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  1. 1. 2010 Volumen 2, No. 3 Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM APROVECHAMIENTO DE LAS CASCARAS DE MANGO COMO SOPORTE PARA LA PRODUCCIÓN DE POLISACARIDASAS José Juan Buenrostro-Figueroa1, Heliodoro de la Garza-Toledo1, Vrani Ibarra Junquera2 y Cristóbal Noé Aguilar1*. 1 Depto. De Investigación en Alimentos. Facultad De Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila. Bvd. Venustiano Carranza, 25000. Saltillo, Coahuila. 2 Facultad de Ciencias Químicas. Universidad de Colima. Coquimatlán, Colima. *Correo electrónico: cristobal.aguilar@mail.uadec.mx RESUMEN En nuestro país, el tratamiento adecuado de residuos agroindustriales puede evitar serios problemas de contaminación. En este estudio se evaluó la capacidad de producción de un complejo enzimático capaz de degradar los componentes celulares de cáscaras de mango a partir de fermentación en medio sólido con el hongo Trichoderma T-II, usando como soporte y fuente de nutrientes cáscaras de mango. Se encontró una alta actividad celulasa (7552.53±82.14 unidades de endoglucanasa por litro) y, en menor proporción, poligalacturonasa (1434.71±258.18 unidades de poligalaturonasa por litro), debido a la composición del soporte. Se observó una inhibición en la actividad enzimática por efecto de la síntesis de celobiosa y glucosa. El complejo enzimático obtenido representa una alternativa en el aprovechamiento integral del fruto y puede ser empleado en el tratamiento enzimático de pulpas de frutas. Palabras claves: Trichoderma, fermentación medio sólido, enzimas hidróliticas, cáscara de mango. INTRODUCCIÓN El mango (Mangífera indica L.) es considerado uno de los frutos tropicales más importantes a nivel mundial con una producción superior a 31 millones de toneladas en 2007 (FAOSTAT; 2009). De acuerdo a Larrauri et al. (1996) el 35-60% del peso total del fruto corresponde a los productos de la transformación, y son considerados un problema de eliminación grave, principalmente la cáscara (Ajila et al., 2010). En los últimos años se han buscado alternativas de producción agrícola sustentable que permitan el aprovechamiento de los residuos agroindustriales. Recientemente se han encontrado reportes sobre el uso de cáscaras para la producción de biogás (Mahadevaswamy & Venkataraman, 1990 y Madhukara et al,. 1993), como fuente de compuestos bioactivos como polifenoles, carotenoides, vitaminas y fibra dietaria (Larrauri et al., 1997; Ajila et al., 2007). Asimismo, se ha incorporado en alimentos como fuente de fibra (Ajila et al., 2010) y evaluado su capacidad anticancerígena (Kim et al., 2009). Sin embargo, existe poca información relacionada con el uso de cáscaras de mango como fuente de inductores de enzimas industriales de la fermentación de hongos. Mediante el uso de procesos de fermentación es posible la producción de compuestos de valor agregado. En este tipo de fermentación los residuos son utilizados como fuente de carbono-energía (Pandey et al., 2000). La fermentación con hongos se puede realizar mediante medio líquido (SmF) y medio sólido (SSF). La SSF se caracteriza por que el microorganismo crece en una matriz sólida en la ausencia o casi ausencia de agua libre en el sistema (Singhania et al., 2009). Debido a que la composición del complejo enzimático producido por la fermentación de hongos, depende fuertemente de la lignocelulosa utilizada como sustrato, los microorganismos y las condiciones de cultivo (Uhlig, 1998 y Ovadón-Chacón & Waliszewski, 1998), existen reportes que describen la utilidad de la SSF al alcanzar un nivel específico en la producción de ciertas enzimas hidrolíticas (Viniegra-González et al., 2003; Dos Santos et al., 2004; Rodríguez & Sanromán, 2006 & Aguilar et al., 2008), tales como pectinasas, hemicelulasas y celulasas, necesarias para una hidrólisis enzimática efectiva de residuos agroindustriales (de Siqueira et al., 2010). Las pectinasas son un grupo heterogéneo de enzimas que hidrolizan las sustancias pécticas. Jayani et al.(2005) reportan una clasificación de tal forma: protopectinasas, polygalatunosas, lyasas y pectinesterasas. Las enzimas pectonolíticas pueden ser usadas en el tratamiento de residuos agrícolas y en la extracción de jugos y su clarificación.
  2. 2. 2010 Volumen 2, No. 3 Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM La celulosa y la hemicelulosa son los principales polisacáridos de la pared celular de las plantas, y pueden ser fácilmente degradados a azúcares fermentables por enzimas secretadas por hongos filamentosos (Rodríguez & Piñeros, 2007), principalmente del género Aspergillus y Trichoderma, siendo el último el más estudiado (Agamez et al., 2008). Las enzimas celulolíticas son un sistema complejo de enzimas compuesto de exo-β-1,4-glucanasas (EC 3.2.1.91), endo-β-1,4-glucanasas (EC 3.2.1.4) y β-glucosidasas (EC 3.2.1.21), que actúa sinérgicamente para degradar el sustrato de celulosa y otros oligosacáridos a glucosa (Faria et al., 2008 & Briwani et al., 2010). De esta forma se obtienen azúcares que pueden ser utilizados para la producción de etanol. MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismos Se empleó una cepa de Trichoderma sp. proporcionada por el CISEF, denominada Trichoderma II (Colección DIA-UAdeC), la cual se encontraba en una solución crioprotectora (mezcla de glicerol al 10 % y leche descremada al 9 %, v/v) a -55 °C. Se tomaron 50 µL de la cepa almacenada y se inocularon en matraces Erlenmeyer con 50 mL de agar dextrosa papa (PDA) preparado previamente. Se procedió a incubar durante 3 días a 30 ºC. Transcurrido el tiempo se observó la producción de esporas, las cuales se cosecharon con 20 mL de una solución de Tween 80 al 0.01 % y se hizo el conteo en una cámara de Neubauer. Obtención de la cáscara de mango Las cáscaras fueron obtenidas de frutos de mango comprados en un mercado local de la ciudad de Saltillo, Coahuila, Méx. Los frutos fueron lavados, pelados, cortados, y la cáscara se deshidrató a 60 ºC durante 72 horas, hasta observar un peso constante en las muestras. Las cáscaras deshidratadas fueron pulverizados en un molino (TURBOMIX-Moulinex®), posteriormente se tamizaron por una malla de 0.038 mm para obtener un tamaño de partícula uniforme. Se llevaron a cabo análisis de fibra detergente neutra y ácida por el método de Van Soest (Van Soest & Wine, 1968; Van Soest, 1987). Condiciones de cultivo Para la producción del complejo enzimático se utilizó fermentación en estado sólido (SSF). La composición del medio de cultivo usado se describe a continuación [g/L]: (NH4) 2SO4 [4,38], MgSO4 • 7H2O [0,44], CaCl2 • 7H2O [0,044], • MnCl2 6H2O [0,009], NaMoO4 • 2H2O [0,004] y FeSO4 • 7H2O [0,06]. El pH del medio de cultivo se ajusto a 5.5. La fuente de carbono e inductor empleada fue cáscara de mango (CM) en polvo. Los reactores fueron matraces Erlenmeyer de 250 mL, a los cuales se le vertieron 3 g de soporte (CM) por cada 7 mL de medio de cultivo, obteniendo de esta manera una humedad inicial del 70%. Posteriormente se les inoculó 1.2x108 esporas/mL y se incubaron a 30 °C durante 48 h. Al final del tiempo de fermentación, se añadieron 11 mL de agua destilada a cada biorreactor, se agitó y filtró con algodón. Después de esto el extracto se filtró con membranas Millipore de 0.45 µm para eliminar las impurezas, células o esporas de hongo. El sistema fue evaluado por triplicado. Concentración de extractos crudos La concentración de los extractos enzimáticos se realizó con membranas de diálisis con un tamaño de poro de 10 Kda (Sigma), sobre una charola con polietilenglicol 6000 a 4 ºC durante 24 h, girando la membrana continuamente para que estuviera en contacto toda la superficie con el polietilenglicol. Consumido el tiempo, los extractos concentrados fueron transferidos a tubos de 1.5 mL y se almacenaron en refrigeración para el análisis de la actividad enzimática y el contenido de proteínas. Actividad enzimática Las actividades celulasa y poligalcturonasa se determinaron después de la liberación de azúcares reductores con el método reportado por Somogy (1952) y modificado por Nelson (1994), En tubos de ensaye se prepararon las siguientes soluciones, para medir la actividad endo-β-1,4 glucanasa: blanco de muestra (200 µL de sustrato (Carboximetilcelulosa) más 50 µL de buffer de citratos 0.05M (pH=5); mezcla de reacción (200 µL de sustrato + 50 µL de extracto enzimático) y buffer citratos como control. Se midió por absorbancia a 660 nm. Para el ensayo de la actividad poligalacturonasa se usó como sustrato ácido poligalacturónico, Una unidad enzimática se considera como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µmol de azúcares reductores por minuto en condiciones de ensayo. Determinación de proteína extracelular El contenido de proteína soluble presente en el extracto dializado se evaluó de acuerdo al método de Bradford (1976), colocando en tubos de ensaye 500 µL de muestra, a los cuales se les agregó 500 µL de reactivo de Bradford. La mezcla se dejó reposar durante 20 min y se procedió a leer las muestras en un espectrofotómetro UV-Visible a 595 nm, usando albúmina sérica bovina como referencia.
  3. 3. 2010 Volumen 2, No. 3 Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM RESULTADOS En este trabajo, una cepa de Trichoderma fue cultiva bajo condiciones de SSF para la producción de un complejo enzimático, utilizando CM como fuente de carbono e inductores. En el cuadro 1 se presenta el contenido de polisacáridos presentes en la cáscara de mango var. Haden. Cuadro 1. Contenido de Polisacáridos presentes en cáscara de mango Componente Contenido (%) FDN 16.71±0.09 FDA 13.54±0.14 Lignina 1.34±0.21 Celulosa 9.81±0.12 FDN= Fibra detergente neutra FDA= Fibra detergente ácida Media de tres repeticiones ±error estándar Los valores de fibra obtenidos son similares a los reportados en estudio similar con mango obbo (16.36%) (Sánchez-Guzmán, 2007). En cuanto al contenido de celulosa (9.81±0.12) se mostró más bajo comparado con el reportado por Mejía-Giraldo et al (2007) de 14.21%, encontrado en cáscara y residuos de pulpa, lo que permite suponer el valor de celulosa mayor. Sin embargo, es posible apreciar que el contenido de fibra es alto, lo que hace que sea un material de excelentes condiciones para la obtención de metabolitos de interés. En el cuadro 2 se muestran los valores de actividad enzimática encontrados en el extracto crudo. Cuadro 2. Actividad celulasa y poligalacturonasa de extracto de SSF con Trichoderma T-II Enzima Expresión enzimática (U/L) Celulasa (endoglucanasa) 7552.53±82.14 Poligalacturonasa 1434.71±258.18 Media de tres repeticiones ±error estándar Los resultados obtenidos demuestran que el hongo Trichoderma T=II fue capaz de reproducirse, crecer y producir un complejo enzimático para degradar la pared celular de las cáscaras de mango. Estudios recientes han descrito la producción de complejos enzimáticos con actividad celulasa y poligalaturonasa, a partir de cáscara de palma (Rodríguez & Piñeros, 2007), aserrín (Campos et al., 2001), cáscaras de arroz (Agamez-Ramos et al., 2008), cáscara de manzana, mandarina y plátano (Elisashvili et al., 2008). Los valores expresados de actividad celulasa son superiores a los de actividad poligalacturonasa, debido a la composición de las cáscaras de mango, lo que induce al hongo a producir celulasas en mayor cantidad y de la misma forma inhibe a la producción de poligalacturonasas. Las condiciones empleadas en la fermentación son similares a las usadas por Latifian et al. (2007), quienes reportan que usando una cepa del género Trichoderma en SSF a pH 5, una humedad del 70 %, 30% de sólidos y a 30 °C se obtiene la mayor actividad enzimática. En un trabajo similar usando como sustrato cáscaras de mango adicionado con diferentes concentraciones de celobiosa en SSF, Couri et al (2000) encontraron que al adicionar 0.2 % de celobiosa se presentó un incremento en la actividad celulasa de 1400 a 2780 U/L, mientras que la actividad poligalacturonasa no presentó cambios significativos, después de 72 h de fermentación. Sukumaran et al (2009) reportó actividades endoglucanasas de 45,220 y 196,150 U/L utilizando T. reesei RUT C30 y Aspergillus niger MTCC 7956, respectivamente, ambas cultivadas en salvado de trigo. Faria et al (2008) reportaron valores de 1533 U/L, usando pasta de celulosa de eucalipto fermentado con Echinolatum Penicillium. En la producción de poligalacturonasa usando como inductor una mezcla de bagazo de naranja y fibra de trigo, Silva et al. (2005) reportan valores de 89 U/L, a una humedad inicial del 70% usando Penicillium viridicatum RFC3. En un análisis del efecto del tiempo de reacción sobre la expresión enzimática poligalacturonasa, los resultados se muestran en el cuadro 3.
  4. 4. 2010 Volumen 2, No. 3 Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM Cuadro 3. Efecto del tiempo de reacción en la expresión enzimática poligalacturonasa Tiempo (h) Act. Poligalacturonasa (U/L) 0 0 60 1434.71±258.18 120 379.08±121.50 180 234.82±25.31 Es posible apreciar que la mayor actividad poligalacturonasa es expresada a los 60 min de reacción, a medida que pasa el tiempo, la expresión enzimática sufre una caída hasta llegar a los 234.82 U/L, a los 180 min. Lo anterior puede ser ocasionado a la síntesis de celobiosa y glucosa ejercida por la acción de las celulasas presentes en el extracto, que provoca una inhibición en la actividad enzimática (Andriç et al., 2010). CONCLUSIONES Es posible producir un complejo enzimático celulolítico a partir del hongo Trichoderma II por SSF con alta actividad endoglucanasa y poligalacturonasa, utilizando como fuente de carbono e inductor cáscaras de mango, otorgándole de esta manera una alternativa más para el aprovechamiento integral de este fruto. AGRADECIMIENTOS En este presente trabajo se contó con el apoyo del Departamento de Investigación en Alimentos de la Universidad Autónoma de Coahuila. Gracias al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca de estudiante de postgrado a Buenrostro-Figueroa. REFERENCIAS Agamez-Ramos EJ, Zapata-Navarro RI, Oviedo-Zumaque LE y Barrera-Violeth JL. 2008. Evaluating solid fermentation processes and substrates for producing Trichoderma sp. spores. Rev. Colomb. Biotecnol. 10: 23-34. Aguilar CN, Gutiérrez-Sánchez G, Prado-Barragán L, Rodríguez-Herrera R, Martínez-Hernández JL y Contreras- Esquivel JC. 2008. Perspectives of Solid State Fermentation for Production of Food Enzymes. Amer. J. Biochem. Biotechnol. 4: 354-366. Ajila CM, Aalami M, Leelavathi K y Prasada-Rao UJS. 2010. Mango peel powder: A potential source of antioxidant and dietary fiber in macaroni preparations. Innovative Food Science and Emerging Technologies 11: 219- 224. doi:10.1016/j.ifset.2009.10.004. Ajila CM, Naidu KA, Bhat SG y Prasada-Rao UJS. 2007. Bioactive compounds and antioxidant potential of mango peel extract. Food Chemistry 105: 982-988. Doi:10.1016/j.foodchem.2007.04.052 Andriç P, Meyer AS, Jensen PA y Dam-Johansen. 2010. Reactor design for minimizing product inhibition during enzymatic lignocellulose hydrolysis: I. Significance and mechanism of cellobiose and glucose inhibition on cellulolytic enzymes. Biotechnology Advances. doi:10.1016/j.biotechadv.2010.01.003 Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. Brijwani K, Oberoi HS y Vadlani PV. 2010. Production of a cellulolytic enzyme system in mixed-culture solid-state fermentation of soybean hulls supplemented with wheat bran. Proc. Biochem. 45: 120-128. doi:10.1016/j.procbio.2009.08.015. Campos SM, González MA, Mas DS, Álvarez GL y Cabeza PD. 2001. Influencia de algunos parámetros en la fermentación en estado sólido del hongo Trichoderma viride. Tecnología Química XXI 1: 82-87. Couri S, da Costa-Terzi S, Saavedra-Pinto GA, Pereira-Freitas S y Augusto-da Costa AC. 2000. Hydrolitic enzyme production in solid state fermentation by Aspergillus niger 3T5B8. Proc. Biochem. 36: 255-261. de Siqueira FG, de Siqueira EG, Duque JPM, Luciano SMH, Andreaus J, Aparecida C, Batista LR y Ferreira FEX. 2010. The potential of agro-industrial residues for production of holocellulase from filamentous fungi. International Biodeterioration & Biodegradation 64: 20-26. doi:10.1016/j.ibiod.2009.10.002. Dos Santos MM, Souza da Rosa A, Dal Boit S, Mitchell DA y Krieger N. 2004. Thermal denaturation: is solid-state fermentation really a good technology for the production of enzymes?. Biores. Technol. 93: 261-268. Elisashvili V, Penninckx M, Kachklishvili E, Tsiklauri N, Metreveli E, Kharziani T y Kvesitadze G. 2008. Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Biores. Technol. 99: 457-462.
  5. 5. 2010 Volumen 2, No. 3 Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM Faria ML, Kolling D, Camassola M, Pinheiro DAJ y Pereira RL. 2008. Comparison of Pennicillium echinulatum and Trichoderma reesei cellulases in relation to their activity against various cellulosic substrates. Biores. Technol. 99: 1417-1424. Food and Agriculture Organization. FAO Statistical Database-Agriculture. Available from: http://faostat.fao.org. Accessed October 15, 2009. Jayani SA, Saxena S y Gupta R. 2005. Microbial pectinolitic enzymes: A review. Process Biochemistry 40: 2931- 2944. doi:10.1016/j.procbio.2005.03.026. Kim H, Moon JY, Kim H, Lee D, Cho M, Choi H, Kim YS, Mosaddik, A y Cho SK. 2009. Antioxidant and antiproliferative activities of mango (Mangifera indica L.) flesh and peel. Food Chemistry 121: 429-436. doi:10.1016/j.foodchem.2009.12.060 Larrauri JA, Ruperez P, Borroto B y Saura-Calixto F. 1996. Mango Peels as a New Tropical Fibre: Preparation and Characterization. LWT Food Sci Technol. 29: 729-733. Larrauri JA, Ruperez P y Saura-Calixto F. 1997. Mango peels fibres with antioxidant activity. Z. Lebensm. Unters. Forsch. A. 205: 39-42. Latifian M, Hamidi-Esfahani Z y Barzegar M. 2007. Evaluation of culture conditions for cellulase production by two Trichoderma reesei mutants under solid-state fermentation conditions. Biores. Technol. 98: 3634-3637. Madhukara K, Nand K, Raju NR y Srilatha HR. 1993. Ensilage of mango peel for methane generation. Process Biochem. 28: 119-123. Mahadevaswamy M y Venkataraman LV. 1990. Integrated utilization of fruit-processing wastes for biogas and fish production. Biol. Waste. 32: 243-251. Mejía-Giraldo LF, Martínez-Correa HA, Betancourt-Gutiérrez JE y Castrillón-Castaño CE. 2007. Aprovechamiento del residuo agroindustrial del mango común (Mangifera indica L.) en la obtención de azúcares fermentables. Ingeniería y Ciencia. 3(6): 41-62. Nelson TE. 1994. A photometric adaptation of the Somogyi method for the Determination of Glucose. J. Biol. Chem. 153: 375-381. Ovadon-Chacón SL y Waliszewski KN. 2005. Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos. Universidad y ciencia 21: 113-122. Pandey A, Soccol CR y Mitchell D. 2000. New developments in solid state fermentation: I-bioprocesses and products. Process Biochem. 35: 1153-69. Rodríguez GI y Piñeros CY. 2007. Production of enzymatic complex in solid state fermentation by Trichoderma sp. using palm oil empty fruit bunch (EFB) as substrate. Rev. Fac. Quím. Farmaceútica 14: 35-42. Rodríguez-Couto S y Sanromán MA. 2006. Application of solid-fermentation to food industry-A review. J. Food Eng. 76: 291-302. doi:10.1016/j.jfoodeng.2005.05.022. Sánchez-Guzmán B.S. 2005. Caracterización Fisicoquímica y Funcional de la Fibra Dietética del fruto del Níspero (Eriobotrya japonica) y de la Cáscara de Mango Obo (Mangifera indica L.). 76 pp. Silva D, Tokuioshi K, da Silva ME, da Silva R y Gomes E. 2005. Production of pectinase by solid-state fermentation with Penicillium viridicatum RFC3. Process Biochemistry 40: 2885-2889. doi:10.1016/j.procbio.2005.01.008. Singhania RR, Patel AK, Soccol CR y Pandey A. 2009. Recent advances in soli-state fermentation. Biochem. Eng. J. doi:20.1016/j.bej.2008.10.019. Somogyi M. 1952. Note on sugar determination. J. Biol. Chem. 195: 19-23. Sukumaran RV, Singhania RR, Mathew GM y Pandey A. 2009. Cellulase production using biomass feed stock and its application in lignocelluloses saccharification for bio-ethanol production. Renewable Energy. 34: 421-424. Uhlig H. 1998. Industrial enzymes and their applications. 2 ed. New York: Wiley-interscience. 454 p. Van Soest PJ., & Wine RH. 1968. Determination of lignin and cellulose in acid-detergent fiber with permanganate. Journal of the Association of Official Analytical Chemists International. 52: 780-785. Van Soest PJ. 1987. Development of a comprehensive system of food analysis and its application to forage. J. Anim. Sci. 26: 119-122. Viniegra-Gonzalez G, Favela-Torres E, Aguilar CN, Romero-Gomez SJ, Días-Godínez G y Augur C. 2003. Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems. Biochem. Eng. J. 13: 157-167.

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