lesiones. Ningún estudio se había
realizado en ARC (Takahashi y cols 1999).

En la literatura endodóntica, la
cavitación adentro de granulomas
epitelizados ocurre cuando las células
internas de los islotes epiteliales
proliferativos llegan a ser distantes del
tejido conectivo de soporte (Summers &
Papadimitriou 1975, Torabinejad 1983).

La isquemia resultante disminuye los
niveles del ATP en la célula, rompiendo
las bombas electrolíticas y permitiendo
el influjo citoplasmático de Ca2+.

Esto activa las enzimas que causan los
cambios celulares morfológicos,
característicos de necrosis y la
subsecuente formación de la cavidad
quística (Searle et al. 1982, Blagosklonny 2003, Renton et
al. 2003).
Lo anterior a pesar de que la isquemia
leve es necesaria para poder inducir la
apoptosis más que la necrosis (Chu y cols.
2002, Blagosklonny 2003)

Una disminución precipitada de
oxigeno no ocurre en la lesión
inflamatoria periapical.

Aún cuando los resultados no pueden explicar la
formación de la cavidad en ARC, y no descartan
la muerte por necrosis de la célula, sugieren la
participación de la apoptosis en el desarrollo de
ésta lesión.
Las células de proliferación no neoplásicas
responden a la hipoxia y a las restricciones
alimenticias activando los genes capaces de
inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis
(Chu y cols. 2002, Renton y cols. 2003).
Anteriormente se realizó un intento para demostrar
que el epitelio atrófico tiene mas eventos
apoptoticos que el epitelio hiperplasico, este
ultimo se considera una lesión menos activa (Cury
et al. 1998, Moreira et al. 2000).

Los resultados demuestran esta situación
sugiriendo un papel de la apoptosis en
el control de las poblaciones celulares
en quistes radicular.
La regulación de la apoptosis por las
proteínas bcl-2 es dependiente de
niveles relativos de moléculas inhibitorias
e inductivas (Adams y Cory 1998).
La correlación positiva e inesperada
entre el AI y bcl-2I puede ser el resultado
de los caminos reguladores que actúan
en las células epiteliales.

Apoptosis se encontró siempre presente en el
epitelio del ARC. Aunque fue más
frecuente en lesiones con epitelio atrófico
(detenido) , sin diferencias significativas
entre los grupos analizados.

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