1. UTILIDAD DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA δ-
ALAD COMO BIOMARCADOR DE EXPOSICIÓN Y
EFECTO A BAJAS CONCENTRACIONES DE PLOMO
EN BÚHO REAL (Bubo bubo)
P. Gómez-Ramírez1
, E. Martínez-López1
,P. María-Mojica1
, M. León- Ortega2
, J.E.
Martínez2
, J.F. Calvo2
, F. Botella3
, J.A. Sánchez-Zapata3
, A.J. García-Fernández1
1Área de Toxicología, Universidad de Murcia. ajgf@um.es
2Área de Ecología e Hidrología, Universidad de Murcia.
3Área de Ecología e Hidrología, Universidad Miguel Hernández.
Agradecimiento al MICIIN por la financiación de los proyectos CGL2004-5959/BOS y
CGL2008-4318/BOS

2. INTRODUCCIÓN

3. El plomo en aves
Introducción
UBICUO
PERSISTENTE
ACUMULABLE EN LOS SERES VIVOS
EXPOSICIÓN CRÓNICA
-Alt. Reproducción
-Alt. Sistema inmune
-Alt. Comportamiento
-Inducción de tumores
Burger y Gochfeld, 2000

4. Introducción
Monitorización
“Recolección repetida de datos durante un periodo de tiempo”
METALES
BIOMONITORIZACIÓN

5. Introducción
Biomarcadores
 Cambios a nivel celular, bioquímico o molecular
inducidos en los seres vivos como consecuencia de la
exposición a contaminantes
Actividad de la hemosintetasa
Actividad de la δ-ALAD

6. Introducción
Biomarcadores
Especie Estadísticos
Concentración de Plomo en
sangre (μg/dL)
Actividad δ-ALAD
(μmol PBG/h/L de glóbulos rojos)
Zona
contaminada
Zona no
contaminada
Zona
contaminada
Zona no
contaminada
Búho Virginiano
(Bubo virginianus)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
3.8
< 5 -14
(10)
-
219.7
93-346
(10)
-
Aguilucho del norte
(Circus cyaneus)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
6.7
<3.8-67.5
(41)
4.2
<1.4-14.1
(8)
399
174-600
(41)
612.6
529-671
(8)
Cernícalo Americano
(Falco sparverius)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
24
< 5 -227
(30)
8.7
<3.4-35
(22)
256.6
51-393
(30)
566.1
383-724
(22)
Halcón de cola roja (Buteo
jamaicensis)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
<5
-
(2)
<5
-
(2)
188.6
165-313
(2)
323.5
294-353
(2)
Autillo Californiano
(Megascops kennicottii )
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
10
<5-71
(3)
-
473.3
469-478
(3)
-
Aguililla calzada
(Hieraaetus pennatus)
(Martínez-López et al. 2004)
Media ± SD
mín-máx
(n)
-
3.21 ± 1.98
1.10-10.57
(27)
-
679.1 ± 67.
537.5- 849.1
(18)
Busardo ratonero
(Buteo buteo)
(Martínez-López et al. 2004)
Media ± SD
mín-máx
(n)
-
2.74± 1.04
1.34-3.54*
(4)
-
744.2 ± 87.9
650. -852
(4)
Azor
(Accipiter gentilis)
(Martínez-López et al. 2004)
Media ± SD
mín-máx
(n)
-
7.60 ± 3.64*
3.93-11.21
(3)
-
584 ± 51.7*
539-640.5
(3)
Niveles de actividad de δ-ALAD (μmol PBG/h/L de glóbulos rojos (RBC) y plomo en sangre de pollos de
diferentes especies de aves de una zona contaminada y otras consideradas no contaminadas.

7. OBJETIVOS

8. Objetivos
1. Proporcionar información respecto a los
niveles de actividad de la enzima δ-ALAD
en pollos de Búho real (Bubo bubo).
2. Evaluar la utilidad de la actividad de la
enzima δ-ALAD como biomarcador de
exposición y efecto a bajas
concentraciones de plomo en la misma
especie.

9. MATERIAL Y MÉTODOS

10. Especie de estudio
Material y métodos
BÚHO REAL (Bubo bubo)
Orden Strigiformes
Familia Strigidae

11. Área de estudio
Material y métodos

12. Material y métodos
Toma de muestras
Época de cria (Marzo-Junio) desde 2003.
•Pollos de aproximadamente 30 días de edad
•Vena braquial
•Aguja 23G, jeringuilla 5ml

13. Preparación de las muestras para el análisis: DIGESTIÓN HÚMEDA
García- Fernández et al., 1995
Muestra digerida
Material y métodos
Determinación de plomo en sangre
0.2 ml de sangre en tubo de
cuarzo
+
0.5 ml de mezcla de ácidos
nítrico/perclórico/sulfúrico
(8:8:1) Calidad Suprapur®
(Merk ®
)
TRATAMIENTO TÉRMICO EN
DIGESTOR Selecta®
149
muestras
DETERMINACIÓN ANALÍTICA

14. Electrodo
auxiliar de
platino
50 μl HCl (Electrolito
soporte-tampón)+10 ml
agua Milli-Q
Electrodo de
referencia:
Ag/AgCl, KCl 3
mol/l
Electrodo de
trabajo:
electrodo de
mercurio
multimodo
Material y métodos
Análisis de plomo:
Voltamperometría de
redisolución anódica
de pulsos diferencial
(García- Fernández et
al.,1995)
Determinación de plomo en sangre
149
muestras

15. DUPLICADO
Determinación de la actividad δ-ALAD en sangre
Material y métodos
Scheuhammer (1987)
Sangre+ Triton X-100
SANGRE
HEMOLISADA
ALA MES
H2O
milli-Q
BLANCO
+ TCA/Hg2+
Incubación
42ºC 1h
Centrifugación
13000 rpm/10 min
SOBRENADANTE
Incubación
42ºC 1h
+ TCA/Hg2+
MUESTRA
256
muestras

16. Determinación de la actividad δ-ALAD en sangre
Material y métodos
SOBRENADANTE
+
Reactivo de Ehrlich’s
modificado
INCUBACIÓN A Tª AMBIENTE 10 MINUTOS
256
muestras

17. Material y métodos
Determinación de la actividad δ-ALAD en sangre
Lectura a 555 nm espectrofotómetro de luz ultravioleta (Shimadzu 1603)

18. Material y métodos
Determinación de la actividad δ-ALAD en sangre
μmol PBG/h/L de glóbulos rojos (RBC) = (FD x (PBG)-1
x M)/ Hct x100
FD (Factor de dilución) = 71,875
PBG)-1
= (Absorbancia PBG)-1
= 16,13
M (Absorbancia de la muestra) = absorbancia medida a 555 nm
Hct = hematocrito
Cálculo de la actividad enzimática de δ-ALAD

19. Análisis estadístico
Material y métodos
Estadística descriptiva
Test no paramétrico de Spearman
Paquete estadístico SPSS v15.0

20. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

21. Resultados y discusión
Concentraciones de plomo en sangre
• 4.8 ± 3.3 µg/dL de plomo en sangre → Aves no expuestas
• ≤ 15 µg/dL de plomo en sangre → Ausencia de exposición anormal en aves
(Scheuhammer, 1989)
En nuestro estudio:
4.13 ± 4 µg/dL de plomo en sangre

22. Resultados y discusión
Concentraciones de plomo en sangre
Niveles de plomo en sangre:
• Búho real: 7.6±2 μg/dL (García-Fernández et al., 1997)
• Aguililla calzada: 3.21±1.98 μg/dL (Martínez-López et al., 2004)
• Busardo ratonero: 2.74±1.04 μg/dL (Martínez-López et al., 2004)
• Azor: 7.60 ± 3.64 μg/dL (Martínez-López et al., 2004)
• Águila pescadora: 2-4 μg/dL (Henny et al., 1991)

23. Resultados y discusión
Actividad δ-ALAD en sangre
Valores medios:
154.71 ± 120.65
μmol PBG/h/L de
glóbulos rojos
Especie Estadísticos
Concentración de Plomo en
sangre (μg/dL)
Actividad δ-ALAD
(μmol PBG/h/L de glóbulos
rojos)
Zona
contaminada
Zona no
contaminada
Zona
contaminada
Zona no
contaminada
Búho Virginiano
(Bubo virginianus)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
3.8
< 5 -14
(10)
-
219.7
93-346
(10)
-
Aguilucho del norte
(Circus cyaneus)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
6.7
<3.8-67.5
(41)
4.2
<1.4-14.1
(8)
399
174-600
(41)
612.6
529-671
(8)
Cernícalo Americano
(Falco sparverius)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
24
< 5 -227
(30)
8.7
<3.4-35
(22)
256.6
51-393
(30)
566.1
383-724
(22)
Halcón de cola roja (Buteo
jamaicensis)
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
<5
-
(2)
<5
-
(2)
188.6
165-313
(2)
323.5
294-353
(2)
Autillo Californiano
(Megascops kennicottii )
(Henny et al., 1994)
Media
mín-máx
(n)
10
<5-71
(3)
-
473.3
469-478
(3)
-
Aguililla calzada
(Hieraaetus pennatus)
(Martínez-López et al. 2004)
Media ± SD
mín-máx
(n)
-
3.21 ± 1.98
1.10-10.57
(27)
-
679.1 ± 67.
537.5- 849.1
(18)
Busardo ratonero
(Buteo buteo)
(Martínez-López et al. 2004)
Media ± SD
mín-máx
(n)
-
2.74± 1.04
1.34-3.54*
(4)
-
744.2 ± 87.9
650. -852
(4)
Azor
(Accipiter gentilis)
(Martínez-López et al. 2004)
Media ± SD
mín-máx
(n)
-
7.60 ± 3.64*
3.93-11.21
(3)
-
584 ± 51.7*
539-640.5
(3)

24. Resultados y discusión
Relación concentración de plomo - actividad δ-ALAD en sangre
Relación entre actividad δ-ALAD (μmol PBG/h/L de glóbulos rojos) y concentraciones de plomo
(μg/dL) en sangre de pollos de búho real
(rho=-0.148, p<0,1)

25. Relación entre actividad δ-ALAD (μmol PBG/h/L de glóbulos rojos) y concentraciones de plomo
(μg/dL) en sangre de pollos de búho real cuando las concentraciones de plomo son superiores a 3
μg/dL (rho=-0,201, p<0,1).
Resultados y discusión
Relación concentración de plomo - actividad δ-ALAD en sangre
(rho=-0.201, p<0,1)

26. CONCLUSIONES

27. Conclusiones
1. La existencia de una correlación negativa entre los niveles
de plomo y la actividad de la enzima δ-ALAD en sangre
sugiere que se trata de un biomarcador muy sensible de
exposición y efecto en los pollos de Búho real (Bubo bubo)
en condiciones de exposición de base a plomo.
2. La sensibilidad de este biomarcador es mayor a
concentraciones de plomo en sangre superiores a 3 μg/dL,
coincidiendo con resultados previos en otras especies de
rapaces de la misma área de estudio.

28. REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS

29.  Burger J, Gochfeld M. 2000. Metals in albatross feathers from Midway Atoll:
Influence of species, age, and nest location. Environ Res A 82:207-221
 García- Fernández A.J., Motas-Guzmán M., Navas I., María-Mojica P., Luna A.,
Sánchez-García J.A. 1997. Environmental exposure and distribution of lead in four
species of raptors in Southeastern Spain. Archivesof Environmental Contamination
and Toxicology 33: 76-82
 García-Fernández A.J., Sánchez- García J.A., Jiménez- Montalbán P., Luna A. 1995.
Lead and cadmium in wild birds in southeastern Spain. Environmental. Toxicology
and Chemistry 14(12): 2049-2058.
 Henny CJ, Blus LJ, Hoffman DJ, Grove RA. 1994. Lead in hawks, falcons and owls
downstream from a mining site on the Coeur d'Alene river, Idaho. Environ Monit
Assess 29: 267-288
 Martínez-López E., María-Mojica P., Martínez J.E., Peñalver J., Pulido M., Calvo J.F.,
García-Fernández A.J. 2004. Lead in feathers and δ-Aminolevulinic acid dehydratase
activity in three raptor species from an unpolluted mediterranean forest
(Southeastern Spain). Archiv Environ Contam and Toxicol 47: 270-275
 NRC (U.S. National Research Council).1991. Animals as Sentinels of Environmental
Health Hazards. National Academy Press, Washington, DC.
 Scheuhammer AM. 1987 . Erythrocyte delta-aminolevulinic acid dehydratase in
birds. II. The effects of lead exposure in vivo. Toxicol 45:165-175
 Scheuhammer AM. 1989. Monitoring wild bird populations for lead exposure. J Wildl
Manage 53:759-765
Referencias bibliográficas

30. MUCHAS GRACIAS