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The multiple roles of CRP at the complex  acs  promoter depend on activation region 2 and IHF Bianca Sclavi  et al. Molecular Microbiology ,  65 , 425–440
1: Was/Wofür ist das  acs -Gen? acs  steht für Acetyl-CoA-Synthetase.   Acetyl-CoA-Synthetase kommt in allen Organismen vor.  Hier wurde  E. coli  untersucht. Acetyl-CoA-Synthetase ist eine Ligase, die die Synthese von Acetyl-CoA aus Acetat und Coenzym A katalysiert.     Acetat kann somit als Kohlenstoffquelle genutzt werden und im Citratzyklus oder in der Biosynthese verwendet werden. Wird benötigt, wenn Kohlenstoffmangel herrscht, da andere C-Quellen zur Neige gehen.
3:  acs  auf der DNA  P1, P2 & P2A sind Promotoren  P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP
4: Was macht IHF & CRP? IHF ist ein Nucleoid-Protein. Das bedeutet, es verändert die Form der DNA, Bsp. bei der Kondensation zu Chromatin. CRP bindet an cAMP, wodurch dieser CRP-cAMP-Komplex an die DNA binden kann.  Anschließend kann die RNA-Polymerase rekrutiert werden.
3:  acs  auf der DNA  P1, P2 & P2A sind Promotoren  P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP
3a: Klassen von Promotoren Klasse 1 Promotor: - Transkriptionsfaktor     (hier: CRP) bindet bei Position      -60 oder höher - Kontakt zwischen    Transkriptionsfaktor & α-CTD Klasse 2 Promotor: - Transkriptionsfaktor     überlappt mit der -35 Region - Kontakt zwischenTranskriptions-    faktor & α-NTD, σ-Untereinheit      und manchmal α-CTD Klasse 3 Promotor: - Klasse 1/Klasse 1 oder     Klasse 1/Klasse 2 Verknüpfung
5: Bisherige Bewertung der verschiedenen Domänen von  acs Ist sowohl die IHF III- und die CRP II-Stelle besetzt, stoppt die Transkription, da diese Kontakte die RNA-Polymerase fest binden. CRP I muss besetzt sein, damit der Promotor P2 genutzt werden kann. Um die höchste Transkriptionsrate zu erreichen, muss auch CRP II besetzt sein. IHF I und IHF II wirken dieser Überstabilisierung entgegen.
5a: Verwendete DNA-Bruchstücke & Mutanten
6: Beitrag von IHF bei der Transkription
7: Beitrag von CRP bei der Transkription
8: Aktive Regionen  von CRP Varianten: 1+  2+  3°  = WT 1+  2-   3°           1+  2+  3+   1+  2-   3+                                        1-  2+ 3° 1-  2-  3° 1-  2+ 3+ 1-  2-  3+ AR1 & AR2 sind natürlich   AR3 ist künstlich
9: Auswirkungen dieser Mutanten auf die Transkriptionsrate mutierte AR1-Region: keine Promotoraktivität, unabhängig von den weiteren Mutationen
                 Footprinting Assay 1. DNA-Ende markieren 2. Protein zugeben 3. Partialverdau der DNA  4. Protein entfernen   5. Gelelektrophorese  - Footprints (Lücken): von Protein geschützte Bereiche    - Hypersensitive Sites (Banden): von Protein freigelegte Bereiche
10: Charakterisierung der Proteinbindung durch DNase I Footprinting Assay
11: Vorstellung von Potassium (= Kaliumpermanganat) Footprinting Analysis - DNA & Proteine inkubieren - KMnO4 zugeben - Proteine & KMnO4 entfernen - Primer Extension - Gelelektrophorese Banden: Einzelsträngiger Bereich der DNA
12: Charakterisierung der Proteinbindung mit Kaliumpermanganat-Footprinting Analysis
 
 
 
 
Zusammenfassende Gedanken zum acs-Promotor - Regulierung durch Protein-DNA Interaktionen & durch Protein-Protein Interaktionen ==>diverse Signale können miteinbezogen werden - CRP, IHF & FIS stellen die wichtigsten Regulatoren dar - TOC (transcription open complex) wird de-/über-/stabilisiert - Aktivierung wenn C-Quellen aufgebraucht, um acetate & coA zu Acetyl-CoA zu katalysieren und dieses im Citratzyklus verwerten zu können - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von  - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von Acetyl-CoA synthetase

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  • 1. The multiple roles of CRP at the complex acs promoter depend on activation region 2 and IHF Bianca Sclavi et al. Molecular Microbiology , 65 , 425–440
  • 2. 1: Was/Wofür ist das acs -Gen? acs steht für Acetyl-CoA-Synthetase.   Acetyl-CoA-Synthetase kommt in allen Organismen vor.  Hier wurde E. coli untersucht. Acetyl-CoA-Synthetase ist eine Ligase, die die Synthese von Acetyl-CoA aus Acetat und Coenzym A katalysiert.     Acetat kann somit als Kohlenstoffquelle genutzt werden und im Citratzyklus oder in der Biosynthese verwendet werden. Wird benötigt, wenn Kohlenstoffmangel herrscht, da andere C-Quellen zur Neige gehen.
  • 3. 3: acs auf der DNA P1, P2 & P2A sind Promotoren P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP
  • 4. 4: Was macht IHF & CRP? IHF ist ein Nucleoid-Protein. Das bedeutet, es verändert die Form der DNA, Bsp. bei der Kondensation zu Chromatin. CRP bindet an cAMP, wodurch dieser CRP-cAMP-Komplex an die DNA binden kann. Anschließend kann die RNA-Polymerase rekrutiert werden.
  • 5. 3: acs auf der DNA P1, P2 & P2A sind Promotoren P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP
  • 6. 3a: Klassen von Promotoren Klasse 1 Promotor: - Transkriptionsfaktor     (hier: CRP) bindet bei Position      -60 oder höher - Kontakt zwischen    Transkriptionsfaktor & α-CTD Klasse 2 Promotor: - Transkriptionsfaktor    überlappt mit der -35 Region - Kontakt zwischenTranskriptions-   faktor & α-NTD, σ-Untereinheit      und manchmal α-CTD Klasse 3 Promotor: - Klasse 1/Klasse 1 oder     Klasse 1/Klasse 2 Verknüpfung
  • 7. 5: Bisherige Bewertung der verschiedenen Domänen von acs Ist sowohl die IHF III- und die CRP II-Stelle besetzt, stoppt die Transkription, da diese Kontakte die RNA-Polymerase fest binden. CRP I muss besetzt sein, damit der Promotor P2 genutzt werden kann. Um die höchste Transkriptionsrate zu erreichen, muss auch CRP II besetzt sein. IHF I und IHF II wirken dieser Überstabilisierung entgegen.
  • 9. 6: Beitrag von IHF bei der Transkription
  • 10. 7: Beitrag von CRP bei der Transkription
  • 11. 8: Aktive Regionen von CRP Varianten: 1+  2+  3°  = WT 1+  2-   3°           1+  2+  3+  1+  2-   3+                                       1-  2+ 3° 1-  2-  3° 1-  2+ 3+ 1-  2-  3+ AR1 & AR2 sind natürlich   AR3 ist künstlich
  • 12. 9: Auswirkungen dieser Mutanten auf die Transkriptionsrate mutierte AR1-Region: keine Promotoraktivität, unabhängig von den weiteren Mutationen
  • 13.                 Footprinting Assay 1. DNA-Ende markieren 2. Protein zugeben 3. Partialverdau der DNA 4. Protein entfernen   5. Gelelektrophorese - Footprints (Lücken): von Protein geschützte Bereiche   - Hypersensitive Sites (Banden): von Protein freigelegte Bereiche
  • 14. 10: Charakterisierung der Proteinbindung durch DNase I Footprinting Assay
  • 15. 11: Vorstellung von Potassium (= Kaliumpermanganat) Footprinting Analysis - DNA & Proteine inkubieren - KMnO4 zugeben - Proteine & KMnO4 entfernen - Primer Extension - Gelelektrophorese Banden: Einzelsträngiger Bereich der DNA
  • 16. 12: Charakterisierung der Proteinbindung mit Kaliumpermanganat-Footprinting Analysis
  • 17.  
  • 18.  
  • 19.  
  • 20.  
  • 21. Zusammenfassende Gedanken zum acs-Promotor - Regulierung durch Protein-DNA Interaktionen & durch Protein-Protein Interaktionen ==>diverse Signale können miteinbezogen werden - CRP, IHF & FIS stellen die wichtigsten Regulatoren dar - TOC (transcription open complex) wird de-/über-/stabilisiert - Aktivierung wenn C-Quellen aufgebraucht, um acetate & coA zu Acetyl-CoA zu katalysieren und dieses im Citratzyklus verwerten zu können - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von Acetyl-CoA synthetase