El uso de agentes de control biológico antagonistas del suelo, tales como Trichoderma sp., es reconocido ampliamente como un método de lucha contra enfermedades causadas por hongos del suelo. Diversas cepas han sido evaluadas, determinando su efecto inductor de mecanismos de defensa local y sistémico, por medio de interacciones entre el antagonista con las raíces, conduciendo a la acumulación de moléculas de defensa, como las peroxidasas. Al efecto, para evaluar la presencia de diferentes compuestos inductores de la resistencia a diversas enfermedades se realizó la presente actividad de laboratorio, evaluando las cepas de Trichoderma sp. LIG064 y LIG006. El material para la extracción de proteínas e isoenzimas, y la separación mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE, se realizó siguiendo el protocolo modificado citado por Salazar et al. (2011). En general, la lectura de las bandas permitió diferenciar la presencia de elementos inductores de control biológico en las cepas de Trichoderma sp. evaluadas.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DEL TÁCHIRA
VICERRECTORADO ACADÉMICO - DECANATO DE POSTGRADO
MAESTRÍA EN AGRONOMÍA PRODUCCIÓN VEGETAL
Técnicas Avanzadas de Laboratorio 2016-B
CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE Trichoderma sp. MEDIANTE LA
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS E ISOENZIMAS POR ELECTROFORESIS
Vázquez Chacón Jose Yvanosky. Laboratorio de Investigaciones Genéticas. UNET.
RESUMEN
El uso de agentes de control biológico antagonistas del suelo, tales como Trichoderma sp.,
es reconocido ampliamente como un método de lucha contra enfermedades causadas por
hongos del suelo. Diversas cepas han sido evaluadas, determinando su efecto inductor de
mecanismos de defensa local y sistémico, por medio de interacciones entre el antagonista
con las raíces, conduciendo a la acumulación de moléculas de defensa, como las peroxidasas.
Al efecto, para evaluar la presencia de diferentes compuestos inductores de la resistencia a
diversas enfermedades se realizó la presente actividad de laboratorio, evaluando las cepas de
Trichoderma sp. LIG064 y LIG006. El material para la extracción de proteínas e isoenzimas,
y la separación mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE, se realizó
siguiendo el protocolo modificado citado por Salazar et al. (2011). En general, la lectura de
las bandas permitió diferenciar la presencia de elementos inductores de control biológico en
las cepas de Trichoderma sp. evaluadas.
Palabras clave: Control biológico, resistencia inducida, isoenzimas, peroxidasas.
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades de origen fúngico
causadas por hongos fitopatógenos
provocan grandes pérdidas en la
agricultura (Rey et al., 2000); estas
mermas consisten en la baja calidad y
productividad de las cosechas (Monte,
2001). La agricultura tradicional basada en
el control de las enfermedades por medio
de la aplicación de productos sintéticos, en
su mayoría tóxicos y de amplio espectro,
además de eliminar los agentes
fitopatógenos, eliminan agentes benéficos,
incluyendo la flora del suelo que
interviene en la supresividad del suelo
(Vinale et al., 2008). De manera tal, se

2. requiere la búsqueda de alternativas
encaminadas al manejo de agentes
antagonistas que resulten seguros y afines
con el medio ambiente (Cupull et al.,
2003).
Trichoderma sp. es un organismo de vida
libre en suelos y ecosistemas de raíz,
donde se pueden observar interacciones
complejas entre la planta huésped, los
patógenos y diversos factores del ambiente
(Harman, 2006). Este es un hongo fácil de
aislar y cultivar en medios de cultivo
naturales o semisintéticos (Rey et al.,
2000). Al respecto, el uso de Trichoderma
sp., como agente de control biológico
constituye una buena alternativa al control
químico (Agrios, 2007).
El modo de acción a nivel bioquímico de
los inductores de resistencia tanto
biológicos, como el Trichoderma sp.,
consiste en la activación de genes que
codifican una serie de enzimas
involucradas en la síntesis de lignina y
aquellas con efecto antimicrobiano directo
como las peroxidasas, polifenoloxidasas y
fitoalexinas (Resende et al., 2000).
También, promueven la síntesis de
proteínas relacionadas con el proceso de
patogénesis (proteínas PR), las enzimas β-
1,3 glucanasas, quitinasas contribuyen a la
resistencia (Van Loon & Van Strien,
1999), por ello, estos compuestos se
utilizan como marcadores bioquímicos y
moleculares para determinar el inicio e
intensidad de la respuesta de defensa en la
planta (Van Loon & Van Strien 1999,
Durrant & Dong 2004) citados por
Jiménez (2013).
En efecto, el objetivo de la presente
actividad de laboratorio relacionada con la
extracción de proteínas e isoenzimas
provenientes de cepas de Trichoderma sp.,
mediante Electroforesis SDS-PAGE,
según el protocolo modificado por Salazar
et al. (2011), consistió en caracterizar la
presencia de proteínas e isoenzimas en el
hongo, que induzcan sustancias que
favorezcan el proceso de control biológico
de diferentes patógenos del suelo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Biológico
Se usaron las cepas de Tricoderma sp.
LIG064 y LIG006 (10 mg/ml),
provenientes del cepario del Laboratorio
de Investigaciones Genéticas de la
Universidad Nacional Experimental del
Táchira; además, de muestras de Lisozima
(10 mg/ml), Albumina de Suero Bovino
BSA (8,3 mg/ml), BSA (10 mg/ml) y
Ovoalbúmina (10 mg/ml) como marker.
Extracción de Proteínas e Isoenzimas
El material para la extracción de proteínas
e isoenzimas se realizó siguiendo el
protocolo modificado descrito por Bonde
et al. (1991), Marlatt et al. (1996) y
Sanabria (1998), citados por Salazar
(2011).
Se seleccionaron cepas de cada uno de los
aislados provenientes del cepario del

3. Laboratorio de Investigaciones Genéticas
UNET que fueron cultivadas en un medio
papa-dextrosa-agar (PDA) por 7 días. De
cada muestra se trasladaron secciones del
micelio con el uso de una micropipeta a un
frasco con 50 ml de papa-dextrosa (PD)
liquido, y se colocaron en agitación
continua por 4 días. Se filtró al vacío, se
lavó con ADE y se congelo a -20 ºC.
Posteriormente el micelio congelado fue
macerado en mortero sobre cama de hielo,
usando como tampón de extracción Tris-
Glicina pH 8,3 en proporción 3:1 (g
micelio/ml de buffer). El extracto fue
centrifugado a 1.000 rpm por 20 min. Se
colecto el sobrenadante y se mantuvo en
congelación (-20 ºC), hasta el momento de
realizar la corrida de electroforesis.
Preparación del Gel
Los geles discontinuos de poliacrilamida
se elaboraron de acuerdo a una
modificación de los métodos descritos por
(Marlatt et al., 1996) citado por (Salazar et
al. 2011). El uso de geles de poliacrilamida
constituye un excelente medio de soporte
para separaciones electroforéticas, dado
que reúnen una serie de propiedades
idóneas: transparencia, elasticidad,
porosidad controlable y compatibilidad
con una gran variedad de compuestos
químicos. El sistema discontinuo, está
formado por dos geles de distinta
porosidad y pH, el primero compacta las
muestras (en el gel superior compactador)
y luego las separan (en el gel inferior o
separador) (Lomonte, 2001). Para el
ensayo se mezclaron las soluciones para
obtener las concentraciones de 10% SDS y
4% SDS, de 0,75 mm de espesor cada uno.
Para 10% SDS del gel separador: 5,625 ml
solución monomérica, 3,125 ml buffer tris
HCl 1,5 M pH 6,8, 0,750 glicerol 8,5%, 3,0
ml agua destilada desionizada, 120 µl SDS
10%, 10 µl temed puro y 25 µl persulfato
de amonio 10%. Para 4% del gel
concentrador: SDS 0,67 ml solución
monomérica, 2,2 ml buffer tris HCl 0,5 M
pH 8,8, 2,2 ml agua destilada desionizada,
50 µl SDS 10%, 10 µl temed puro y 25 µl
persulfato de amonio 10%. (Fuente:
Bridget Moreno). Montados los geles se
coloca el peine y se esperó su
polimerización. (Fig. Nº 1)
Fig. Nº 1. Montaje de los gel separador y
concentrador de poliacrilamida.

4. Una vez polimerizados los geles, se
procedió a cargar las muestras (40 µl) en
el gel, adicionando 26 µl de cada una de
las muestras, 1,5 µl Glicerol 85% y 12,5 µl
de azul de bromofenol. Se colocaron las
láminas de gel en la cubeta de la cámara
electroforética y se le adicionó el buffer
Tris– Glicina, a pH 8,3 como buffer de
corrida añadiendo por carril 40 μl de cada
una de las muestras. El orden de carga
corresponde a (1) LIG064, (2) LIG064, (3)
LIG006, (4) Lisozima 10 mg/ml, (5) BSA
8,3 mg/ml, (6) BSA 10 mg/ml, (7)
Ovoalbúmina 10 mg/ml.
En el caso de la electroforesis para detectar
la presencia de isoenzimas (peroxidasa), se
emplea un proceso denominado
electroforesis nativa, donde se someten las
proteínas a migración sin
desnaturalización (sin la adición del SDS
10%). En esta situación las proteínas
migran en función de su carga, de su
tamaño y de su forma. Además, se
mantienen en ciertos casos las
interacciones entre subunidades y entre
proteínas, separándose los complejos. Los
sistemas tampón (buffer) empleados en
estos casos son: tris-glicina (rango de pH
8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a
8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).
(Galussi, 1996).
Electroforesis y visualización
Según Salazar et al. (2011), la separación
electroforética se debe realizar a un voltaje
constante de 100 V y 80 mA de corriente a
4 °C durante 3 h. Una vez visualizadas las
bandas se procede a sumergir los geles en
una solución de tinción específica para
cada sistema de proteínas o de isoenzimas.
La tinción se realiza en oscuridad (azul de
coomassie 5%) por 12 horas, se lava con
ADE, se sumerge en una solución
decolorante compuesta por etanol puro
(300 ml), acido acerico glacial (50 ml) y
agua destilada (650 ml), finalmente se
realiza la interpretación de los
zigmogramas. Sin embargo, al momento
de la práctica, problemas relacionados con
energía eléctrica impidieron concluir el
proceso de electroforesis. Los resultados y
discusión se formalizaron evaluando una
muestra electroforética preparada
previamente por personal del laboratorio
de Investigaciones Genéticas UNET.
Interpretación de las Bandas
Los registros de las bandas constituyen
información de naturaleza cualitativa, que
según Salazar et al. (2001) se registra en
un código binario, para cada una de los
sistemas aislados. A partir de dicha
información se genera una matriz binaria
que permite establecer patrones
electroforéticos para cada aislamiento. El
análisis estadístico por agrupamiento
(cluster) se emplea como distancia métrica
para la similaridad de Jaccar, analizando
los datos por medio del programa Past ®.

5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Extracción de Proteínas
La electroforesis es una técnica muy
sensible, que puede ser afectada por
diversos errores experimentales como la
temperatura durante la polimerización y la
corrida del gel, la velocidad de la
polimerización y los niveles del
catalizador, la pureza de los reactivos, el
tiempo de la corrida, y la preparación de la
muestra (García, 2000); y problemas
externos, como fallas eléctricas que
ocasionan la pérdida del ensayo en
prácticas pedagógicas de laboratorio.
El empleo de la técnica de electroforesis
SDS-PAGE usando geles de
poliacrilamida en presencia de SDS como
agente de acción desnaturalizante, permite
tomar como referencia la relación de 1,4 gr
de SDS por gr de proteína, uniéndose
aproximadamente una molécula de SDS
por cada dos aminoácidos de la cadena. La
unión de moléculas de SDS bloquea la
carga propia de la molécula de proteína y
le confiere al complejo una carga neta
negativa proporcional a su masa, haciendo
que todas las proteínas acomplejadas con
SDS viajen hacia el ánodo. La separación
de los complejos SDS-proteína es
proporcional sólo a la masa de la proteína
pues todas tienen la misma carga por
unidad de masa. Se puede entonces
determinar el peso molecular aparente de
cualquier proteína por comparación con un
patrón de proteínas de pesos moleculares
conocidos (Galussi et al., 1999).
En la Fig. Nº 2, se observa la banda
electroforética con orden de carga (1)
LIG064, (2) LIG064, (3) LIG006, (4)
Lisozima 10 mg/ml, (5) BSA 8,3 mg/ml,
(6) BSA10 mg/ml, (7) Ovoalbúmina 10
mg/ml.
Fig. Nº 2. Banda de electroforesis de extracción
de proteínas de Trichoderma sp.
Estudio realizado por Martin et al. (2013)
acerca de la capacidad de cepas de
Trichoderma sp. para la disolución de
fosfatos orgánicos, permitieron determinar
que las cepas LIG064 y LIG006
demuestran potencial de disolución. Así
mismo, la cepa LIG006 evidencia
diferencias significativas en relación a
procesos de germinación y crecimiento
radicular. Esto evidencia, que la cepa
LIG064 está orientada a inducir agentes de
biocontrol, y LIG006 influye en el proceso
de desarrollo y crecimiento de las plantas.
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6. La determinación del peso molecular (PM)
de proteínas mediante SDS-PAGE es
válida cuando se analizan cadenas
proteicas individuales, en donde se han
reducido todos los enlaces disulfuro y, por
ende, se ha distendido toda la cadena
proteica para su interacción con el SDS
(Lomonte, 2001). El uso de marcadores
especiales que contienen una mezcla de
moléculas de tamaño conocido, como la
lisozima (14,3 KDa), BSA (66 KDa) y
ovoalbúmina (45 KDa), son usados como
referencia para determinar el peso
molecular de las proteínas analizadas.
La visualización e interpretación de los
pesos moleculares expresados en la banda
electroforética para el análisis de proteína
en cepas de Trichoderma sp., resulto ser de
muy baja calidad, debido a diversas
causas, entre otras, a fallas eléctricas,
preparación y calidad de las soluciones, y
tiempo didáctico de la actividad de
laboratorio.
Extracción de Enzimas
Diversos hongos del suelo, como el
Trichoderma sp., interactúan con las
plantas provocando cambios citológicos y
metabólicos en las células hospederas,
estando asociadas algunas de las
modificaciones bioquímicas con
alteraciones en los niveles de ciertos
compuestos secundarios y enzimas
involucradas en la defensa, sin embargo, a
pesar de que la respuesta es de menor
magnitud en comparación con la
patogenicidad, puede llegar a ser
trascendente. Entre estas enzimas destacan
las peroxidasas, polifenoloxidasas,
quitinasas (Salzer & Boller, 2000).
En el perfil electroforético realizados en
gel de poliacrilamida de cepas de
Trichoderma sp., para determinar la
presencia de isoenzimas (Fig. Nº 3), son
evidentes manchas similares a los
marcadores de peso molecular conocido,
sin embargo, la calidad de la banda no
permite puntualizar diferencias
significativas. Así mismo, se observa que
la migración de las muestras a través de las
bandas del gel no se ha completado en su
totalidad, estas alteraciones en la banda
pueden generar modificaciones en el
tamaño de la isoenzima reportando pesos
moleculares aparentes al momento del
análisis. Se requieren ensayos y
evaluaciones posteriores que confirmen la
caracterización enzimática de las cepas de
Trichoderma sp. evaluadas.
Fig. Nº 3. Banda de electroforesis de extracción
de isoenzimas de Trichoderma sp.
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7. CONCLUSIONES
La técnica de electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS es un método
eficaz, reproducible y confiable, utilizado
para cuantificar, comparar y caracterizar
proteínas, que requiere el cumplimiento
del protocolo establecido para generar
datos precisos.
Los perfiles observados en las bandas
obtenidas en el proceso de electroforesis
fueron de baja calidad para un análisis
descriptivo, motivo por el cual se
requieren análisis posteriores que permitan
identificar eficientemente la presencia de
proteínas e isoenzimas que induzcan el
proceso de control biológico de diferentes
patógenos del suelo.
La evidencia científica en que se sustenta
la presenta actividad de laboratorio pone
de manifiesto la importancia de diferentes
cepas de Trichoderma sp., como la
LIG064, como agentes inductores de
procesos bioquímicos en el medio
rizosférico para generar resistencia a
diferentes patógenos del suelo.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Agrios, N. G. (2007). Fitopatología. Editorial
Limusa. Segunda Edición. México. 838
pp.
Cupull S., R., Andréu R., C. M., Pérez N. C.,
Delgado P. Y. y Cupull S., M. del C. 2003.
Efecto de Trichoderma viride como
estimulante de la germinación, en el
desarrollo de posturas de cafetos y el
control de Rhizoctonia solani Kuhn.
Centro Agrícola 30 (1).
Durrant W, Dong X. Systemic acquired resistance.
Annual Review of Phytopathology 2004;
42:185-209.
Galussi, A. A., Reinoso, D. P., Montesino, R., &
Cevedo, A. M. L. (1996). Electroforesis
de proteínas en gel de poliacrilamida.
Manual de caracterización de cultivares de
trigo y arroz: Análisis de semillas y
plántulas.
García P., H. M. (2000). Electroforesis en geles de
poliacrilamida: fundamentos, actualidad e
importancia. Universo Diagnóstico, 1(2),
31-4.
González S., J. C., Maruri G., J. M. y González A.
A. 2005. Evaluación de diferentes
concentraciones de Trichoderma contra
Fusarium oxysporum agente causal de la
pudrición de plántulas de papaya (Carica
papaya L.) en Tuxpan, Veracruz, México.
Revista UDO Agrícola 5 (1): 45-47.
Harman, G. E. 2006. Overview of mechanisms and
uses of Trichoderma spp. Phytopathology
96: 190-194.
Howell, C., Stipanovic, R. and Lumsden, R. 1993.
Antibiotic production by strains of
Gliocladium virens and its relation to
biocontrol of cotton seedling diseases.
Biocontrol Sci. Technol. 3: 435-441.
Jiménez, M. A., Arcia, A., Ulacio, D., Hernandéz,
A., & Méndez, N. (2013). Evaluación de
Trichoderma spp. y Acibenzolar-S-Metil
(Bion®) como inductores de resistencia a
la pudrición blanca Sclerotium cepivorum
Berk. En Ajo (Allium sativum L.) Bajo
condiciones controladas. Journal of the
Selva Andina Biosphere, 1(1), 2-15.

8. Lomonte, B. (2001). Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida. Inmunología General.
Manual de Laboratorio. Universidad
Politécnica de Cataluña, España, 92-96.
Monte, E. 2001. Understanding Trichoderma:
Between biotechnology and microbial
ecology. Int. Microbiol 4: 1-4.
Resende M, Nojosa G, Aguilar M, Silva L, Niella
G, Carvalho G, et al. Perspectivas da
indução de resistência em cacaueiro
contra Crinipellis perniciosa através do
Benzotiadiazole (BTH). Fitopatol Bras.
2000; 25:149-156.
Rey, M., Delgado, J. J., Rincón, A. M., Limón, M.
C. y Benítez, T. 2000. Mejora de cepas de
Trichoderma para su empleo como
biofungicidas. Rev. Iberoam Micol 17:
S31-S36.
Salazar, L. A., Aponte, G. Y., Sanabria, N. H.,
Yamarte, E. G. S., & Castro, L. (2011).
Caracterización isoenzimática de aislados
de Trichoderma spp. Agronomía Tropical,
61(3), 189-198.
Van Loon L, Van Strien E. The families of
pathogenesis-related proteins, their
activities, and comparative analysis of
PR-1 type proteins. Physiological and
Molecular Plant Pathology. 1999; 55:85-
97
Vinale, F., Sivasithamparamb, K., Ghisalbertic, M.
L., Marra, R., Woo, S. L., Lorito, M. 2008.
Trichoderma-plant-pathogen
interactions. Soil Biology & Biochemistry
40: 1-10.