1. 25/03/2008
UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA
La Universidad Católica de Loja
CENTRO DE BIOLOGÍA CELULAR Y
MOLECULAR CBCM
Vigilancia y Caracterización por Genotipificación de
Rotavirus en niños menores de cinco años en el
Hospital Isidro Ayora: Resultados Preliminares
Paula Torres Bailón
Orígenes de ROTAVIRUS RV
En 1973 Ruth Bishop y colaboradores descubren RV en Australia.
Biopsias de intestino delgado de niños que tenían diarrea severa de origen no
bacteriano.
Microscopía electrónica,
electrónica,
dichos virus presentaron
apariencia de una rueda
de carreta antigua.
Bautizados con el nombre
de rotavirus, del latín rota,
rotavirus, rota,
que quiere decir rueda.
rueda.
Desde entonces reconocidos
como el principal agente
etiológico de las gastroenteritis
virales en las crías de un gran
número de mamíferos y de aves.aves.
Surge gran cantidad de información
sobre las propiedades biológicas y
epidemiológicas.
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2. 25/03/2008
ROTAVIRUS RV
RV principal causa de
diarrea deshidratante
severa en niños • 440,000 de muertes
• 82% en países en vías de desarrollo
Fuente: Parashar et al. Emerging Infectious Diseases 9(5): 565-72.
Rotavirus causa Gastroenteritis
Características Clínicas:
Periodo de incubación de 1 a 3 d as
e odo cubac ó días
Fiebre (en algunos casos)
Vómito
Diarrea (hasta 8 evacuaciones/día)
• Heces:
• Acuosas
• No sanguinolentas
• Ausencia de leucocitos
• Duración: 3–9 días.
3–
Deshidratación moderada a severa
Acidosis metabólica
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3. 25/03/2008
Rotavirus causa Gastroenteritis
Características Clínicas:
Los síntomas de la enfermedad ocurren comunmente
en niños de 3 meses a 2 años de edad. (Población de
alto riesgo)
La mayoría de infecciones por rotavirus pueden ser
asintomáticas,
asintomáticas, constituyendo reservorios para
transmisión a individuos susceptibles. (Adultos)
Rotavirus causa Gastroenteritis
Transmisión
Oro – fecal.
Superficies inanimadas.
Agua contaminada.
Excresiones asintomáticas.
Excresiones sintomáticas.
Posiblemente por secreciones respiratorias ???
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4. 25/03/2008
Rotavirus causa Gastroenteritis
Grandes brotes
Exposición rápida y uniforme.
La mayoría de los niños durante su primera etapa de vida han
sufrido infección por RV.
Cierto patrón estacional durante otoño invierno principalmente en
países de clima templado.
Dosis infecciosas:
Niños contaminados excretan 100 billones de partículas
p
rotavirales por mL de heces.
De 104 a 107 de partículas virales son suficientes para causar
infección clínica.
Los niños podrían eliminar virus y presentarse asintomáticos,
asintomáticos,
antes de llegar a estar enfermos.
Los rotavirus presentes en materias fecales, podrían sobrevivir
fecales,
por días o semanas sobre superficies expuestas al ambiente.
Patofisiología de la Gastroenteritis
Rotaviral
Ingestion of as
few as 10,000
viral particles
Infection and destruction of absorptive
Intestinal villus cells, secretory (Crypt) NSP4,
cells spared an enterotoxin?
Decreased Diminished Net fluid excretion
absorption of disaccharidase
salt and water activity
Carbohydrate
Net fluid secretion malabsorption
Osmotic diarrhea Metabolic acidosis Ischemia
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5. 25/03/2008
Rotavirus (RV)
Familia:
Reoviridae Interés
Género:
Género:
Rotavirus
Tamaño:
60-85 nm
Genoma:
• ds RNA
• Proteínas Estructurales VP:
VP1,VP2,VP3,VP4,VP6,VP7
• Proteínas No Estructurales NSP:
NSP1, NSP2,NSP3,NSP4,NSP5
Estructura:
Icosaédrica
Clasificación de RV
Correlación poco definida
de Genotipo y Serotipo
P: 13 serotipos
Grupos: A,B,C,D,E,F,G
Subgrupos: I,II,I+II,no I, no II
G: 15 serotipos
Correlación Clara de
Genotipo y Serotipo
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6. 25/03/2008
NOMENCLATURA
Cepa Wa RV Humano: G1P1A[8]
G Tipo P Tipo Grupo
G1 P1 A [8]
# # #
G Tipo Serotipo Genotipo
Genoma
11 segmentos dsRNA Patrón Corto
0.6 y 3.3 Kb
Patrones Electroforéticos de
1
migración en PAGE 2
3
Patrón Largo 4
Patrón Corto 5
Patrón Super corto 6
7
8
Método detección de RV 9
10
11
Laemmli,
Laemmli, 1970
Pereira et al., 1983
al., Patrón Largo
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7. 25/03/2008
PROTEÍNAS DE ROTAVIRUS
Segmento Producto Localización Características y función
Genómico Proteico
1 VP1 Core RNa polimerasa, unión al ssRNA, unión a VP3
2 VP2 Core Unión al dsRNA, requerida para la actividad replicasa de VP1
3 VP3 Core Guaniltransferasa, metiltransferasa, unión a ssRNA, unión con VP1
4 VP4 Cápside externa
p Hemaglutinina, antígeno neutralizante, p
g g potenciación infectividad
por proteasa, virulencia, putativa región de fusión, adhesión a la
célula, induce protección
5 NSP1 No estructural Básica, anillo de zinc, unión al ssRNA
6 VP6 Cápside Interna Hidrofóbica, trimérica, antígeno de subgrupo
7 NSP3 No estructural Ácida, dimérica, unión extreme 3`del mRNA viral, interacción con el
F4G1, inhibe traducción del huésped
8 NSP2 No estructural Básica, oligomérica, unión al ssRNA, NTPasa
9 VP7 Cápside externa Glicoproteína integrada en la membrana del RER, trimérica,
antígeno neutralizante, 2 regiones hidrofóbicas NH2 terminales,
unión al Ca2+, induce protección
10 NSP4 No estructural Glicoproteína transmembrana del RER, participa en morfogénesis,
enterotoxina, induce protección
11 NSP5 No estructural Básica, fosfoproteían, unión al ssRNA, proteína quinasa, interacción
con NSP2 y NSP6
NSP6 No estructural Interacción con NSP5, presente en viroplasmas y en la mayoría de
cepas
Villena C, Vigilancia Ambiental Molecular de Rotavirus Grupo A Humano
Genoma
VP4
P
VP7
G
Genotipos Comunes
G P
1 [8]
2 [4]
3
4
7

8. 25/03/2008
Vigilancia
Hospital Isidro Ayora
Áreas
Consulta Externa Emergencia Pediatría Laboratorio
Registro de Datos Prueba diagnóstico
de RV
Toma de muestras
Negativa Positiva
Estudios Moleculares
Caracterización
Toma de muestra
Kit RV -
Identificación Inmucroma
tográfico RV + Estudios Moleculares
1ra. Fase Extracción RNA Kit para extracción RNA
Electroforesis en PAGE
Tinción con plata
+ Electroferotipos
1. Reverso
1 R
transcripción
RT - PCR Para G G1,G2,G3,G4,G9
2. Amplificación
2da. Fase
Para P
P[4],P[6],P[8],P[9],P[10]
Agarosa - Tinción
Positivas para Comprobación genotipo
GyP SECUENCIACIÓN
3ra. Fase
Análisis Epidemiológico Molecular
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9. 25/03/2008
Resultados Preliminares: Vigilancia
ROTAVIRUS FRECUENCIA PORCENTAJE
78.7% Negativo
Negativo 303 78.7%
Positivo 82 21.3%
TOTAL 385 100%
21.3% Positivo
F 47.5 % EP
E-P EDA
59.76%
79.3%
CE P
14.63% 25.61%
Otro Dx
20.7%
M 52.5%
Importancia de los datos de
Vigilancia
Enfermedad Diarreica Aguda EDA en la ciudad de Loja
Ministerio de Salud Publica
Causa Periodo Casos por Edades (años)
<1 1a4 5 a 14
No definida Enero-Diciembre 2005 4368 8692 1949
Enfermedad Diarreica Aguda EDA Hospital Regional Isidro Ayora
Vigilancia de Rotavirus
Causa Periodo Casos por Edades (años)
<5
Rotavirus Julio-Octubre 2005 82
9

10. 25/03/2008
Resultados Preliminares:
Caracterización
MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
2
3
Alto Peso Molecular
4
5
6
Tamaño Mediano
7
8
Triplete Característico
9
10
11
Más Pequeños
Casos Positivos Electroferotipo:
Rotavirus Patrón Largo
82 31
MP: Marcador de Peso Molecular 100 pb
2,3,4,8,9,10: Electroferotipos Patrón Largo
Gracias
Público Presente.
Mi E i d T b j d l CBCM-UTPL
Equipo de Trabajo del CBCM-UTPL.
Autoridades
Compañeros
Estudiantes EBQF-UTPL
EBQF-
Diana Villacis
Jeimy Ruiz
Andrea González
Doris Macas
Gabriela Cevallos
Ma. Isabel Vivanco
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