separacion de fosfolipidos por cromatografia de capa fina

1. INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
Separación de fosfolípidos por
cromatografía de capa fina.
Determinación de colesterol en la
yema de huevo.
Laboratorio de Bioquímica

2. OBJETIVOS:
▪ Aplicar la técnica de cromatografía en la capa fina
para la separación de fosfolípidos de yema de
huevo.
▪ Discutir las ventajas de la técnica de separación
respecto a la cromatografía en papel.
▪ Determinar la concentración de colesterol en la
yema de huevo, por el método de Lieberman-
Burchard.

3. INTRODUCCIÓN:
Los lípidos son biomoléculas de alto peso molecular,
conformadas por C,H y deficientes en O. Se clasifican en
simples y compuestos.
Los fósfolipidos son lípidos complejos antipáticos que
contienen grupos fosfato en su estructura, se encuentra en
yema de huevo como fosfatidilcolina.
Entre los lípidos simples, que son derivados del isopreno,
se encuentra el colesterol.
La cromatografia en capa fina determina el grado de
pureza, da seguimiento a alguna reacción y compara
muestras que determinen distinción química entre varios
reactivos a través de una placa cubierta por el adsorbente.

4. SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS
POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA
FINA.
15 ml
Cloroformo-metanol
(2:1)
MEZCL
AR
AGITA
R
20
min
Mezclar filtrado
con 5ml de KCl
O.1ml
Repos
o
Acuos
a
Orgáni
ca

5. Molibdat
o
Bismut
o
Yod
o
Ninhidrin
a
1c
m
Fosfolípido
s con
colina
Fosfolípidos
con dobles
enlaces
Fosfolípidos
con grupos
amino
Prueba
general de
fosfolípidos

6. Determinación de colesterol
en la yema de huevo
Serie de 7
tubos
(B,1,2,3,4,5,6,P
b).
Estándar de
colesterol (ml)
*B, Pb*
Cloroformo (ml)
*5*
Extracto de lípidos
(ul) solo al Pb
Anhídrido
acético (ml)
0.40
Acido sulfúrico
conc. (ul) 50.

7. Fundamento de la reacción de
Lieberman-Burchard.
En solución clorofórmica, el
colesterol reacciona con
anhídrido acético y acido sulfúrico
para dar un complejo de color
verde que resulta de la mezcla de
dos compuestos: uno azul y uno
amarillo y se cuantifican a 640
nm.

8. El colesterol reacciona con anhídrido acético y ácido
sulfúrico concentrado. Se produce una pérdida de agua y
una protonización del colesterol. Se constituyen en medio
anhidro polímeros de hidrocarburos no saturados de intenso
color verde azulado.

9. CURVA TIPO
Absorbancia
Conc. de colesterol
µg / ml

10. 1ml 80Μg/ml
0.25 ml 20Μg/ml
0.50 ml 40 Μg/ml
0.75 ml 60 Μg/ml
1.0 ml 80 Μg/ml
1.25 ml 100 Μg/ml
CALCULO DE CONCENTRACIÓN DE
COLESTEROL Μg/ml

11. OBTENCIÓN DE COLESTEROL EN LA
MUESTRA
FILTRADO DE YEMA CONVERTIDO A Μg
Muestra prueba 5 ΜL – 60 Μg colesterol
5.5 ml * 1000 Μl = 5500 Μl
Filtrado obtenido de cada equipo – 66,000 Μg
66,000 Μg / 1000 mg = 66 mg
66mg * 2 = 132 mg de colesterol