1. GUIA PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y
BIOQUÍMICA
GUIA DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Autor: Lic Q.F. Sháneri Marcilla Truyenque
Magister en Microbiología Clínica
AREQUIPA – PERÚ
2010

2. NORMAS DEL LABORATORIO.
El laboratorio de biología es un lugar convenientemente habilitado donde con las
debidas precauciones se pueden manejar y examinar organismos. Cuando
manejamos cualquier tipo de muestra debemos tener en cuenta la posibilidad de
riesgos, estos pueden ser biológicos, del ambiente del Laboratorio o riesgos asociados
como el manejo substancias químicas, eléctricos, fugas de gas.
Todos los organismos que se manipulen deben ser manejados con precaución por su
potencial patogenicidad.
Etiquetas para materiales o químicos, identificación de tuberías, políticas de calidad,
misiones, anuncios de oficina o procesos, planes de contingencia, layouts,
señalamiento para emergencias, ecología, ahorro de energéticos, etc.

3. PELIGRO
Indica situación de peligro con alta probabilidad de
muerte o lesión seria. No debe considerarse para daños
a la propiedad salvo que exista riesgo de lesiones
personales.
ADVERTENCIA
Indica situación de peligro con alguna probabilidad de
muerte o lesión seria. No debe considerarse para daños
a la propiedad salvo que exista riesgo de lesiones
personales.
CUIDADO
Indica situación de peligro con probabilidad de lesiones
menores o moderadas. No debe usarse cuando exista
probabilidad de muerte o lesion seria.
AVISO
Indica una política de la compañía relacionada directa o
indirectamente con la seguridad del personal o
protección de la propiedad. No debe usarse en vez de
PELIGRO, ADVERTENCIA, CUIDADO.
SEGURIDAD
Indica instrucciones generales para prácticas,
recordatorios de procedimientos y ubicación de equipo
relativo a seguridad en el trabajo.

4. NO PODRÁ USARSE EN ÁREAS DE LA FACULTAD
1. En caso que el profesor lo indique se deberá usar guantes y/o mascarilla, o
propipetas.
2. Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante lavara sus manos escrupulosamente
con agua y jabón.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al finalizar
cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo con alcohol de
70, solución de fenol o benzol.
4. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el Laboratorio. Los
microorganismos deben manejarse cerca de la flama del mechero.
5. Esta prohibido comer, beber, fumar y maquillarse. Cuando se manipulen
microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la nariz, boca,
ojos etc.
6. Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos biológico
infecciosos que se generen en la realización de la práctica. No tirar nada en los
lavabos. El material de desecho no contaminado como papeles de envoltura
depositarlos en los recipientes de basura común.
7. Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la exposición a esta
radiación es peligrosa.
8. En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el Laboratorio notificar
inmediatamente al instructor o al personal técnico para tomar las medidas
higiénicas y de seguridad apropiadas, así como su registro.
9. Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario este será
desechado.
10. No almacenar material en el refrigerador. Esta estrictamente prohibido retirar del
Laboratorio cultivos o cepas a menos que así lo indique el profesor. Al finalizar la
práctica entregar el material empleado debidamente separado .

5. PRÁCTICA N°1
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
I. OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el estudiante será capaz de:
Aplicar las reglas básicas de higiene y seguridad para los laboratorios.
Analizar la importancia que tiene cada una de estas reglas, tanto en las actividades
académicas de aprendizaje, como en el ejercicio profesional.
II. FUNDAMENTOS
Bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas destinadas a mantener el
control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o
químicos, logrando la prevención de impactos nocivos,asegurando que el desarrollo o
producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de
trabajadores de la salud, pacientes,visitantes y el medio ambiente.
Se podría clasificar a estos riesgos en Riesgos Biológicos (virus, bacterias,
clamidias, rickettsias, parásitos u hongos) y en No Biológicos. Estos últimos incluyen
los riesgos químicos (p.e. uso de lavandina y solventes inflamables o cáusticos),
físicos (p.e. cortaduras), eléctricos (p.e. descargas eléctricas por enchufes o cables en
mal estado) y el fuego (p.e. quemaduras), que son comunes a otros laboratorios.
El riesgo biológico es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infección, alergia, o
toxicidad por una exposición no controlada a agentes biológicos.
Un agente Biológico se entiende por agente biológico cualquier microorganismo -
incluyendo de los genéticamente modificados- cultivo celular, animal o planta o
producto de estos, capaz de producir cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad en
humanos, animales u otros seres vivos.
1. SEGURIDAD BIOLÓGICA
Las Normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo
relacionado con la manipulación de material peligroso, y su rigurosidad varía con la
peligrosidad de los agentes.
La seguridad biológica se fundamenta entonces en tres elementos:
Técnicas de Laboratorio. Se refieren a todas aquellas prácticas y técnicas que se
realizan dentro y fuera del laboratorio para contener los riesgos biológicos, siendo
necesario la adopción por parte de cada laboratorio de un Manual de Seguridad
Biológica en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que
especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos, como así
también las responsabilidades.
Equipo de seguridad (Barreras Primarias): Se incluyen en este apartado tanto
dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad (por ejemplo, las cabinas de
seguridad biológica), como las prendas de protección personal (guantes,
mascarillas, batas, calzado, etc.).
Diseño y Construcción de la Instalación (Barreras Secundarias): La magnitud
de las barreras secundarias dependerá del tipo de agente infeccioso que se
manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separación de las zonas
donde tiene acceso el público, la disponibilidad de sistemas de descontaminación
(autoclaves), filtrado del aire de salida al exterior, flujo de aire direccional, etc.
2. NIVELES DE BIOSEGURIDAD
• Grupo de microorganismos infectantes
• Técnicas y prácticas de laboratorio

6. • Equipo de seguridad
• Tipo de laboratorio
3. CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Para la clasificación se pueden considerar los siguientes factores, capacidad
patógena, modos de transmisión y gama de huéspedes, disponibilidad de medidas de
prevención eficaces y disponibilidad de tratamiento eficaz
GRUPOS DE RIESGO DE MICROORGANISMOS INFECTANTES
Grupo 1 Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes bien Bacillus subtillis
identificados que se sabe que no producen enfermedad en humanos
sanos y existe un potencial mínimo de peligro para el personal del
laboratorio y el ambiente.
Es poco probable que el microorganismo produzca enfermedad en
humanos o animales.
Grupo 2 Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes Leptospira, tbc,
asociados con enfermedades en humanos, especialmente por ingestión salmonela,
o exposición percutánea o mucosa. histoplasma,
Patógenos que pueden producir enfermedad en humanos o animales toxoplasma,
pero es poco probable que sea un problema serio para los trabajadores hepatitis, HIV.
del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposición
en el laboratorio puede producir una enfermedad seria pero existe
tratamiento efectivo y las medidas preventivas están disponibles y el
riesgo de dispersión de la enfermedad es limitado.
Grupo 3 Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con animales Brucella, aftosa
infectados con agentes exóticos que tienen riesgo de transmisión por
aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o potencialmente letal.
Patógenos que usualmente causan serias enfermedades en animales y
humanos pero que comúnmente no se propagan de un individuo
infectado a otro. Las medidas preventivas y de tratamiento efectivo están
disponibles.
Grupo 4 Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes peligrosos que Ebola, Marburg,
tienen alto riesgo de amenazar la vida, transmitirse por vía aérea o Machupo
que se desconoce su riesgo de transmisión.
Patógenos que usualmente causas serian enfermedades en los animales
o los humanos y que pueden transmitirse de un individuo de forma
directa o indirecta. Usualmente no están disponibles ni medidas
preventivas ni tratamiento efectivo.
4. CLASIFICACIÓN DE LOS LABORATORIOS
Esta clasificación es considerando: El Tipo de microorganismo, lugar de las
instalaciones, características de las instalaciones y el acceso al laboratorio.
Nivel 1. Microorganismos no patógenos para el hombre.
Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del
grupo I, es decir, los que no producen enfermedad en el ser
humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los
antimicrobianos. Es el habitualmente utilizado en los laboratorios
de prácticas de universidades o centros docentes donde se
emplean cepas no patógenas. Se debe trabajar en condiciones
mínimas de asepsia y esterilidad. Ejemplos típicos son Escherichia
coli, como así también todos aquellos microorganismos que se
utilizan en la industria alimenticia, para la elaboración de quesos,
cerveza, embutidos, etc.

7. Nivel 2. Microorganismos y procedimientos de riesgo moderado.
En él se trabaja con agentes del grupo II, como así también con
algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre,
son capaces de originar patología infecciosa humana de gravedad
moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal
especializado y son los que con más frecuencia se estudian en
laboratorio de microbiología clínica: Salmonella typhi,
Mycobacterium tuberculosis, Virus de la Hepatitis B, etc.
Otros aspectos que se deben considerar en este nivel son:
- El área de riesgo debe restringirse al personal, no permitiéndose
el acceso a personas que tengan aumentado, por alguna causa, el
riesgo de infección (Ej: inmunosuprimidos).
- En el acceso al laboratorio figurarán señales de riesgo biológico,
condiciones de ingreso y responsables del mismo (nombre,
teléfono y domicilio).
- El personal debe estar vacunado (si correspondiera) y entrenado
para prevenir accidentes y actuar correctamente en caso de que
ocurriere.
- Control permanente de roedores e insectos.
- Uso de guardapolvo en el área de trabajo exclusivamente
(considerar que el guardapolvo es potencialmente un elemento
contaminante).
- Evitar el uso de jeringas o cualquier otra práctica que genere
aerosoles.
“Las muestras deben tratarse siempre como potencialmente
infectadas y tenerse en cuenta las precauciones citadas.”
Nivel 3: Microorganismos que pueden causar la muerte o aquellos
de riesgo moderado
En este nivel se trabaja con agentes biológicos del grupo III,
microorganismos que causan patología grave, de difícil y largo
tratamiento, que pueden dejar secuelas y ocasionalmente producir
la muerte, en cuya manipulación se aplican procedimientos de
trabajo, que implican alto riesgo de infección. El mayor y más
frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a
través de aerosoles y por fluidos biológicos. Por ello las principales
medidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y la
utilización de cabinas de seguridad (incluidas las medidas de los
niveles anteriores como las condiciones mínimas de asepsia y
esterilidad, además del uso de batas, máscaras, respiradores,
guantes, etc.). En los laboratorios de microbiología clínica los
ejemplos más típicos de este tipo de microorganismos son el Virus
de la fiebre de Lassa, Brucella spp, Histoplasma capsulatum, etc.
Solo pueden ser procesados por personal calificado, por ello se
debe restringir el acceso al personal del laboratorio y llevar un
registro de las visitas, del personal de servicio y de accidentes. La
infraestructura apropiada para el nivel de contención 3, incluye,
además, aire acondicionado independiente, sin recirculación, con
gradiente de presión, entre otras. Periódicamente se tomarán
muestras de sangre a todo el personal.

8. Nivel 4: Microorganismos exóticos y/o altamente peligrosos y
procedimientos de alto riesgo.
Este nivel se requiere cuando se procesa con certeza y se
sospecha un agente especialmente patógeno e infectocontagioso,
exótico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe
tratamiento o es poco fiable. Normalmente son microorganismos
de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Este nivel también
puede utilizarse para trabajar con animales de experimentación
infectados con microorganismos del grupo IV.
Debe trabajarse en laboratorios especiales de máxima seguridad
(contención máxima), en los que es necesario ducharse y
cambiarse de ropa tanto a la entrada como a la salida del mismo y
en donde existen barreras de aire con el exterior. El manejo del
material limpio y contaminado se realiza por canales altamente
controlados.
Ejemplos de este nivel son el virus Junín, virus Ébola, el virus de la
fiebre aftosa, el virus del HIV, el Machupo y el Marburg. Además,
deben incluirse en este nivel de contención los microorganismos
propios del grupo 3 que adquieren propiedades patógenas que los
elevan al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium bovis
multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso
terapéutico.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
Jabón
Guantes
Toalla desechable
Gorros
Mandil
IV. PROCEDIMIENTOS
Uno de los elementos de riesgo por factores humanos son los malos hábitos de
higiene, considerando:
1. Manos: Lavado y uso de guantes

9. Uso de guantes:
2. Cabello: Uso de Gorro.
3. Uso de ropa protectora
4. Protección de ojos.
V. TRABAJO
1. ¿Qué entiendes por bioseguridad?
2. Dibuje las diferentes cabina de bioseguridad según los niveles
3.

10. PRACTICA N°2
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA
I. OBJETIVOS
Que el alumno conózcalas técnicas de estudio celular
Practicar y dominar las técnicas de estudio celular
II. FUNDAMENTO
Clasificaremos los métodos que se utilizan para el estudio de la célula en dos grandes
grupos:
1) Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionar
esta composición con las estructuras celulares. Estos métodos son:
a) Centrifugación
b) Cromatografía
c) Electroforesis
d) Cultivos "in vitro"
2) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos permiten conocer como es su
forma, su tamaño y su estructura. Son, fundamentalmente:
a) Microscopia óptica
b) Microscopia electrónica
Microscopio electrónico de Trasmisión (MET)
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
1) TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE LA CÉLULA
Se utilizan para el aislamiento, localización e identificación de las sustancias que
constituyen la materia viva.
Presentan dos problemas principalmente:
a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.
b) La mayoría de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de una
gran complejidad.
A) CENTRIFUGACIÓN
Consiste en la separación de los componentes de una
mezcla en función de las diferencias entre las
velocidades que presentan al someterlos a elevadas
aceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar la
mezcla en un rotor a un gran número de vueltas por
minuto. Los aparatos empleados con este fin se
denominan ultracentrifugas.
Esta técnica requiere los siguientes pasos:
1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACION: El
material biológico, por ejemplo: un fragmento de tejido
del hígado, es triturado para disgregarlo y romper las
membranas celulares.
La rotura de las membranas deja en libertad los
orgánulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si la
homogeneización se realiza suavemente, los orgánulos
permanecerán intactos. Obtendremos así una "papilla"
que estará compuesta de restos de membranas,
orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua.
2) CENTRIFUGACION: Las ultracentrífugas son
maquinas que consiguen velocidades de rotación muy
elevadas, hasta 500.000 v/mn. Los materiales biológicos
sometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia el
fondo de los recipientes que los contienen con
velocidades que dependen de su masa, de su forma y
volumen, y de la naturaleza del medio en el que se
realice la centrifugación.
B) CROMATOGRAFÍA
Se fundamenta en la separación de los componentes de
una mezcla por sus diferencias de absorción. Estas
diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der
Wals que se establecen entre los componentes de la

11. mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria. Según la naturaleza de la fase
estacionaria, tendremos
los siguientes tipos de cromatografía:
1) CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL: Se emplea para la
separación de sustancias químicas que presenten
propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente
manera. Una pequeña cantidad de la mezcla a separar se
deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que
quedara embebida. A continuación se introduce el borde
del papel en una sustancia en la que sean solubles los
componentes de la mezcla que queremos separar. El
disolvente se desplazara por capilaridad y los ira
arrastrando. Los componentes de la mezcla viajaran más
o menos rápido según establezcan fuerzas más o menos
grandes con las moléculas del papel. Para observar los
componentes ya separados se emplean reacciones
coloreadas específicas.
2) CROMATOGRAFIA DE GASES: Consiste en un
serpentín largo y delgado cuyas paredes están
impregnadas de un liquido (fase estacionaria). La mezcla
a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada
por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los
diferentes componentes de la mezcla. Estos se detectan
cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo
que aumenta la conductividad eléctrica del detector. Este
método tiene la ventaja de necesitar pequeñísimas
cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias
muy parecidas químicamente; por ejemplo: ácidos grasos,
azucares u hormonas.
C) ELECTROFORESIS
En este método, la mezcla a separar se deposita en una
cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de
celulosa o también gel de almidón). A continuación se
establece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias que
componen la mezcla se desplazaran en función de su carga eléctrica.
Naturalmente este método se empleara con sustancias que presenten cargas eléctricas
(proteínas y ácidos nucleicos)
D) CULTIVOS IN VITRO
Estos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismo
en condiciones favorables a su multiplicación.
La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y su
estandarización.
Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones
físicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son
capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada
tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos periodos de tiempo.
2) MÉTODOS MORFOLÓGICOS
El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre si 0,2 mm. Este es el
poder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos
0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas
detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder de
resolución del ojo.
CLASES DE MICROSCOPIOS
A) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
A1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
El microscopio electrónico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos teóricos de
De Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partículas. Como
ondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser
partículas negativas pueden ser desviadas por campos eléctricos que actúan como lentes.

12. En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio óptico. Un cátodo emite un haz
de electrones que son acelerados por la aplicación de una diferencia de potencial entre el
cátodo y el ánodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primera
lente magnética que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra.
Una segunda lente magnética, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Una
tercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen final
es proyectada sobre una pantalla o fotografiada.
Los microscopios electrónicos permiten aumentos útiles que van de 2000 a 100.000
pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrónicos son aparatos de hasta 2 m
de alto y llegan a pesar 500 kg.
FIJACION. Las células son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los mas
corrientes son el tetroxido de osmio (OsO4), el formaldehido (HCHO) y el permanganato
potásico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a
las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan mas los metales aparecerán
mas oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado.
DESHIDRATACION e INCLUSION. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una
resina o plástico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte.
CORTE. Los cortes se realizan mediante ultra micrótomos de cuchilla de vidrio o de
diamante. Los cortes más finos (0,03μ) son depositados sobre un tamiz y dispuestos
para su observación al microscopio.
A2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)
Este tipo de microscopio permite obtener imágenes tridimensionales del objeto a estudiar.
Primero se efectúa un sombreado metálico de la superficie de la muestra, y la réplica
obtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman
son captados y convertidos en imágenes sobre una pantalla de televisión. Estos
microscopio son muy útiles para revelar estructuras anatómicas submicroscopicas, sin
embargo su aumento no suele pasar de 20.000.
B) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICO
Funciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa envía rayos de luz a una primera
lente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar.
Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagen
aumentada de este. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el
objetivo. Esta última imagen es la que será recibida por el observador.
PREPARACION DEL MATERIAL:
CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados
microtomos. Estos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor,
corrientemente entre 3 μ y 20 μ. El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse en
parafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.
FIJACION. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible,
para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo
celular o por la descomposición. Como fijadores se emplean determinadas sustancias
químicas (por ejemplo: formaldehido y tetroxido de osmio).
DESHIDRATACION. La extracción del agua del interior de las células permitirá también
una mejor conservación y la penetración de los colorantes. Para deshidratar el material a
observar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduación que por dilución irán
extrayendo el agua
TINCION. Es la coloración de las células o de partes de estas para que resalten y
posibilitar así su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partes
concretas de la célula.
MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un
porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y
"cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración limitada y solo
sirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se desea una mayor
duración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina.
III. PROCEDIMIENTO

13. ANEXO DE PRÁCTICA: MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
Introducción a técnicas microscópicas de uso común en Biología Celular y a
herramientas básicas para el manejo de microscopios fotónicos.
II. FUNDAMENTO
Una célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro, muy por debajo del tamaño más
pequeño que puede apreciar el ojo humano (100 μm). Para observar estructuras tan pequeñas
y para distinguir detalles dentro de éstas, es necesario el uso de lentes magnificadoras. Una
lente convexa constituye un microscopio simple, pero generalmente no logra aumentos
mayores a 10 veces el tamaño real del objeto. Para obtener magnificaciones mayores se
desarrolló el microscopio compuesto, el cual está constituido por un sistema de lentes que
logran magnificaciones de más de 1000 veces el tamaño del objeto.
En el microscopio compuesto existen básicamente dos sistemas de lentes, uno ocular y otro
objetivo, además de todo el sistema mecánico encargado de darle soporte. Dentro de los
componentes no ópticos del microscopio se encuentran la base o pie y el brazo del
microscopio, los cuales en su conjunto se denominan estativo. En la base del microscopio se
localiza la fuente de luz del mismo, o el espejo responsable de dirigir la luz natural hacia la
muestra. La platina constituye un soporte sobre el cual se coloca el espécimen, y posee un
orificio que permite el pasaje de la luz. Asociados a esta platina existen dos tornillos que
permiten el desplazamiento en el plano xy del espécimen. A ambos lados del estativo se
disponen, generalmente, de forma concéntrica los tornillos de enfoque del microscopio
(macrométrico y micrométrico), encargados de mover hacia arriba y abajo la platina para poner
en foco el espécimen. Por encima de la platina se localiza el revólver portaobjetivo donde se
encuentran las lentes objetivas de distinto aumento. La rotación del revólver coloca a cada una
de las lentes en el eje óptico. Siguiendo el camino del eje óptico se encuentra el tubo donde se
localizan elementos del sistema óptico.
La parte óptica propiamente dicha está constituida por el condensador, la lente objetiva y la
ocular. El condensador es una lente convergente que toma los rayos de luz provenientes de la
fuente y forma un cono de rayos convergentes sobre la muestra. El condensador posee un
tornillo de enfoque que permite su movimiento hacia arriba y abajo para lograr una óptima
iluminación del espécimen. Además posee un diafragma o iris que regula la cantidad de luz que
atraviesa el condensador y llega al espécimen, así como el ángulo del cono de luz. Las lentes
ocular y objetiva son lentes convergentes, que describiremos en detalle más adelante.
Figura 1: Esquema del funcionamiento
de un microscopio compuesto. La luz
proveniente de una fuente pasa a través
de una lente condensadora y luego
atraviesa al espécimen localizado en el
soporte o platina del microscopio. La lente
objetiva forma luego una imagen real (es
decir que puede ser proyectada en una
pantalla) intermedia que se proyecta
justamente en el diafragma fijo de la lente
ocular. Esta imagen es posteriormente
aumentada aún más por la lente ocular
generándose una imagen virtual (no
puede ser proyectada en una pantalla)
invertida del objeto que es percibida por
el ojo como si estuviese a 2.5 cm de
distancia.
Características de las lentes objetivas:

14. La lente objetiva está compuesta por un conjunto de lentes, de las cuales la más frontal
(primera lente que atraviesan los rayos de luz en la lente objetiva) se encarga de generar una
imagen magnificada del objeto. El resto de las lentes se encargan de corregir aberraciones
ópticas. La aberraciones (distorsiones) esféricas o cromáticas son inherentes al diseño de toda
lente. Las aberraciones de tipo esféricas hacen que el campo se vea curvo cuando en realidad
es plano. Las aberraciones cromáticas son producto de los distintos índices de refracción de
las diferentes longitudes de onda que componen la luz blanca, y hacen que los objetos se vean
borrosos. Las lentes objetivas que presentan correcciones para ambos tipo de aberración se
denominan planapocromáticas.
La lente objetiva tiene inscripciones que indican ciertas características, tales como su
magnificación, apertura numérica, correcciones, etc. (figura 2). Las lentes objetivas de un
microscopio, que poseen distinto poder de magnificación, suelen estar diseñadas para
proyectar la imagen intermedia en el mismo punto del tubo, de manera que es necesario hacer
únicamente pequeñas correcciones con los tornillos de enfoque cuando se cambia de lente
durante la observación. Los microscopios que poseen este tipo de lentes se denominan
parafocales. Además, el centro del campo de observación es el mismo en los distintos lentes,
por lo cual se denominan paracentrales.
Iluminación:
Para obtener buenas imágenes es importante el uso de una correcta iluminación, utilizando
tanto fuentes naturales como artificiales de luz. La iluminación debe ser brillante y uniforme en
toda la muestra, lo cual se logra en los microscopios actuales utilizando el sistema de
iluminación Köhler. En este sistema, una lente colectora colocada por delante de la fuente
generadora de luz proyecta una imagen aumentada de la fuente de luz, cuyo foco se localiza
exactamente en el diafragma o iris del condensador. Al atravesar el condensador se genera un
haz de rayos paralelos que iluminan de manera uniforme la muestra. El diafragma del
condensador regula el ángulo del cono de luz que alcanza el espécimen. Modificando la
posición del condensador con el tornillo de ajuste del condensador y variando también la
apertura del diafragma iris del condensador se logra que el filamento de la fuente de luz se
localice en el plano focal de la lente objetiva. Es así que se obtienen condiciones óptimas de
iluminación de la muestra.
La función de un microscopio será entonces generar una imagen magnificada del objeto, esto
es una imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita apreciar los detalles del
mismo, es decir que debe tener resolución. Generalmente a magnificaciones mayores, mayor
será la resolución de la imagen, aunque esto no siempre es cierto. Es importante comprender
entonces las diferencias entre magnificación (tamaño de la imagen) y resolución (detalles en la
imagen). Sin resolución, no importa cuán aumentada esté la imagen del objeto, esta no
aportará información al observador, la magnificación deja de aportar información útil para
transformarse en “magnificación vacía”.
Límite de resolución:

15. El límite de resolución se define como la menor distancia que puede haber entre dos puntos
para ser distinguidos como dos entidades independientes. Para el ojo humano esta distancia es
de 100 μm, es decir que dos puntos que estén separados una distancia menor a 100 μm serán
percibidos por el observador como un único punto.
La capacidad de distinguir (separar) detalles
pequeños será entonces el poder de resolución del
microscopio.
Teniendo en cuenta esta definición, el poder de
resolución de un microscopio aumenta cuando la
mínima distancia entre dos puntos que pueden distinguirse como dos objetos disminuye. El
límite de resolución de una lente puede calcularse
utilizando la ecuación de Abbe:
Donde λ es la longitud de onda de trabajo, y AN es la
apertura numérica, la que se calcula como:
AN = Ƞ. sen θ.
La apertura numérica depende de dos parámetros: el ángulo de incidencia de la luz en el lente
(2θ), y el índice de refracción del medio que separa el objeto de la lente objetiva (Ƞ) (figura 3).
Nótese que al aumentar el ángulo de incidencia de la luz, es decir en aquellos lentes de gran
apertura numérica, disminuye la distancia de trabajo, esto significa que la distancia entre el
espécimen y el extremo inferior de la lente objetiva es muy pequeña (figura 3).
Figura 3: Apertura angular de una lente objetiva.
Considerando las ecuaciones anteriores es evidente
que existen tres maneras de modificar el límite de
resolución de una lente: variando la longitud de onda
de trabajo, variando el índice de refracción, y el
ángulo del cono de luz que incide sobre la muestra.
Trabajando con longitudes de onda cercanas al
violeta (ver apéndice), se logra el mejor poder de
resolución, es decir valores de límite de resolución
pequeños. Por otro lado, para modificar el ángulo del
cono de luz que incide sobre la muestra puede
variarse la distancia del condensador al objeto o el
diseño del condensador. Para variar el índice de
refracción, lo que se hace es modificar el elemento
que está en contacto con el objeto y con la lente
objetiva. El índice de refracción (n) del aire es 1, el
del agua es 1.33 y el del aceite y vidrio es
aproximadamente 1.51 (figura 4). Por tal motivo
utilizando aceite entre el preparado y la lente objetiva,
se logra que los rayos de luz que atraviesan la muestra se desvíen poco y sean captados por la
lente.
Figura 4: Principio de trabajo
de lentes de objetivas de
inmersión en aceite. La
presencia de aceite en el
espacio comprendido entre el
cubreobjetos y la lente objetiva,
incrementa el número de rayos
provenientes del espécimen
que son captados por la lente
objetiva.
En algunas aplicaciones del microscopio no es necesario utilizar lentes objetivas de gran
apertura numérica ya que los detalles de la muestra pueden ser apreciados utilizando lentes
con aperturas numéricas más pequeñas. Esto además es importante ya que el trabajo con
lentes objetivas de gran apertura numérica trae aparejado el inconveniente de la disminución
de la profundidad de campo, la cual puede ser entendida como la distancia hacia arriba y abajo
del plano focal real del espécimen que se encuentra en foco. Otra desventaja es que la
distancia de trabajo (ver figura 3) es forzosamente menor en lentes de mayor apertura
numérica (pues θ es mayor).

16. 2) Microscopía de contraste de fase:
Los especímenes biológicos son generalmente transparentes, es decir que el contraste de la
muestra es tan bajo que, independientemente del aumento o del poder de resolución del
microscopio, el objeto es prácticamente invisible. Entonces, cuando es necesario mantener
inalterada la muestra, sin teñirla, se recurre a técnicas que permiten incrementar el contraste
natural. Este contraste se genera al transformar diferencias en el retardo del pasaje de la luz a
través de la muestra, en diferencias en intensidad de luz que puedan ser captadas por el ojo
humano o la cámara fotográfica. Los especímenes biológicos interaccionan con la luz de una
forma que no es uniforme, ya que retardan el pasaje de la misma de manera variable
dependiendo de la estructura celular que se interponga en su camino. Este retardo dependerá
del índice de refracción o grosor de la estructura celular generándose un retardo que
generalmente es de 1/4 λ.
El microscopio de contraste de fases está diseñado entonces, para generar contraste en los
especímenes biológicos transformando las diferencias de desfasaje de las ondas en diferencias
de amplitud (intensidad) que sean apreciables. El sistema posee un mecanismo constituido por
un disco opaco con un anillo transparente que se inserta en el condensador del microscopio.
Existe un anillo complementario en la lente objetiva, que tiene como función separar los rayos
que atravesaron la muestra, de los que no lo hicieron. Casi toda la luz que atraviesa el anillo
transparente en el condensador, pero no atraviesa la muestra, pasa luego por el anillo del
objetivo. La luz que atraviesa la muestra será retrasada y no atravesará el anillo de la lente
objetiva en ese plano.
El microscopio transforma el desfasaje de 1/4λ en uno de 1/2λ. Al existir dicho desfasaje entre
las ondas que atraviesan la muestra y las que no, éstas pueden interferir con las ondas que no
son retrasadas por la muestra, de manera destructiva (desfasaje de 1/2λ) generando oscuridad,
o constructiva (desfasaje de λ) generando zonas brillantes (Figura 6).
Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el transcurso de ciertos procesos biológicos
ya que permite la observación de células vivas y no es necesario fijar y teñir la muestra para
generar contraste.
3) Microscopía de contraste interferencial de Nomarski (DIC):
El fundamento es similar al de contraste de fase, pero reduce al mínimo los artefactos ópticos
que ésta posee y aumenta la resolución. Separa por completo la luz directa de la difractada
utilizando prismas y transmisión de luz a través de vías complicadas. No se observan halos
brillantes donde hay cambios bruscos del índice de difracción de la luz, pero sí se genera un
falso volumen de la muestras (Figura 5).
III. PROCEDIMIENTO
1. Observación de célula vegetales:
Realizar cortes
Colocar una gota de agua en el portaobjetos y observar
2. Observación de células animales
Colocar una gota de sangre en el portaobjetos realizar un barrido con el cubreobjetos y
observar
3. Observación de hongos

17. Colocar una gota de agua en el portaobjetos, con el asa de siembra esparcir la
muestra, colocar el cubreobjetos y observar
IV. CUESTIONARIO
1. Registre los aumentos (X) y las aperturas numéricas (AN) de las lentes objetivas instaladas
en su microscopio.
Aumento (×) Apertura numérica
(AN)
2. En condiciones de observación con luz verde (λ = 550 nm) y usando la ecuación de
Abbe, indique el mejor límite de resolución (LR) obtenible con su microscopio. Explicite
los cálculos realizados.
3. Escriba los fundamentos de Microscopía de epifluorescencia.
4. Escriba los fundamentos de Microscopía láser confocal
5. Dibuje lo observado indicando el aumento correspondiente:
6. Escriba la ecuación de Abbe y explique brevemente su significado.
7. Explique brevemente el concepto de apertura numérica.
8. Explique la diferencia entre resolución y magnificación.
9. Identifique en el diagrama adjunto:

18. PRACTICA N°3
PERMEABILIDAD CELULAR.
I. OBJETIVOS
Analizar los fenómenos de ósmosis a través de la membrana plasmática de células
animales y vegetales.
Comprender los conceptos de permeabilidad de membrana, osmolaridad e isotonicidad
y su importancia.
II. FUNDAMENTO
Las membranas biológicas comparten una estructura general común. Están constituidas por
una bicapa muy delgada de moléculas lipídicas (fosfolípidos) y proteicas (aproximadamente
5 nm de espesor) que forman estructuras dinámicas y fluidas. En microscopía electrónica de
transmisión las membranas se observan como una estructura trilaminar debido a que la
región ocupada por las cabezas de los fosfolípidos se tiñe con el tetróxido de osmio
quedando electrón densa y la región hidrofóbica electrón lúcida. Una de las principales
funciones que desempeñan las membranas es mantener las diferencias esenciales entre el
medio intracelular y extracelular actuando como barreras selectivamente permeables.
Conceptos básicos:
1) Permeabilidad de membrana:
- membranas permeables: permiten el pasaje de todo tipo de moléculas.
- membranas semipermeables: permiten el pasaje de un sólo tipo de molécula.
- membranas selectivamente permeables: poseen diferentes grados de permeabilidad a
distintas moléculas.
2) Tonicidad de una solución:
- solución hipotónica: menor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra
solución.
- solución isotónica: igual concentración de solutos con respecto al interior celular u otra
solución.
- solución hipertónica: mayor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra
solución.
3) Ósmosis:
Movimiento de agua en respuesta al gradiente de concentración de solutos. La fuerza que
dirige este movimiento se conoce como presión osmótica. No todos los solutos ejercen el
mismo efecto osmótico (concentraciones iguales de sales y moléculas no ionizables no
ejercen la misma presión osmótica).
4) Osmolaridad:
Es una medida de concentración que indica la presión osmótica ejercida por una solución.
Depende del número de partículas disueltas en la solución independientemente de su
naturaleza. La concentración fisiológica del interior celular es 0,3 osmolar. Es de suma
importancia considerar esta condición para la preparación de toda solución que interactúe
con células vivas. 24
2) PRUEBA DE VIBLIDAD CELULAR
Es el conteo de las células vivas
Protocolo de obtención de células para
(sanas) o muertas en una muestra. iniciar un cultivo primario (no será utilizado
Generalmente los métodos de en clase)
determinación de la viabilidad se basan - Cortar los órganos en trozos de menos de 2mm
en el análisis de dos parámetros: con 2 escalpelos en una gota de tampón salino
actividad metabólica de la célula o (PBS, pH 7.2-7.4).
integridad de membrana plasmática. - Agregar 1-1.5ml de solución de tripsina (en
Los métodos más comunes para tampón salino pH 7.2-7.4, con EDTA).
evaluar la integridad de membrana y - Incubar 15min a 37ºC y agregue
así determinar el índice de células aproximadamente 4 ml de medio de cultivo
suplementado con suero.
viables en una suspensión celular son
- Pipetear repetidamente (sin hacer espuma) a
los test de exclusión de colorantes fin de obtener una suspensión celular
vitales (ej.: Azul Tripán). Las células homogénea.
vivas, cuyas membranas celulares - Tomar una muestra de 500μl y agregar 500μl
estén integras, excluyen a estos de solución de Azul Tripán diluida.
- Observar rápidamente al microscopio
montando una gota entre porta y cubreobjeto.
Tampón fosfato salino (PBS) NaCl (8.0g), KCl
(0.2g), Na2HPO4 (2.1g), KH2PO4 (0.2g), H2O
(1litro).
Sol. concentrada de azul tripán: 200mg de
Azul Tripán en 50ml de agua destilada. Diluir 4

19. colorantes en forma activa. El método del Azul Tripán pone en evidencia el funcionamiento
de un mecanismo de transporte activo a través de la membrana plasmática. Por este
procedimiento se visualizan las células mediante un microscopio y se cuentan las células
muertas (azules) en el total de la muestra. Este método es utilizado por ejemplo previo a
iniciar un cultivo, para determinar cuantas células vivas existen, permitiendo optimizar las
condiciones de cultivo. Además puede emplearse para determinar la eficacia de agentes
terapéuticos en la búsqueda de drogas, o en tests toxicológicos.
III. PROCEDIMIENTO
1. Morfología normal de eritrocitos y hoja de Elodea sp.
Corte una hoja de Elodea sp. y monte entre porta y cubreobjetos
Tome una gota de sangre y monte entre porta y cubreobjetos
Observe al microscopio
2. Comportamiento de las células vegetales frente a soluciones con diferente
concentración de solutos
Realice montajes de hojas de Elodea en soluciones de cloruro de sodio en diferentes
concentraciones
Observe al microscopio
Luego de algunos minutos, vuelva a montar y observe al microscopio el Comportamiento
de células animales (eritrocitos) frente a soluciones de diferente concentración.
IV. CUESTIONARIO
1.- Exprese la presión osmótica en términos de la ley de van't Hoff. Justifique brevemente.
2.- ¿Qué es la osmolaridad? ¿Cómo puede determinarse experimentalmente?
3.- Describa de forma breve en qué consiste la regla de Overton
4.- Indique con una flecha hacia dónde se producirá el flujo de agua en los siguientes
ejemplos. Justifique brevemente.
5.- ¿En qué se basa el método de determinación de la viabilidad celular con el colorante
azul Tripán?

20. PRACTICA N°4
PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
I. OBJETIVOS
Obtención de una fracción subcelular enriquecida en cloroplastos.
Identificación de cloroplastos en dicha fracción.
Estudio de la ultraestructura del cloroplasto.
II. FUNDAMENTO
En algas y plantas superiores, la fotosíntesis ocurre en el cloroplasto. Este organelo posee, al
igual que la mitocondria, una envoltura compuesta de dos membranas, una externa y una
interna, pero además posee un tercer sistema de membrana, la membrana tilacoidal. Esta
membrana forma pequeños sacos aplanados, denominados tilacoides, cuyo lumen es el
espacio tilacoidal. Los tilacoides se apilan, formando bloques denominados grana (cada bloque
en singular es un granum). Los grana están interconectados por regiones de la membrana
tilacoidal alargadas, denominadas laminillas del estroma, cuyo lumen es continuo con el
espacio tilacoidal. El estroma es el espacio interno del cloroplasto que queda por fuera de la
membrana tilacoidal (Figura 1).
La fotosíntesis es un complejo proceso en el cual la energía de la luz se usa para generar
energía química en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH, que se usan a su vez
para convertir el CO2 del aire en carbohidratos, liberándose paralelamente O2 a partir de agua
(en plantas, algas y algunas bacterias). La reacción global de la fotosíntesis es:
6 CO2 + 6 H2O → 6 O2 + C6H12O6
Las reacciones de la fotosíntesis pueden agruparse en dos clases, las reacciones fotoquímicas,
que ocurren en la membrana tilacoidal y en las que se generan ATP y NADPH, y las reacciones
bioquímicas, que comienzan en el estroma del cloroplasto y continúan en el citosol, en las que
el CO2 es convertido en carbohidratos.

21. Las reacciones fotoquímicas, mediante las que se obtiene ATP y NADPH, constituyen un
proceso de dos fases, denominado fotofosforilación no cíclica, para distinguirlo de otro proceso,
la fotofosforilación cíclica, en el que solo se genera ATP. En la primera fase de la
fotofosforilación no cíclica, la absorción de luz por el fotosistema II le permite remover
electrones provenientes del agua y transferirlos a una cadena de transporte, hasta llegar al
fotosistema I. Allí, una nueva absorción de luz confiere suficiente energía a los electrones para
poder reducir a su aceptor final, el NADP+, formando NADPH (Figura 2).
Los fotosistemas son complejos formados por varios polipéptidos y distintos tipos de
pigmentos, y en ellos la luz absorbida se utiliza para excitar a un electrón en una molécula de
clorofila particular. En el fotosistema II, este electrón es transferido a la plastoquinona, una
pequeña molécula análoga a la coenzima Q de la fosforilación oxidativa. Cada electrón
transferido por el fotosistema II se repone con uno proveniente del agua, en una compleja
reacción cuyo resultado final es la liberación de O2 a partir de agua. La plastoquinona
transfiere electrones al complejo b6-f, análogo al complejo b-c1 de la mitocondria, el cual
bombea protones dentro del espacio tilacoidal. La plastocianina, una proteína pequeña que
contiene un átomo de cobre que varía de estado de oxidación, transporta electrones desde el
complejo b6-f hasta el fotosistema I. Allí, la absorción de un fotón aumenta la energía de estos
electrones, que pueden reducir a la ferredoxina, una proteína con un grupo prostético que
contiene hierro y azufre. Esta a su vez transfiere los electrones al NADP+, en una reacción
catalizada por la enzima NADP reductasa. Además de generar NADPH, este proceso de
transporte de electrones provoca la acumulación de protones en el espacio tilacoidal, con la
consecuente generación de un gradiente electroquímico a través de la membrana tilacoidal, el
cual es usado para sintetizar ATP.
En 1937, Robert Hill descubrió que cuando cloroplastos aislados son iluminados en ausencia
de CO2, son capaces de reducir un aceptor artificial, liberando O2 paralelamente. Este
resultado fue una de las primeras demostraciones de que el CO2 no participa directamente en
el proceso que produce O2, y puede resumirse en la siguiente reacción química, denominada
reacción de Hill:
luz, cloroplastos
H2O + A AH2 + ½ O2
En el práctico realizaremos un protocolo de separación de pigmentos fotosintéticos mediante
cromatografía. Los pigmentos fotosintéticos son responsables de absorber y atrapar la
energía lumínica en los primeros pasos de la fotosíntesis. Los principales pigmentos son las
clorofilas. En plantas verdes existen las clorofilas a y b. También existen pigmentos accesorios
llamados carotenoides. Dada su estructura molecular, las clorofilas son capaces de absorber
luz en el rojo y el azul del espectro visible y transmiten en el verde. Los carotenoides, por su
parte, absorben en el azul y transmiten en el amarillo-anaranjado. Ya que el espectro de
absorción de los pigmentos accesorios difiere del de las clorofilas, tienen el efecto de ampliar el
rango de longitudes de onda que puedan ser utilizados en la fotosíntesis.
La cromatografía es un procedimiento para separar los componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Existen varios tipos
de cromatografía pero en todos los casos la separación se logra por la distribución de los
componentes en una fase estacionaria (fija) y una fase móvil. En la cromatografía en papel, los
componentes de la mezcla se separan en zonas discretas en una tira de papel de filtro,

22. utilizando en la fase móvil una mezcla de solventes en la cual cada componente de la muestra
a separar se disuelve de manera diferencial. La fase estacionaria está constituida por el papel.
Durante la cromatografía existen dos fuerzas opuestas. La fuerza del solvente en movimiento
que se extiende por capilaridad hacia el otro extremo del papel, que tiende a llevarse cada
componente consigo. También existe una fuerza de resistencia debida a la disolución de cada
componente en la fase estacionaria. De la interacción de estas dos fuerzas en cada
componente de la muestra, es que resulta la separación de cada uno de ellos. El grado de
separación obtenido es una función de la solubilidad relativa de cada componente en la fase
estacionaria y la fase móvil (Figura 3).
III. PROCEDIMIENTO
1. Extracción de clorofila por cromatografía.
a) Método I:
Cortar en trozos una hoja y macerarla en un mortero con 5 mL de acetona.
Tomar la tira de papel de filtro por el borde y marcar una línea con lápiz a
aproximadamente dos cm de uno de los extremos.
A lo largo de la línea marcada, sembrar con un capilar una muestra de la extracción
orgánica y dejar secar. Repetir el procedimiento unas 10 veces para concentrar la
muestra.
Agregar con pipeta el solvente cromatográfico (eter/acetona, 3:1) hasta un nivel
intermedio entre el extremo del papel y la línea de siembra, y colocar la tira de papel de
filtro en la probeta de vidrio. Tapar la probeta para reducir la evaporación de solventes.
Cuando el frente de solvente está a unos 0,5 cm del borde del papel, retirar de la
probeta con pinza, y antes que el solvente se evapore, marcar con lápiz una línea en el
cromatograma que represente el frente de migración.
Mientras el solvente se evapora (2-3 min) debe marcarse el punto de mayor migración
de cada uno de los pigmentos.
Calcular el Rf (Ratio factor) para cada uno de los pigmentos según:
Rf = . distancia migrada por el soluto (pigmento) .
distancia migrada por el solvente
b) Método II:
Cortar en trozos una hoja y macerarla en con 20 mL de alcohol.
Tomar una gasa y filtrar
Tomar la tira de papel de filtro por el borde y colocarla sobre el extracto
aproximadamente dos cm de uno de los extremos.
Cuando el frente de solvente está a unos 0,5 cm del borde del papel, retirar y marcar
con lápiz una línea en el cromatograma que represente el frente de amigración.
Mientras el solvente se evapora (2-3 min) debe marcarse el punto de mayor migración
de cada uno de los pigmentos.

23. Calcular el Rf (Ratio factor) para cada uno de los pigmentos según:
Rf = . distancia migrada por el soluto (pigmento) .
distancia migrada por el solvente
2. Extracción de pigmentos.
Cortar en un mortero trozos de las muestras a evaluar y macerarla en con 20 mL de
alcohol.
Adicionar una cucharadita de carbonato de calcio
Filtrar con ayuda de una gasa
Adicionar 20 ml de gasolina y 10 ml de agua
Llevara a la pera de decantación y obtener las dos fases por separado
IV. CUESTIONARIO
1. ¿En qué compartimientos ocurre la fase fotoquímica (luminosa) y la fase bioquímica
(oscura) de la fotosíntesis? Justifique brevemente su respuesta.
2. Señale cuál(es) de las siguientes afirmaciones acerca del fotosistema II NO es correcta.
Justifique su respuesta.
a) Está ubicado en las membranas tilacoidales.
b) Está involucrado en la oxidación de H2O.
c) Posee una clorofila oxidable: P680.
d) Tiene asociado un complejo de antena para su función de capturar luz.
e) Es necesario para la fotofosforilación cíclica.
3. ¿Cómo se explica el comportamiento de los pigmentos en el cromatograma? Justifique.
4. Además del Rf, ¿qué otra característica podría utilizarse para identificar un pigmento
desconocido?
5. ¿Por qué se utilizan solventes orgánicos en la cromatografía de pigmentos fotosintéticos y
no por ejemplo, agua?

24. PRACTICA N°5
NÚCLEO
I. OBJETIVOS
Identificación de una fracción subcelular enriquecida en núcleos mediante la
reacción de Feulgen y comparación con núcleos en cortes histológicos.
Estudio de la ultraestructura del núcleo.
II. FUNDAMENTO
El núcleo es el organelo celular donde se localiza el ADN. Su forma varía dependiendo del tipo
celular, puede ser esférico, ovoide o multilobulado. Su tamaño oscila entre 3 a 15 μm y su
posición depende del tipo celular. Está delimitado por una envoltura nuclear constituida por
dos membranas celulares (dos bicapas lipídicas) separadas por una cisterna perinuclear. Esta
envoltura se continúa en el citoplasma con el retículo endoplásmico rugoso, y por lo tanto su
cara externa presenta ribosomas asociados.
En la cara interna de la envoltura se localiza una red de filamentos intermedios denominada
lámina nuclear, constituida por las proteínas denominadas laminas. Tanto la lámina nuclear
como la envoltura se ven interrumpidas en regiones denominadas poros nucleares,
destinados al transporte de moléculas desde y hacia el citosol.
En el interior del núcleo el ADN que constituye los cromosomas se empaqueta con
proteínas denominadas histonas. El conjunto del ADN, las histonas, y proteínas
cromosómicas no histonas, se denomina cromatina. La unidad fundamental de
empaquetado recibe el nombre de nucleosoma y está constituido por un octámero de
histonas rodeado por dos vueltas de ADN.
La cromatina posee diversos grados de compactación dentro del núcleo, y pueden existir
variaciones durante el ciclo celular. En su estado más laxo o descondensado la cromatina se
denomina eucromatina y se aprecia en microscopía electrónica de transmisión como
regiones electrón-lúcidas (ver figura). Esta cromatina es transcripcionalmente activa ya que
permite el acceso de factores de transcripción y toda la maquinaria enzimática necesaria
para la transcripción. La cromatina condensada se denomina heterocromatina y se observa
en microscopía electrónica de transmisión como regiones electrón-densas, generalmente
asociadas a la envoltura nuclear. Esta cromatina se asocia con estados transcripcionalmente
inactivos ya que dificulta el acceso de factores de transcripción al ADN. Es importante
recordar que la compactación y descompactación de la cromatina son fenómenos
reversibles. Podemos encontrar diferentes niveles de compactación del ADN que van desde
la fibra de 2 nanómetros (doble hélice de ADN), pasando por la fibra de 11nm que
corresponde al “collar de cuentas” que incluye los nucleosomas (complejo de histonas
rodeadas de dos vueltas del ADN), la fibra de 30nm, la de 300nm, la de 700nm hasta el
cromosoma mitótico.

25. El nucléolo es una región dentro del núcleo, no delimitada por membrana, donde ocurre la
transcripción del ARNr y ensamblado de las subunidades ribosomales por separado. Allí se
localizan loops de ADN de distintos cromosomas, que contienen clusters de genes de ARNr.
Cada uno de estos clusters se denomina Región Organizadora Nucleolar (NOR). En una
micrografía electrónica de transmisión pueden distinguirse tres regiones en el nulceolo: (1)
una región pálida denominada componente fibrilar o centro fibrilar que contiene ADN que
no está siendo transcrito, (2) un componente fibrilar denso que contiene moléculas de
ARNr que están siendo sintetizadas, y (3) componente granular que contiene partículas
precursoras ribosomales en maduración. El tamaño del nucleolo refleja su actividad por lo
que varía en distintos tipos celulares y puede variar también dentro de una misma célula.
III. PROCEDIMIENTO
1. Extracción de ADN.
a) Método I:
Lavar las hojas de espinaca y llenar hasta aproximadamente completar una Beaker
de 100mL. ( mg)
En una licuadora se coloca la espinaca más 200 ml de agua y 20mg de cloruro de
sodio (licuar por 15 segundos)
Filtrar la espinaca, adicionar 1/6 parte de un detergente no antibacteriano (según la
cantidad adquirida). Dejar reposar por 10min
Dividir la muestra en 4 tubos con 40 ml cada tubo,
Tubos 1 y 3 → Enzima
Tubos 2 y 4 → Extracto de piña o papaya (filtrar)
Se agita suavemente para no romper el ADN, luego adicionar: (por la paredes
lentamente.
Tubos 1 y 2→ 40 ml de alcohol isopropilico
Tubos 3 y 4→ 40 ml de alcohol etílico
Extraer con ayuda de la varilla en ADN
b) Método II:
En 100ml de agua adicionar 10g de cloruro de sodio, realizar un enjuague bucal con la
solución anteriormente preparada
Tomar 50 ml de detergente y adicionar 50ml de agua. Mezcal el enjuague bucal y el
detergente. Dejar reposar por 10min
Dividir la muestra en 2 tubos con 40 ml cada tubo,
Tubos 1 y 2 → Enzima
Se agita suavemente para no romper el ADN, luego adicionar: (por la paredes
lentamente).
Tubos 1 → 40 ml de alcohol isopropilico
Tubos 2 → 40 ml de alcohol etílico
Extraer con ayuda de la varilla en ADN
2. Mitosis en cebolla
Llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres
palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días
aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 ó 4 cm. de longitud.
Cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio
de reloj en el que se han vertido 2-3ml de Orceína A.
Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos,
evitando la ebullición,hasta la emisión de vapores
Con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un
portaobjetos, añadir una gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto.5
Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja
enmangada dar unosgolpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede
extendida.

26. Sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar
sobre el papel filtro en lazona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando
que el cubre resbale.
Observar al microscopio
IV. CUESTIONARIO
1.- ¿Qué niveles de compactación de la cromatina conoce? Mencione un caso extremo de
compactación que conozca.
2.- Mencione las principales características de la envoltura nuclear y explique por qué NO es
apropiado denominarla membrana nuclear.
3.- Se sospecha la presencia de una proteína particular en los complejos de poro nuclear.
Describa brevemente una estrategia para verificarlo.
4.- Enumere los principales pasos del fraccionamiento subcelular, y explique brevemente en
qué consisten.

27. PRACTICA N°6
MITOCONDRIA
I. OBJETIVOS
Identificación de una fracción subcelular enriquecida en mitocondrias mediante la
detección de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH).
Estudio de la ultraestructura de la mitocondria.
II. FUNDAMENTO
La mitocondria es el lugar donde ocurre la mayor
parte de las reacciones del metabolismo oxidativo
en las células eucariotas. Esto es, es el sitio en el
cual se realiza la mayor parte de la degradación
oxidativa de compuestos como carbohidratos,
ácidos grasos y aminoácidos, que terminan
dando lugar a la generación de energía en forma
de síntesis de ATP. La mitocondria es un
organelo de morfología y tamaño variables, pero
que típicamente tiene una forma elipsoide, de
aproximadamente 0,5 μm de diámetro y 1 μm de
largo. Las mitocondrias están delimitadas por dos
membranas, una membrana externa lisa y una
membrana interna extensamente invaginada. El
espacio entre ambas membranas se conoce
como espacio intermembrana, y las
invaginaciones de la membrana interna, que
amplían enormemente su área, se denominan
crestas (Figura 1). El compartimento interno de la
mitocondria es la matriz mitocondrial. Mientras
que la membrana externa permite la difusión libre
de moléculas de hasta 10 kDa, la membrana interna sólo deja pasar libremente O2, CO2 y
H2O, y posee varios transportadores que controlan el pasaje de diversos metabolitos.
En la figura anterior se esquematizan dos de los principales procesos metabólicos que ocurren
en la mitocondria, y que nos van a permitir identificarla: el ciclo de Krebs y la cadena
respiratoria.

28. El resultado neto del ciclo de Krebs es la oxidación de un grupo acetilo (CH3−C=O)
perteneciente a la acetil-CoA a dos moléculas de CO2, y en paralelo la reducción de tres NAD+
y un FAD para dar 3 NADH y un FADH2, respectivamente. Todas las enzimas que catalizan las
reacciones del ciclo de Krebs se hallan en la matriz mitocondrial, excepto la succinato
deshidrogenas, que está inserta en la membrana mitocondrial interna.
En la cadena respiratoria, los electrones de alta energía del NADH y el FADH2 pasan por
sucesivos complejos aceptores de potencial redox creciente, con lo que esta energía se va
liberando. En cada complejo se bombean protones hacia el espacio intermembrana, con lo que
se establece una diferencia de concentración de H+ (y de carga) a través de la membrana
mitocondrial interna. La energía liberada por el transporte de electrones queda almacenada en
forma de un gradiente electroquímico.
Los tres complejos, así como los dos transportadores, que constituyen la cadena respiratoria,
están insertos en la membrana mitocondrial interna. Los electrones provenientes del NADH
pasan al complejo NADH deshidrogenasa, y de allí pasan a la coenzima Q, una pequeña
molécula hidrofóbica, que los transporta al complejo citocromo b-c1. Los citocromos son
proteínas que contienen grupos hemo, en los que un átomo de hierro alterna entre los estados
de oxidación Fe (II) y Fe (III). Existen varios tipos de citocromos, que pueden hallarse formando
parte de complejos, o bien aislados, como el citocromo c, que transporta electrones del
complejo citocromo b-c1 al complejo citocromo oxidasa. En este complejo, los electrones llegan
a su aceptor final, el O2, para formar H2O.
La oxidación del FADH2 es menos favorable que la del NADH, y sus electrones entran en la
cadena respiratoria más adelante, siendo cedidos a la coenzima Q. El FADH2 está unido
covalentemente a la succinato deshidrogenasa, que está inserta en la membrana mitocondrial
interna, como mencionamos más atrás.
La succinato deshidrogenasa es una enzima que sólo se encuentra en mitocondrias, y por lo
tanto la medición de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias en
una fracción subcelular. Esto se puede realizar utilizando un aceptor artificial de electrones que
tenga mayor afinidad por los electrones que el FAD, como por ejemplo: 2,6-
diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto cambia el color según su estado de oxidación:
es azul cuando se encuentra en estado oxidado e incoloro cuando está reducido.
III. PROCEDIMIENTO
1. Respiración.
Pesar 20 g de levadura y llevara un matraz de 200 mL
Adicionar agua ( enrazar a 200mL)
Pesar 1g de azúcar y llevar a matraz ( mas una pisca de sal), tapar con el corcho y el
tubo acodado o en forma de U
Paralelamente llenar otro matraz con agua de cal ( 15g de oxido de calcio en 1000ml
de agua destilada hervida)
Unir los dos matraces mediante el tubo acodado o en forma de U.
2. Fermentación
Con la probeta medir 200 ml de leche y llevar a un frasco de vidrio

29. Medir 100 ml de yogurt prebiótico y adicionar a los 200mL leche, tapar y llevar a
incubar por 24 h
Sacar de la incubadora y medir el pH.
Tomar una gota de muestra en el portaobjetos, expandir y realizar tinción de gram.
IV. CUESTIONARIO
1. Compare de forma breve las características de las membranas mitocondriales interna y
externa.
2. De las siguientes afirmaciones, señale la(s) falsa(s), y justifique brevemente su respuesta.
a) Las mitocondrias se encuentran en todas las células eucariotas.
b) A nivel mitocondrial se produce la oxidación de carbohidratos, aminoácidos y ácidos
grasos.
c) En todas las células eucariotas, la mayor parte del ATP celular es de origen
mitocondrial.
d) Las mitocondrias presentan intenso dinamismo y plasticidad.
e) La localización de las mitocondrias en la célula es independiente de la función propia
de cada célula.
3. Explique brevemente qué procesos ocurren en la matriz mitocondrial y qué procesos
ocurren en las membranas.

30. PRACTICA N°7
ANÁLISIS DE PARÁMETROS DEL CICLO CELULAR
I. OBJETIVOS
Reconocimiento al microscopio de luz de células en interfase y en las distintas etapas de la
mitosis. Estimación del índice mitótico de una población celular.
Estimación de la duración de las fases del ciclo celular en base a datos tomados de la
literatura, obtenidos mediante la técnica de autorradiografía.
II. FUNDAMENTO
Parte 1
El ciclo de vida de la célula, visto al
microscopio, se divide en dos grandes
fases, la interfase y la fase M, etapa de
división compuesta por la mitosis (división
nuclear) y la citocinesis (división del
citoplasma). A su vez, la interfase se
subdivide típicamente en las fases G1, S y
G2. La fase S corresponde a la etapa de
duplicación del ADN; la fase G1 es el
intervalo entre la salida de la fase M y la
entrada en fase S; y la fase G2 es el
intervalo entre la fase S y una nueva fase M:
La duración de estas fases es variable y
depende de distintos factores, en particular de la duración de G1.
Al microscopio, las células en interfase se reconocen por la presencia de un núcleo que se tiñe
difusamente, sin que sea posible individualizar cromosomas, aunque sí puede observarse
dentro del núcleo un punto oscuro, el nucléolo.
Por otra parte, la mitosis también se subdivide en etapas, claramente distinguibles al
microscopio:
Profase. La cromatina en el núcleo comienza a condensarse en cromosomas bien definidos,
visibles al microscopio. Cada cromosoma se ha duplicado y consiste en dos cromátidas
hermanas. Cada una de ellas posee una región especializada, el centrómero, y ambos
centrómeros las mantienen apareadas. Hacia el fin de la profase los microtúbulos
citoplasmáticos se desensamblan y reensamblan para formar el huso mitótico.
Prometafase. La prometafase comienza con el desensamblaje de la envoltura nuclear. Los
microtúbulos del huso mitótico pueden entrar ahora a la región nuclear. En los centrómeros,
comienzan a formarse complejos proteicos denominados cinetocoros. A ellos se adhieren parte
de los microtúbulos del huso, y permiten que los cromosomas empiecen a moverse. Estos
microtúbulos reciben el nombre de microtúbulos cinetocóricos, mientras que los restantes
microtúbulos del huso mitótico se denominan microtúbulos polares (los que crecen alejando los
centros polares) y astrales (que interactúan mediante proteínas con la envoltura tirando de los
centros polares).
Metafase. Los microtúbulos cinetocóricos desplazan a los cromosomas a lo largo del huso y
terminan por alinearlos en la línea media del huso mitótico, la placa metafásica. Esta
organización ayuda a asegurar que en la próxima fase, cuando los cromosomas se separan,
cada nuevo núcleo recibirá una copia de cada cromosoma.
Anafase. La anafase comienza cuando los cinetocoros en cada cromosoma se separan,
permitiendo que las dos cromátidas hermanas se desapareen y se desplacen hacia polos
opuestos. A partir de este momento cada cromátida pasa a ser considerada un cromosoma. El
movimiento de los cromosomas se divide en dos etapas. Durante la anafase A, los
microtúbulos cinetocóricos se acortan, acercando los cromosomas a los polos del huso
mitótico. Durante la anafase B, los microtúbulos polares se alargan, aumentando la separación
entre los polos.
La citocinesis usualmente comienza en esta fase y luego continúa durante la telofase.
Telofase. Una nueva envoltura nuclear se forma alrededor de cada grupo de cromosomas
hijos, que vuelven a descondensarse y dejan de ser visibles al microscopio óptico. En células
vegetales, se puede observar en esta fase una estructura denominada fragmoplasto en el
espacio entre ambos núcleos, y es el precursor de la nueva pared celular que va a separar a
las células hijas.

31. Una población de células que se dividen activamente puede clasificarse en:
 Población sincrónica, en que las células van atravesando las distintas etapas del ciclo a la
vez, y en particular se dividen al mismo tiempo. Las células de los embriones tempranos de la
mayoría de los animales son un ejemplo de población sincrónica.
 Población asincrónica, las células atraviesan el ciclo desfasadamente, y a cada momento
pueden encontrarse células en todas las etapas del ciclo celular.
Estrategia experimental
El análisis de los parámetros de la cinética celular ha sido objeto de intenso estudio,
principalmente debido a sus implicaciones en el desarrollo de terapias para el cáncer. En esta
actividad práctica introduciremos algunos conceptos clave para el análisis de estos parámetros.
El índice mitótico de una población celular es la proporción de células en mitosis que hay en
esta población:
IM = nº de células en mitosis / nº de células totales.
En una población asincrónica, el número de células en mitosis va a depender de la proporción
que ocupe la mitosis dentro de la duración del ciclo celular. Por ejemplo, si para cierta
población celular la mitosis ocupa un 5 % del total del ciclo celular, cabría esperar, por
probabilidad, que aproximadamente un 5 % de las células estuviera en mitosis en un momento
dado. A la inversa, al obtener el índice mitótico de una población celular asincrónica, se obtiene
la proporción que ocupa la mitosis dentro del ciclo celular para esa población. Además, puesto
que en la mayoría de las células la mitosis dura aproximadamente una hora, conocer el índice
mitótico permite calcular la duración total aproximada del ciclo celular. En el ejemplo anterior, el
ciclo celular duraría 20 horas (1 hora * 100/5).
La población celular que utilizaremos en la parte 1 es un meristemo de raíz de cebolla. Un
meristemo es un tejido vegetal no diferenciado, en el cual las células se dividen activamente
para luego diferenciarse, y por lo tanto es ideal para reconocer células en interfase y en
distintas etapas de la mitosis, así como para calcular el índice mitótico.
Parte 2
La autorradiografía es una técnica que permite localizar en tejidos y células un isótopo
radiactivo, que puede haberse incorporado de diversas maneras. Consiste en cubrir al tejido o
células que contienen al isótopo radiactivo con una delgada capa de emulsión fotográfica,
dejándolo en oscuridad por un cierto tiempo, para que la emulsión quede expuesta a la
radiación emitida por el espécimen. La emulsión que se encuentra exactamente arriba de las
zonas que poseen radiactividad va a velarse, y luego del revelado se van a ver al microscopio
como granos oscuros.
En la tabla I del protocolo de actividades prácticas, se muestran datos obtenidos mediante
autorradiografía.
Un cultivo de células de mamífero en crecimiento rápido fue incubado por 30 minutos con 3H-
timidina. La timidina es la base timina unida a desoxirribosa, y es un precursor del ADN. La 3H-
timidina contiene tritio, el isótopo radiactivo del hidrógeno. La 3H-timidina va a incorporarse al
ADN de las células, pero sólo al de las células que estén en la fase de síntesis de ADN, es
decir en la fase S del ciclo celular.
Luego de la incubación, la 3H-timidina fue removida del medio de cultivo y se extrajeron
muestras a intervalos regulares de 3 horas, que fueron procesadas para autorradiografía.
Posteriormente, las muestras fueron teñidas con hematoxilina, para visualizar los núcleos de
las células que no incorporaron timidina marcada. En cada muestra, se contó el número de
células mitóticas, y se las clasificó en marcadas y no marcadas, calculándose el porcentaje de
mitosis marcadas sobre mitosis totales, tal como aparece en la tabla. Por último, se graficó este
porcentaje en función del tiempo.
Para entender cómo puede obtenerse la duración de las fases del ciclo celular a partir de este
tipo de gráfico, consideraremos una situación simplificada.
Un cultivo celular típico es una población asincrónica, en la que las células entran y salen de la
fase M a distintos tiempos. Más aún, la duración de cada fase, en particular G1, va a ser
distinta para cada célula. Para hacer más sencillo el análisis, consideraremos una población
asincrónica, pero en la cual las fases del ciclo celular duran lo mismo para todas las células.
También asumiremos que la fase M es tan corta comparada con las demás fases que puede
tomarse como instantánea. La pregunta a resolver es: ¿qué forma tendría una gráfica de
mitosis marcadas sobre mitosis totales en función del tiempo, en esta situación?

32. Veamos en primer lugar como se distribuyen las células a T0, o sea al final del pulso de 3H-
timidina:
A este tiempo, las células marcadas están todas en fase S, porque sólo las células que
sintetizan ADN pueden incorporar 3H-timidina y marcarse. Por lo tanto, a T0 el porcentaje
de mitosis marcadas será igual a 0. Cuando las primeras células marcadas lleguen a la fase
M, a T = T1, la distribución será la siguiente:
Como las células atraviesan el ciclo a la misma velocidad (porque la duración de cada fase es
igual para todas), cuando las células marcadas llegan a fase M, las células que a T0 estaban
en G2 ya pasaron la fase M y ahora están en G1. Por lo tanto, a T1, en fase M solo hay células
marcadas, y el porcentaje de mitosis marcadas es 100%. A medida que vayan llegando células
marcadas a fase M, el porcentaje de mitosis marcadas se mantendrá en 100%.
Cuando la última célula marcada salga de fase M, a T = T2, el porcentaje de mitosis marcadas
volverá a caer a 0. Eventualmente, a T = T3, las células marcadas volverán a llegar a fase M,
repitiéndose el esquema correspondiente a T1.
Por lo tanto, la gráfica de mitosis marcadas
sobre mitosis totales en función del tiempo,
para esta situación, tendrá la siguiente forma:
Una serie de picos regulares…
El 100% de mitosis marcadas se alcanza a T1, cuando las primeras células marcadas llegan a
fase M. A su vez, las primeras células marcadas en llegar a fase M son células que a T0

33. estaban al final de la fase S, y por ende sólo les queda recorrer G2 para llegar a fase M (ver
esquema a T = T0). Por lo tanto, en este gráfico, T1 -- T0 es igual a G2.
El 100% de mitosis marcadas se mantiene hasta que llegan a fase M las últimas células
marcadas. Estas son células que a T0 estaban al comienzo de S. Por lo tanto, el tiempo que
transcurre entre que llegan a fase M las primeras y las últimas células marcadas es igual a la
duración de la fase S. Este tiempo es igual a T2 – T1.
Por último, el tiempo entre T1 y T3 es igual a la duración total del ciclo celular, ya que es el
tiempo entre dos fases M para las mismas células.
En suma, de esta gráfica se obtienen la duración de G2, de S y del total del ciclo celular. Si
conocemos la duración de la fase M (en general igual a 1 hora), podemos además obtener la
duración de G1.
En resumen, la idea básica es usar la mitosis como una ventana y observar a la cohorte de
células marcadas con timidina tritiada pasar por ella.
El análisis de la gráfica obtenida con los datos de la tabla I es muy similar, pero debe
considerarse el efecto de la variación del ciclo celular y sus fases dentro de la población
celular. El efecto gráfico que produce esta consideración es una curva suavizada de una
oscilación amortiguada. El problema biomatemático que se suscita es cómo obtener
información de los parámetros celulares a partir de éste gráfico.
El propio Henry Quastler, pionero en el análisis autorradiográfico del ciclo celular también fue el
padre del concepto de utilizar las intersecciones de la curva con el 50% de las mitosis
marcadas/mitosis totales como un estimador de las duraciones medias de las fases del ciclo.
Este es el método que se utilizará en clase. Sin perjuicio de ello, debe saberse que en los
casos en que el segundo pico no alcanza al 50% se debe recurrir a modelos matemáticos
complejos que están fuera de la órbita de este curso.
Como verán en la parte práctica, para poder obtener una curva de la que se puedan
estimar los tiempos de las etapas del ciclo celular se deberá, previamente, sincronizar la
población celular. Hablamos de sincronizar una población asincrónica cuando logramos
que todas las células se encuentren en la fase M en un determinado momento.
Parte 3
Análisis de parámetros del ciclo celular mediante citometría de flujo
Cuantificación de ADN
Para determinar rápidamente parámetros del ciclo de una población celular puede utilizarse
citometría de flujo. Un método clásico consiste en incubar a las células (vivas o fijadas y
previamente permeabilizadas) con ioduro de propidio (PI), un agente que se intercala en el
ADN de forma estequiométrica y emite fluorescencia cuando es excitado con una
determinada longitud de onda. El material teñido es entonces medido en el citómetro de
flujo, y la señal fluorescente genera un pulso electrónico en los detectores con una altura
(amplitud) que es proporcional a la emisión de fluorescencia total de la célula. La clave para
esta interpretación es que la célula incorpora una cantidad de colorante proporcional a su
contenido de ADN. Utilizando estándares adecuados, con contenidos diploides conocidos
como eritrocitos de pollo, se puede determinar la ploidía de las células de interés
Determinación de parámetros cinéticos del ciclo celular (análisis multivariado)
El análisis cuantitativo de ADN es ampliamente utilizado para estimar la distribución de las
fases del ciclo celular. Sin embrago, este tipo de análisis no aporta información citodinámica
como la duración del ciclo o el tiempo de tránsito entre las fases. Estos parámetros pueden
determinarse utilizando autorradiografía y determinando la cantidad de mitosis marcadas, o
mediante técnicas más modernas de marcaje de células que están sintetizando ADN.
Fase S

34. Uno de los abordajes más utilizados es la incorporación en el medio de cultivo de un nucleótido
no radiactivo, la bromodesoxiuridina (BrdU), un análogo de timidina que puede ser identificado
mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU conjugados a una molécula fluorescente. La
citometría de flujo permite la medición simultánea de la cantidad de BrdU incorporado y del
contenido de ADN en cada célula, permitiendo realizar el seguimiento de un grupo de células a
través del ciclo.
Fase M
La histona H3 es fosforilada durante la mitosis entre la profase y la anafase tanto mitótica como
meiótica, y por tanto su fosforilación puede ser utilizada para determinar la cantidad de células
que se encuentran en fase M. Para ello se utiliza un anticuerpo conjugado a un fluorocromo (en
el ejemplo, Alexa-647) capaz de unirse sólo a la forma fosforilada de la histona H3.
Combinando esta técnica con la tinción de ADN, es posible discriminar las células que se
encuentran en fase M de la región G2M, y por consecuencia también aquellas que se
encuentran en G2, como se muestra en las siguientes gráficas.
III. PROCEDIMIENTOS
1. Mitosis en cebolla
Preparación de la cebolla
Llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres
palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días
aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 ó 4 cm. de longitud.
Cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio
de reloj en el que se han vertido 2-3ml de Orceína A.
Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos,
evitando la ebullición,hasta la emisión de vapores
Con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un
portaobjetos, añadir una gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto.5
Colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja
enmangada dar unosgolpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede
extendida.
Sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. Poner el dedo pulgar
sobre el papel filtro en lazona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando
que el cubre resbale
Observar al microscopio
IV. CUESTIONARIO.
1. Describa los observado en práctica

35. PRACTICA N°8
DESARROLLO EMBRIONARIO
I. OBJETIVOS
Introducción al estudio de algunas etapas del desarrollo embrionario temprano y análisis
comparado de tipos de ovocitos, patrones de segmentación y gastrulación en los distintos
modelos.
Integración de conceptos de estructura y dinámica celular utilizando como modelo el
desarrollo.
Introducción al análisis de problemas fundamentales de la biología del desarrollo.
II. FUNDAMENTO
1. SEGMENTACIÓN:
El desarrollo de un organismo multicelular, luego de la fecundación, ocurre mediante un
proceso denominado clivaje o segmentación (serie de divisiones mitóticas que dividen al
citoplasma del cigoto en numerosas células más pequeñas, las blastómeras). El patrón de
segmentación embrionaria está determinado principalmente por 2 parámetros: 1) factores
genéticos que establecen el ángulo y momento de formación del huso mitótico y 2) la cantidad
y distribución del vitelo.
En general, el vitelo inhibe la segmentación; el polo animal del embrión se encuentra
relativamente libre de vitelo y su opuesto, el polo vegetal, es rico en éste.
De acuerdo a la cantidad de vitelo que presentan, los ovocitos se clasifican en: oligolecitos
(poca cantidad de vitelo, generalmente con distribución homogénea (isolecito)), mesolecitos
(cantidad moderada de vitelo distribuido hacia el polo vegetal) y telolecitos (abundante
cantidad de vitelo que ocupa prácticamente todo el volumen ovocitario). El patrón de
segmentación en embriones provenientes de ovocitos isolecitos y mesolecitos es holoblástico
o total y en embriones provenientes de ovocitos telolecitos es meroblástico o parcial.
Hacia el final de esta primera etapa del desarrollo embrionario ocurre la formación de una
cavidad dentro de la masa de blastómeras en división denominada blastocele. El embrión
resultante se conoce como blástula.
2. Gastrulación
Es un proceso de movimiento celular que involucra a todo el embrión y resulta en la
organización de las 3 hojas embrionarias: ectodermo (capa celular externa), mesodermo
(capa celular intermedia) y endodermo (capa celular interna).
Aunque el patrón de gastrulación es variable dependiendo de la especie, usualmente involucra
una combinación de los siguientes tipos de movimientos básicos:
- invaginación: plegamiento de una capa de células hacia el interior del embrión.
- involución: movimiento de una capa de células utilizando otra como sustrato hacia el interior
del embrión.
- ingresión: migración de células individuales hacia el interior del embrión.
- delaminación: g
eneración de una capa de células que se desprende a partir de otra capa celular.
- epibolia: expansión de una capa celular sobre otras células o capas.
III. PROCEDIMIENTO.
1. OBSERVACIÓN DEL DESARROLLO EMBRIONARIO DE ANFIBIOS
Preparar la muestra eliminando todo tipo de impurezas.
Llevar a un portaobjetos y observar en el microscopio o con ayuda de la lupa
IV. CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son las 4 grandes etapas del desarrollo embrionario?
2.- ¿Cómo afecta el vitelo la segmentación del cigoto?
3.- ¿Qué es la medialuna gris y qué vinculación tiene con las etapas posteriores en el
desarrollo de los batracios?
4.- Construya una oración que vincule los siguientes términos: gastrulación, blastoporo,
células en botella, invaginación.
5.- ¿Cuál es el nombre de las células que ingresan al inicio de la gastrulación en erizo de
mar? Estas células formarán un anillo que marca el sitio donde se inicia la formación

36. del_________________________ por invaginación de la _______________
__________________.
6.- ¿Cómo se denomina la región del cigoto de batracios que se forma al ingresar el
espermatozoide, opuesta a su entrada, que se produce debido a una rotación de
aproximadamente 30º en el citoplasma cortical? Ésta región determina el sitio donde se
formará el _________________ ___________________ del blastoporo.

37. PRACTICA N°9
MEIOSIS
I. OBJETIVOS
Reconocer y diferenciar los estados fisiológicos por los que atraviesan los cromosomas
durante el proceso meiótico en células animales
II. FUNDAMENTO
La meiosis es un proceso celular, ligado a la reproducción sexual, por el cual, la célula madre
de naturaleza diploide, da origen a los gametos de naturaleza haploide, de tal manera que en la
fecundación se re establece el número diploide de cromosomas. Así, mientras la mitosis es un
proceso de división celular con formación de dos núcleos hijos con el mismo número de
cromosomas que la célula original, en la meiosis en cambio hay dos divisiones celulares con
reducción del número de cromosomas a la mitad. La meiosis es un proceso citológico que
comprende dos divisiones celulares. En la primera división meiótica ocurre una serie de
intercambios de material genético entre los cromosomas homólogos. Este fenómeno es un
proceso complejo que comprende una larga profase en la que, para su mejor estudio y
comprensión, se distinguen los estadios: Leptoteno, Cigoteno, Paquiteno, Diploteno y
Diacinesis. Entre latelofase I y el comienzo de la segunda división meiótica, a diferencia con la
mitosis, no hay un período desíntesis y duplicación del ADN, por lo demás la división meiótica
II, tiene lugar como la mitosis normal encada una de las células haploides (meiocitos de
segundo orden), resultantes de la división meiótica
III. PROCEDIMIENTO.
1. MATERIALES Y METODOS
Un excelente material para la observación de los procesos de división celular lo constituyen
insectos de la especie Grillos asimilis “grillo domestico” y Laplatacris sp “langosta”. En los
individuos machos debe recuperarse el testículo después de la disección en el que se estudiará
la meiosis en células de maduración (espermatocitos) de la zona proximal al canal deferente. El
material a usar en el presente ejercicio es el siguiente:
-Microscopio
-Mechero de alcohol
-Cloroformo
-Carmín acético
-Carnoy
-Solución salina 0.7%
-Placas petri
-Laminas, laminilla
- Algodón
-Papel filtro
-Estilete de punta fina
Anasteciar los animales en las placas petri, colocando dentro de un pedazo de algodón
embebido en cloroformo.
Disecar el animal con la ayuda del estereomicroscopio o lupas, colocándolo en posición
dorsal.Separar los testículos adicionándoles la solución salina procurando no exponer los
órganos al airepara evitar posibles desecaciones.
Seccionar los testículos en partes pequeñas de 2 a 3 mm y colocarlos en un vial con fijador
carnoypor espacio de 30 min.
Traspasar los fragmentos a una luna de reloj que contiene carmín acético y lleve al calor
delmechero hasta que entre en ebullición por espacio de 15 segundos de 5 a 7 veces.
Retire el fragmento del testículo con una pinza de punta fina y colóquela sobre un
portaobjetos yagréguela una gota de carmín acético.
Tape la preparación con una laminilla cubre objetos y sobre esta ponga un papel
absorbente.Presione el cubre objetos con la yema del dedo pulgar y luego con la extremidad
plana de un lápizpresionar un poco mas fuerte hasta convertir el material del porta objetos
en una capa delgada(squash). Al realizar esta operación, tenga cuidado para no romper el
cubre objetos.

38. Limpie el exceso de colorante del porta objetos con papel higiénico y lleve el preparado
almicroscopio para su observación a menor y mayor aumento.
Observar y esquematizar.
IV. CUESTIONARIO

39. PRACTICA N°9
FECUNDACIÓN
I. OBJETIVOS
Identificar gametos masculinos y femeninos en erizo de mar.- Evidenciar el proceso de
la fecundación.
II. FUNDAMENTO
La fecundación es el proceso de unión del óvulo y el espermatozoide, y en virtud de la cual se
origina el cigoto o célula huevo. La fecundación en la especie humana es interna, pues se lleva
a cabo en el interior del aparato reproductor de la hembra, concretamente en las trompas de
Falopio.
En esta práctica se observará el proceso de fecundación entre un gameto
masculino(espermatozoides) y un gameto femenino (ovulo), en erizo de mar. Se podrán
observar los gametos o Células reproductoras masculina y femenina, cuyo núcleo sólo contiene
un cromosoma de cada par. El óvulo es una célula redonda de gran tamaño. Posee un núcleo
donde se alojan los cromosomas portadores de la información genética materna, y un
citoplasma que posee sustancias nutritivas para alimentar al embrión en sus primeras etapas,
en el caso de que ocurra la fecundación.
El espermatozoide, o gameto masculino, es una célula pequeña con capacidad de movimiento
para poder alcanzar al óvulo.
Según donde se encuentren el espermatozoide y el óvulo, existen dos tipos de fecundación:
a) Fecundación EXTERNA, cuando tanto el macho como la hembra liberan sus
gametos al medio externo, que es el agua, de manera que los espermatozoides
nadan en el agua hasta encontrar a los óvulos. Es lo típico de todos los animales
invertebrados acuáticos, y en los vertebrados se da en los peces y en los anfibios