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CICLO DE SEMINARIOS
“NUEVAS TÉCNICAS DE
MEJORAMIENTO GENÉTICO
EN PLANTAS”
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR
OLIGONUCLEÓTIDOS
(ODM)
Dvorak Montiel Condado, Ph. D
Profesor Tiempo Completo
Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
Mejoramiento Genético 1
• El hombre ha seleccionado
y modificado a las plantas.
• Más de 10,000 años.
• Fomento del avance de la
Ciencia y Tecnología.
Selección artificial
“Cross the best with the
best and hope for the best”
Ingeniería Genética
Reduce costos e
incrementa rendimientos
Mejoramiento Genético 2
Diversidad Genética
FENOTIPO
Pluralidad de características
GENOTIPO
Variabilidad genética
AMBIENTE
Diversidad Genética
favorecen
genotipos
la diversidad genética y la
con el ambiente, son las
Entre los factores que
interacción de estos
mutaciones.
• Mutaciones naturales o espontáneas, son las que se
producen en condiciones normales del desarrollo y del
ambiente. Evolución.
• Mutaciones inducidas, son las provocadas por un
agente exógeno (físicos, químicos y biológicos).
Mutación
Mutare (cambiar)
alteración o cambio en la
información genética
(genotipo) de un ser vivo
y que por lo tanto, va a
modificar las
características de éste;
además se puede heredar
a la descendencia.
La mutagénesis inducida se utiliza desde
mediados del siglo XX.
• Sustancias químicas o radiaciones.
• Cambios al AZAR.
• Diversas mejoras.
• Aprox. 3088 nuevas variedades
vegetales, 70% área de cultivo.
Mutaciones Inducidas
W.Murcott mandarin (left) and Tango (right).
Photo credit: T. Williams, UC Riverside.
Cambios semejantes a los que ocurren
naturalmente de manera espontánea.
No son considerados
Organismos Genéticamente Modificados (OGMs)
Nuevas Técnicas de
Mejoramiento Genético
Mutaciones
• Nucleasas Sitio Dirigidas (SDN)
• Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos (ODM)
Producen alteraciones
en la secuencia de
nucleótidos de un gen.
• Pérdidas
• Inserciones
• Sustituciones
1. Oligonucleotide – mediated mutagenesis.
2. Targeted nucleotide exchange.
3. Chimeraplasty.
4. Oligonucleotide-mediated gene repair.
5. Targeted gene repair.
6. Oligonucleotide-directed gene targeting.
7. Genoplasty.
8. Etc.
ODM – Otros nombres
En una proteína, pequeños cambios específicos en la
secuencia de aminoácidos dentro de un sitio crítico son,
en muchos casos, responsables de las diferencias en el
desempeño de la proteína y del fenotipo del organismo.
ODM -Principio
célula de oligonucleótidos
Es la introducción a la
homólogos a un ADN blanco y que inducen, en
nucleótidos sitio-específicos, sustituciones, inserciones
o deleciones a través de los Mecanismos de Reparación.
ODM - Definición
ODM - Usos
Es una técnica empleada para corregir o introducir cambios
específicos en sitios definidos del genoma.
ODM – Cambios
inducidos
1. Cambiar la secuencia de
aminoácidos de las
proteínas.
1. Suprimir la expresión de un
gen (stop codons or
frameshift mutations).
1. Modificar la expresión del
gen (por cambios en las
secuencias promotoras).
ODM – Otros cambios
• Inhibir la expresión de
genes no deseados.
• Aumentar la expresión de
genes benéficos.
• Producir cambios en las
proteínas para hacerlas más
eficientes y efectivas.
Los oligonucleótidos son cadenas sencillas (de secuencia
conocida) de ADN/ARN, de aprox. 20-100 nucleótidos
sintetizados químicamente.
Son diseñados con paridad a una secuencia blanco dentro del
genoma de la planta pero con la intención de generar desfase
en una o mas bases.
ODM - Oligonucleótidos
1. ADN, cadena sencilla con un solo desfase para la secuencia blanco.
2. Quimeras RNA/DNA o DNA/DNA, con baja eficiencia y
reproducibilidad.
3. Oligonucleótidos que forman triple hélice (TFOs), tienen una
asociación mas estable con el ADN dúplex.
4. ARN, se están estudiando.
ODM – Tipos de
oligonucleótidos
Mecanismos de introducción a las plantas:
 Químicos (mediados por polyethylene glycol)
 Electroporación (electropermeabilización)
 Lipofección (vesículas de lípidos catiónicos)
 Biobalística (disparos de partículas de oro recubiertas del
oligonucleótidos)
X Transformación mediada por Agrobacterium
ODM – Introducción de
oligonucleótidos
ODM – Biobalística
ODM – Integración de
oligos de ADN
• Algunas modificaciones
incrementan la capacidad
de union y previenen la
degradacion.
ODM – Integración de
oligos quiméricos
ARN-rojo
ADN-morado
• Se forma una estructura
de Bucle
• El mismatch se resuelve
por un proceso de
Reparación del ADN
ODM – Destino del
oligonucleótido
• Oligos de 20-30 nt son
usados eficientemente.
• Oligos de 80-100 nt
generalmente son tóxicos
para las células.
• Después de la
incorporación del cambio,
el oligo es degradado.
ODM – Mecanismos de
reparación del ADN
El oligonucleótido NO se integra al genoma de las células de la
planta hasta que se INDUCE el Mecanismo de Reparación que
cambia la secuencia endógena por la secuencia deseada.
ODM – Mismatch repair
• Altamente conservado.
• Mecanismo de reparacion
post-replicacion.
• Desfase de bases y
tambien inserciones y
deleciones.
ODM – Nucleotide
excision repair
• Muy versátil.
• Muy complejo.
• Elimina lesiones del
genoma y tambien de
genes
transcripcionalmente
muy activos.
ODM – Aplicaciones
• Microorganismo: Bacterias y
Levaduras.
• Mamíferos: Células animales
y, en un futuro, en la
ganadería y terapia génica.
• Plantas: Maíz, arroz,
tabaco, trigo, etc
Plantas resistentes a la acción
de un herbicida.
ODM –Plantas
• Esta técnica puede aplicarse a cualquier planta si la secuencia,
incluyendo el efecto de la modificación, es CONOCIDA.
• En contraste con otros métodos NO se inserta ADN, por lo que
NO hay integración al azar, NO hay inserciones múltiples o
efectos debidos a la inserción en lugares no deseados.
• El gene de interés se mantiene en su contexto cromosomal
normal, lo que reduce las oportunidades de alterar su
expresión normal, a menos que esa sea la intención.
ODM –Plantas
• Se ha observado baja frecuencia de mutación inducida (10-4).
• A nivel molecular son indistinguibles de las plantas obtenidas
por selección natural.
• Es difícil realizar la selección de las mutaciones deseadas.
• Las técnicas de secuenciación de alto rendimiento son una
opción para la selección.
ODM – Ventajas
• No emplea vectores, con lo que se
elimina el riesgo de mutagenesis
asociada.
• Dado que actúa en genes
específicos, no se alterarían otros.
• Podría NO generar otros cambios
en el genoma, como ocurre con
los procesos naturales o
inducidos.
ODM – Limitantes
• Diseño del oligonucleótido.
• La secuencia blanco.
• Estructura de la cromatina.
• Componentes de la
maquinaria de reparación.
• Etc.
Influyen en el cambio de la
secuencia del ADN blanco
(1-60%)
ODM – Limitantes
 DETECCIÓN
Significa que es posible determinar la existencia de un cambio en
el material genético de un organismo.
IDENTIFICACIÓN
Significa que es posible establecer la modificación genética
intencionalmente introducida por una nueva técnica.
ODM – Nuevas
características
• Maíz, trigo, canola, y plátano.
• Tolerancia a un amplio rango de
herbicidas (HT)
• HT empleado para la selección.
En general, mutaciones que
AFECTAN A UN GEN ENDÓGENO
en especifico.
ODM – Nuevas
características
• Posibles nuevas propiedades:
• Alargar la vida de anaquel
• Resistencia a plagas
• Aumentar el rendimiento
• Alterar el contenido de ácidos
grasos y aminoácidos.
• Tolerancia el estrés abiótico.
• Mecanismos de defensa contra
patógenos.
ODM – Consideraciones
• Los organismos desarrollados, en muchos casos, podrian no
ser distinguibles de aquellos que se obtuvieron por tecnicas
de mutacion “tradicional” o de los organismos silvestres.
• La deteccion y trazabilidad son puntos clave en los sistemas
regulatorios de los OGMs, pero…la tecnica de ODM no
requiere de la introduccion de secuencias de ADN de otras
especies al genoma natural.
(Breyer D, 2009)
ODM – Consideraciones
• Muchos expertos de diferentes paises coinciden en que estos
materiales deben etiquetarse como NO-GM (Genéticamente
Modificados).
• Esta técnica requiere menos tiempo de implementación y
análisis, en comparacion con otras, y se espera se
comercialice mas rápido dado que es NO-TRANSGÉNICA y
podría evitar restricciones regulatorias.
(Lusser M, 2013)
ODM – Impacto
(Lusser M, 2012)
ODM – Instituciones
Líderes
(Lusser M, 2012)
ODM – Patentes
(Lusser M, 2012)
ODM – ¿OGMs?
Según el Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la
Biotecnología del Convenio sobre Diversidad Biológica (2000) la
Biotecnología Moderna puede definirse como la aplicación de:
• Técnicas in vitro de ácido nucleíco; incluídos el ácido
desorribonucleÍco (ADN) recombinante y la inyección directa
de ácido nucleíco en células u orgánulos,
• La fusión de células mas allá de la familia taxonómica; que
superan las barreras fisiológicas naturales de la
reproducción o de la recombinación y que no son técnicas
utilizadas en la reproducción y selección tradicional.
ODM – ¿OGMs?
Organismo Genéticamente Modificado (OGM/OVM): cualquier
organismo vivo que posea una combinación nueva de material
genético que se haya obtenido mediante la aplicación de la
biotecnología moderna.
ODM – Sugerencias
• Los organismos obtenidos por Mutagenesis Dirigida por
Oligonucleótidos (ODM), al no emplear técnicas de la
Biotecnología Moderna, podrían ser considerados como
NO Geneticamente Modificados.
• Pero se sugiere que, independientemente de la técnica de
mejoramiento genético empleada, las nuevas variedades
de plantas sean evaluados de acuerdo a sus nuevas
características y a el producto final que se genere.
(Evaluación/Análisis de Riesgo).
ODM – Sugerencias
• Que para las instituciones públicas de nuestro país los
permisos de experimentación sean menos restrictivos.
• Se incentiven y apoyen económicamente los proyectos que
empleen Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos.
• Se dé prioridad a los productos de consumo nacional y de
los cuáles no tenemos autonomía alimentaria.
MUCHAS GRACIAS POR
SU ATENCION
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  • 1. CICLO DE SEMINARIOS “NUEVAS TÉCNICAS DE MEJORAMIENTO GENÉTICO EN PLANTAS”
  • 2. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR OLIGONUCLEÓTIDOS (ODM) Dvorak Montiel Condado, Ph. D Profesor Tiempo Completo Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
  • 3. Mejoramiento Genético 1 • El hombre ha seleccionado y modificado a las plantas. • Más de 10,000 años. • Fomento del avance de la Ciencia y Tecnología.
  • 4. Selección artificial “Cross the best with the best and hope for the best” Ingeniería Genética Reduce costos e incrementa rendimientos Mejoramiento Genético 2
  • 5. Diversidad Genética FENOTIPO Pluralidad de características GENOTIPO Variabilidad genética AMBIENTE
  • 6. Diversidad Genética favorecen genotipos la diversidad genética y la con el ambiente, son las Entre los factores que interacción de estos mutaciones. • Mutaciones naturales o espontáneas, son las que se producen en condiciones normales del desarrollo y del ambiente. Evolución. • Mutaciones inducidas, son las provocadas por un agente exógeno (físicos, químicos y biológicos).
  • 7. Mutación Mutare (cambiar) alteración o cambio en la información genética (genotipo) de un ser vivo y que por lo tanto, va a modificar las características de éste; además se puede heredar a la descendencia.
  • 8. La mutagénesis inducida se utiliza desde mediados del siglo XX. • Sustancias químicas o radiaciones. • Cambios al AZAR. • Diversas mejoras. • Aprox. 3088 nuevas variedades vegetales, 70% área de cultivo. Mutaciones Inducidas W.Murcott mandarin (left) and Tango (right). Photo credit: T. Williams, UC Riverside. Cambios semejantes a los que ocurren naturalmente de manera espontánea. No son considerados Organismos Genéticamente Modificados (OGMs)
  • 9. Nuevas Técnicas de Mejoramiento Genético Mutaciones • Nucleasas Sitio Dirigidas (SDN) • Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos (ODM) Producen alteraciones en la secuencia de nucleótidos de un gen. • Pérdidas • Inserciones • Sustituciones
  • 10. 1. Oligonucleotide – mediated mutagenesis. 2. Targeted nucleotide exchange. 3. Chimeraplasty. 4. Oligonucleotide-mediated gene repair. 5. Targeted gene repair. 6. Oligonucleotide-directed gene targeting. 7. Genoplasty. 8. Etc. ODM – Otros nombres
  • 11. En una proteína, pequeños cambios específicos en la secuencia de aminoácidos dentro de un sitio crítico son, en muchos casos, responsables de las diferencias en el desempeño de la proteína y del fenotipo del organismo. ODM -Principio
  • 12. célula de oligonucleótidos Es la introducción a la homólogos a un ADN blanco y que inducen, en nucleótidos sitio-específicos, sustituciones, inserciones o deleciones a través de los Mecanismos de Reparación. ODM - Definición
  • 13. ODM - Usos Es una técnica empleada para corregir o introducir cambios específicos en sitios definidos del genoma.
  • 14. ODM – Cambios inducidos 1. Cambiar la secuencia de aminoácidos de las proteínas. 1. Suprimir la expresión de un gen (stop codons or frameshift mutations). 1. Modificar la expresión del gen (por cambios en las secuencias promotoras).
  • 15. ODM – Otros cambios • Inhibir la expresión de genes no deseados. • Aumentar la expresión de genes benéficos. • Producir cambios en las proteínas para hacerlas más eficientes y efectivas.
  • 16. Los oligonucleótidos son cadenas sencillas (de secuencia conocida) de ADN/ARN, de aprox. 20-100 nucleótidos sintetizados químicamente. Son diseñados con paridad a una secuencia blanco dentro del genoma de la planta pero con la intención de generar desfase en una o mas bases. ODM - Oligonucleótidos
  • 17. 1. ADN, cadena sencilla con un solo desfase para la secuencia blanco. 2. Quimeras RNA/DNA o DNA/DNA, con baja eficiencia y reproducibilidad. 3. Oligonucleótidos que forman triple hélice (TFOs), tienen una asociación mas estable con el ADN dúplex. 4. ARN, se están estudiando. ODM – Tipos de oligonucleótidos
  • 18. Mecanismos de introducción a las plantas:  Químicos (mediados por polyethylene glycol)  Electroporación (electropermeabilización)  Lipofección (vesículas de lípidos catiónicos)  Biobalística (disparos de partículas de oro recubiertas del oligonucleótidos) X Transformación mediada por Agrobacterium ODM – Introducción de oligonucleótidos
  • 20. ODM – Integración de oligos de ADN • Algunas modificaciones incrementan la capacidad de union y previenen la degradacion.
  • 21. ODM – Integración de oligos quiméricos ARN-rojo ADN-morado • Se forma una estructura de Bucle • El mismatch se resuelve por un proceso de Reparación del ADN
  • 22. ODM – Destino del oligonucleótido • Oligos de 20-30 nt son usados eficientemente. • Oligos de 80-100 nt generalmente son tóxicos para las células. • Después de la incorporación del cambio, el oligo es degradado.
  • 23. ODM – Mecanismos de reparación del ADN El oligonucleótido NO se integra al genoma de las células de la planta hasta que se INDUCE el Mecanismo de Reparación que cambia la secuencia endógena por la secuencia deseada.
  • 24. ODM – Mismatch repair • Altamente conservado. • Mecanismo de reparacion post-replicacion. • Desfase de bases y tambien inserciones y deleciones.
  • 25. ODM – Nucleotide excision repair • Muy versátil. • Muy complejo. • Elimina lesiones del genoma y tambien de genes transcripcionalmente muy activos.
  • 26. ODM – Aplicaciones • Microorganismo: Bacterias y Levaduras. • Mamíferos: Células animales y, en un futuro, en la ganadería y terapia génica. • Plantas: Maíz, arroz, tabaco, trigo, etc Plantas resistentes a la acción de un herbicida.
  • 27. ODM –Plantas • Esta técnica puede aplicarse a cualquier planta si la secuencia, incluyendo el efecto de la modificación, es CONOCIDA. • En contraste con otros métodos NO se inserta ADN, por lo que NO hay integración al azar, NO hay inserciones múltiples o efectos debidos a la inserción en lugares no deseados. • El gene de interés se mantiene en su contexto cromosomal normal, lo que reduce las oportunidades de alterar su expresión normal, a menos que esa sea la intención.
  • 28. ODM –Plantas • Se ha observado baja frecuencia de mutación inducida (10-4). • A nivel molecular son indistinguibles de las plantas obtenidas por selección natural. • Es difícil realizar la selección de las mutaciones deseadas. • Las técnicas de secuenciación de alto rendimiento son una opción para la selección.
  • 29. ODM – Ventajas • No emplea vectores, con lo que se elimina el riesgo de mutagenesis asociada. • Dado que actúa en genes específicos, no se alterarían otros. • Podría NO generar otros cambios en el genoma, como ocurre con los procesos naturales o inducidos.
  • 30. ODM – Limitantes • Diseño del oligonucleótido. • La secuencia blanco. • Estructura de la cromatina. • Componentes de la maquinaria de reparación. • Etc. Influyen en el cambio de la secuencia del ADN blanco (1-60%)
  • 31. ODM – Limitantes  DETECCIÓN Significa que es posible determinar la existencia de un cambio en el material genético de un organismo. IDENTIFICACIÓN Significa que es posible establecer la modificación genética intencionalmente introducida por una nueva técnica.
  • 32. ODM – Nuevas características • Maíz, trigo, canola, y plátano. • Tolerancia a un amplio rango de herbicidas (HT) • HT empleado para la selección. En general, mutaciones que AFECTAN A UN GEN ENDÓGENO en especifico.
  • 33. ODM – Nuevas características • Posibles nuevas propiedades: • Alargar la vida de anaquel • Resistencia a plagas • Aumentar el rendimiento • Alterar el contenido de ácidos grasos y aminoácidos. • Tolerancia el estrés abiótico. • Mecanismos de defensa contra patógenos.
  • 34. ODM – Consideraciones • Los organismos desarrollados, en muchos casos, podrian no ser distinguibles de aquellos que se obtuvieron por tecnicas de mutacion “tradicional” o de los organismos silvestres. • La deteccion y trazabilidad son puntos clave en los sistemas regulatorios de los OGMs, pero…la tecnica de ODM no requiere de la introduccion de secuencias de ADN de otras especies al genoma natural. (Breyer D, 2009)
  • 35. ODM – Consideraciones • Muchos expertos de diferentes paises coinciden en que estos materiales deben etiquetarse como NO-GM (Genéticamente Modificados). • Esta técnica requiere menos tiempo de implementación y análisis, en comparacion con otras, y se espera se comercialice mas rápido dado que es NO-TRANSGÉNICA y podría evitar restricciones regulatorias. (Lusser M, 2013)
  • 39. ODM – ¿OGMs? Según el Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología del Convenio sobre Diversidad Biológica (2000) la Biotecnología Moderna puede definirse como la aplicación de: • Técnicas in vitro de ácido nucleíco; incluídos el ácido desorribonucleÍco (ADN) recombinante y la inyección directa de ácido nucleíco en células u orgánulos, • La fusión de células mas allá de la familia taxonómica; que superan las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y selección tradicional.
  • 40. ODM – ¿OGMs? Organismo Genéticamente Modificado (OGM/OVM): cualquier organismo vivo que posea una combinación nueva de material genético que se haya obtenido mediante la aplicación de la biotecnología moderna.
  • 41. ODM – Sugerencias • Los organismos obtenidos por Mutagenesis Dirigida por Oligonucleótidos (ODM), al no emplear técnicas de la Biotecnología Moderna, podrían ser considerados como NO Geneticamente Modificados. • Pero se sugiere que, independientemente de la técnica de mejoramiento genético empleada, las nuevas variedades de plantas sean evaluados de acuerdo a sus nuevas características y a el producto final que se genere. (Evaluación/Análisis de Riesgo).
  • 42. ODM – Sugerencias • Que para las instituciones públicas de nuestro país los permisos de experimentación sean menos restrictivos. • Se incentiven y apoyen económicamente los proyectos que empleen Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos. • Se dé prioridad a los productos de consumo nacional y de los cuáles no tenemos autonomía alimentaria.