Progetto: "Alimentazione e salute" Micotossine

1. - funghi in senso stretto MICOTOSSINA = tossina prodotta da funghi - muffe - lieviti La micotossina più nota è la PENICILLINA scoperta da Alexander Fleming nel 1928 Altre micotossine note sono le AMANITINE e le MUSCARINE

2. MICOTOSSINE DI INTERESSE ALIMENTARE Sono tossine prodotte da muffe che costituiscono un’importante rischio per la salute umana Sono state causa di vere e proprie epidemie: sono note ben 1759 casi di ERGOTISMO EPIDEMICO tra il 1400 ed 1500 Questa malattia , nota nel medioevo con il nome di “fuoco di Sant’Antonio”, “fuoco sacro”, “male degli ardenti” o “Ignis sacer” era caratterizzata da convulsioni, dolori lancinanti alle estremità, vaste lesioni cutanee accompagnate da febbre alta e senso di bruciore insopportabile, cancrena e morte ” I mendicanti” Peter Brugel il Vecchio (ca. 1525-1569)

3. MICOTOSSINE DI INTERESSE ALIMENTARE La patologia era causata dall’ingestione degli alcaloidi prodotti dal ”Ergot”, nome comune di un fungo ( Claviceps purpurea ) che infesta principalmente la segale formando degli sclerozi simili a cornetti o clavette che conferiscono alla pianta infetta il nome comune di " segale cornuta " Tra gli alcaloidi prodotti vi è anche l’acido lisergico (LSD) . Gli effetti principali sono la vasocostrizione (problemi circolatori) e l’interazione col sistema nervoso centrale (allucinazioni). E’ stato ipotizzato che episodi di stregoneria (compresa la nota caccia alle streghe di Salem) non fossero altro che intossicazioni da ergot E’ stato anche ipotizzato che le micotossicosi siano state la causa di alcune pestilenze del medioevo

4. MICOTOSSINE DI INTERESSE ALIMENTARE Da: Piva C. et al, M icotossine, un tema globale , Rapporti ISTISAN 05/42, 2005 Le micotossine sono metaboliti secondari, ovvero non sono coinvolti nella normale metabolismo di crescita del fungo, e spesso hanno una struttura chimica insolita

5. MICOTOSSINE DI INTERESSE ALIMENTARE

6. AFLATOSSINE Sono prodotte da molte specie di muffe appartenenti alla classe degli ascomiceti, in particolar modo alla famiglia Aspergillus ( A. flavus , A. parasiticus ) in grado di crescere su semi in presenza di umidità superiore al 10% (con ventilazione) e temperature comprese tra 24-35°C A. flavus sul mais A. flavus sulle arachidi A. flavus su una pesca

7. AFLATOSSINE Sono state scoperte in Inghilterra circa 40 anni fa studiando il mangime a base di arachidi che causò una terribile moria negli allevamenti di tacchini uccidendo circa centomila capi ed originando un disastro economico L’ultima epidemia umana accertata risale al 2004 in Kenya con 317 casi (125 decessi, di cui il 51% con età < 14 anni). La causa venne identificata nel consumo di mais contaminato con 20 ppm (20 mg/kg) di aflatossina B1

8. AFLATOSSINE

9. AFLATOSSINE SECONDO ALCUNI AUTORI, L’AFLATOSSINA B1 È IL PIÙ POTENTE EPATOCARCINOGENO ATTUALMENTE NOTO Dopo essere state ingerite, le aflatossine vengono metabolizzate ad epossido che è il vero agente tossico potendosi legare:  alla guanina del DNA, determinando mutazioni  alla lisina, bloccando la sintesi proteica ed avendo quindi un effetto citotossico Le aflatossine sono in grado di attivare un oncogene dominante e di bloccare un gene tumore-soppressore AFLATOSSICOSI ACUTA  i ngestione di 2–6 mg/giorno di aflatossine per un mese può causare epatite acuta e morte CRONICA  epatocarcinoma, probabile immunosoppressione, probabili interferenze nutrizionali (blocco della crescita)

10. AFLATOSSINE Le aflatossine sono fortemente lipofile e passano negli oli prodotti con semi contaminati quali ad esempio olio di semi di mais, di arachidi, nonché burro di arachidi, ed anche olio di oliva Positività (sotto il limite di legge) in 3 campioni di olio vergine commerciale su 15 analizzati

11. AFLATOSSINE Da: Cavallucci C. et al, Valutazione di alcuni parametri correlati allo sviluppo della micotossina , Rapporti ISTISAN 05/42, 2005

12. AFLATOSSINE La lotta alla contaminazione da aflatossine si attua principalmente con la prevenzione Metodi FISICI di prevenzione:  pulizia/disinfezione dei locali di stoccaggio  verifica della qualità (granella deteriorata < 6%)  temperatura (refrigerazione 15-18 °C)  umidità (essiccazione entro 48h sino ad un tasso di umidità del 12-14%)  aerazione dell'ambiente (ventilazione forzata, gas inerti) Metodi CHIMICI di prevenzione: una trentina di sostanze consentite in grado di bloccare/attenuare la crescita di Aspergillu s, tra cui  acido formico  acido propionico  acido iso-butirrico  acido sorbico

13. AFLATOSSINE Gli alimenti a rischio sono mais, arachidi, semi oleosi, frutta secca e loro derivati Un rischio “indiretto” per l’uomo è dato dal cosiddetto “carry-over”, ovvero dal passaggio delle aflatossine, sotto forma di aflatossina M, nel latte di mucche alimentate con mangimi contaminati Il Regolamento CEE 683/2004 prevede una riduzione dei limiti massimi negli alimenti destinati ai lattanti ed alla prima infanzia:  0.1 µg/kg di aflatossina B1 per prodotti a base di cereali  0.025 µg/kg per il latte Il Regolamento (CE) 2174/2003 , che modifica il Regolamento (CE) 466/2001 , prevede I seguenti limiti massimi:  2 µg/kg di aflatossina B1  4 µg/kg di aflatossine totali (B1+B2+G1+G2) per arachidi, frutta secca a guscio e non, cereali, e relativi prodotti di trasformazione per uso umano diretto  0.05 µg/kg per il latte LEGISLAZIONE VIGENTE

14. AFLATOSSINE E’ possibile ridurre la quantità di aflatossine mediante:  diluizione degli alimenti contaminati  trattamenti fisici quali calore, microonde, raggi gamma, raggi X, luce ultravioletta  aggiunta ai mangimi di alluminosilicati, zeoliti, bentonite, estratti da pareti cellulari di lieviti, carboni vegetali purificati, che esplicano un’azione “sequestrante” sulle micotossine e riducono il passaggio nei liquidi organici  ammoniazione (trattamento con ammoniaca), che porterebbe ad una decomposizione del 95-98% dell'AFB1

15. ANALISI DELLE AFLATOSSINE Metodi immunoenzimatici (ELISA = E nzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ) ELISA competitivo

16. ANALISI DELLE AFLATOSSINE Metodi cromatografici (HPLC = High -Performance Liquid Chromatography ) 1) Preparazione del campione mediante SPE:  silica  immunoaffinità Dal sito della R-Biopharm Rhône Ltd

17. ANALISI DELLE AFLATOSSINE 2) Separazione cromatografica e rivelazione mediante  fluorescenza  spettrometria di massa

18. ANALISI DELLE AFLATOSSINE Generalmente si tende ad utilizzare il metodo ELISA per uno screening, e l’HPLC per la conferma e quantificazione dei risultati HPLC PRO CONTRO Sensibile Costoso Molto accurato Strumentazione complessa Molto specifico Personale specializzato ELISA PRO CONTRO Sensibile Poco accurato Economico Poco specifico Di facile utilizzo

19. OCRATOSSINE Sono prodotte da molte specie di muffe appartenenti alla classe degli ascomiceti, in particolar modo alla famiglia Aspergillus ( A. ochraceus , A. niger, A. carbonarius ) e Penicillium ( P. viridicatum , P. verrucosum ) in grado di crescere su semi e frutta soprattutto durante il loro stoccaggio in presenza di umidità (le condizioni ottimali di crescita sono a tutt’oggi poco note) A. niger su una cipolla P. viridicatum sul pane A. carbonarius sull’uva

20. OCRATOSSINE Sono state scoperte in Sud Africa nel 1965 in uno studio di screening dei metaboliti fungini ed è stata rinvenuta alcuni anni dopo negli Stati Uniti come contaminante naturale del mais E’ stato ipotizzato che l’ocratossina A sia la causa della cosiddetta nefropatia endemica Balcanica, consistente in una nefropatia cronica progressiva e tumori del tratto urinario che colpisce le popolazioni balcaniche delle aree adiacenti al Danubio. In tali popolazioni è stata comunemente riscontrata una contaminazione alimentare da ocratossina A, nonché la sua presenza nel siero

21. OCRATOSSINE L’azione tossica dell’ocratossina A si esplica su diversi processi enzimatici:  metabolismo della fenilalanina  produzione di radicali attivi dell’ossigeno (ROS) e perossidazione lipidica con modificazioni della permeabilità di membrana e conseguente necrosi cellulare  alterazione dell’attività mitocondriale, con alterazione nella produzione di ATP Dopo assorbimento gastrico, l’ocratossina A si lega fortemente all’albumina e ciò ne impedisce il mtabolismo e l’escrezione OCRATOSSICOSI ACUTA  i ngestione di 2–4 mg/giorno di ocratossine determina decremento ponderale e ipofunzionalità renale, fino ad una grave insufficienza conseguente alla progressiva nefrosclerosi CRONICA  nefropatia progressiva, tumori dell’apparato urinario, probabile immunosoppressione, interferenze nutrizionali (blocco della crescita)

22. OCRATOSSINE Anche per le ocratossine esiste il problema del passaggio nel latte materno Nel 1991, uno studio dell’ISS su 50 madri italiane che allattavano al seno, ha mostrato nel latte la presenza in 9 casi (18%) di livelli di ocratossina A compresi tra 1.7 e 6.6 ng/ml Nel 1995, uno studio su 113 madri della Sierra Leone ha mostrato la presenza in 103 casi (92%) di livelli elevati di ocratossina A ed anche di aflatossine I lattanti della Sierra Leone assumono attraverso il latte materno livelli di ocratossina A (ed anche aflatossine) che in alcuni casi superano di molto quelli consentiti in Europa per l’alimentazione animale Micco C et al: Contamination of human milk with ochratoxin A . IARC Sci. Publ. 115:105-108, 1991 Jonsyn FE et al: Ochratoxin A and aflatoxins in breast milk samples from Sierra Leone . Mycopathologia, 131:121-126, 1995 Gli autori concludono con l’amara considerazione che

23. OCRATOSSINE Gli alimenti a rischio sono cereali, caffè, cacao, frutta secca e fresca (in particolar modo l’uva) Il rischio per l’uomo è dato anche dalla presenza dell’ocratossina A negli ambienti con muffa (case, depositi, ecc) Un caso di intossicazione acuta è stato registrato in Italia in una coppia di agricoltori dopo aver lavorato per 8 ore in un granaio rimasto chiuso per 2 anni Ipotesi suggestive suggeriscono che intossicazioni acute da ocratossina A siano responsabili delle morti improvvise di archeologi dopo l’apertura delle tombe egizie Il Regolamento CEE 123/2005 , che modifica il Regolamento (CE) 466/2001 , prevede i seguenti limiti massimi:  da 2 µg/kg (mosto d’uva e vino) a 10 µg/kg (uva passita e caffè solubile)  0.5 µg/kg per tutti gli alimenti per lattanti e bambini LEGISLAZIONE VIGENTE

24. ANALISI DELLE OCRATOSSINE Metodi immunoenzimatici (ELISA) per screening Metodi cromatografici (HPLC) per conferma Estrazione del campione L/L con solventi apolari e purificazione mediante SPE silica o immunoaffinità

25. PATULINA E’ prodotta da alcune specie di muffe appartenenti Penicillium ( P. expansus , P. patulum  P. griseofulvum, P. claviforme ) che crescono prevalentemente sulla frutta (la cosidetta muffa blu ) P. expansum su una pera P. expansum su un limone P. expansum sull’uva P. expansum su una mela P. Claviforme (foto: M.Ulloa)

26. PATULINA Sono state scoperte nei primi anni ‘40 durante ricerche per l’individuazione di nuovi antibiotici e fu testata come spray nasale per il raffreddore comune e come unguento dermatologico per le infezioni micotiche e batteriche Dopo una moria di mucche in Giappone nel 1954 a causa di mangime contaminato da patulina, fu dimostrata la tossicità anche su vegetali ed animali pregiudicando il suo utilizzo come antibiotico Non è una tossina particolarmente potente ma alcuni studi hanno mostrato effetti genotossici Durante gli anni ‘60 la patulina fu riclassificata come micotossina Nel 1986 la IARC (International Agency for Research on Cancer) ha classificato la patulina come carcinogeno di gruppo 3 (dati insufficienti per la sua classificazione) L’OMS ha inserito la patulina tra i contaminanti alimentari prioritari (insieme ad aflatossine, ocratossine e fumonisine) stabilendo un limite di assunzione di 400 µg/kg/die

27. PATULINA Nonostante la patulina possa essere rinvenuta su diverse tipologie di frutta, essa è regolarmente presente nei succhi di mela e uva (alla base di quasi tutti i succhi di frutta) Paradossalmente non è presente nel sidro e nel vino, dato che viene degradata dai processi fermentativi La patulina è termostabile e può quindi ritrovarsi anche nelle confetture La patulina viene rapidamente degradata dall’anidride solforosa, utilizzata come stabilizzante nell’industria alimentare Il Regolamento (CE) 1425/2003 , che modifica il Regolamento (CE) 466/2001 , aggiungendo i limiti massimi per la patulina:  50 µg/kg per succhi di frutta e bevande “spiritose”  25 µg/kg per prodotti contenenti mele allo stato solido  10 µg/kg per tutti gli alimenti per lattanti e bambini) LEGISLAZIONE VIGENTE

28. ANALISI DELLA PATULINA Metodi cromatografici (HPLC) per conferma Estrazione del campione L/L con acetato di etile

29. MICOTOSSINE DI Fusarium spp. Fusarium costituisce un vasto genere di funghi filamentosi quasi ubiquitari su terreni ed in associazione con piante. Sono produttori di micotossine molto differenti tra loro denominate “fusarine”:  Fumonisine  Zearalenone  Tricoteceni (Deossinivalenolo o “vomitossina”, Tossina T-2 ed HT-2) Fusarium spp. (al microscopio) Spora di Fusarium spp. (al microscopio)

30. FUMONISINE Sono prodotte da F. monoliforme = Gibberella fujikuroi  F. verticillioides , F. proliferatum, F. nygamai, che crescono prevalentemente su mais ed altri cereali (grano, sorgo, riso, miglio) con temperature comprese tra 5-40°C ed umidità > 20% F. verticilioides su frumento F. verticilioides su mais

31. FUMONISINE Scoperte nel 1988 durante studi per individuare le cause della leucoencefalomalacia equina in animali nutriti con mangime contaminato da F. moniliformes ( verticillioides) E’ stato ipotizzato che le fumonisine possano essere la causa della maggiore incidenza di tumore all’esofago nelle popolazioni italiane del nord-est in cui è stata riscontrata un’elevata concentrazione fumonisina B1 nella farina di mais

32. FUMONISINE Le fumonisine intereferiscono con il metabolismo dei sfingolipidi, importanti lipidi della membrana cellulare coinvolti anche nei processi di proliferazione cellulare, inibendo l’enzima ceramide sintasi LEGISLAZIONE VIGENTE Raccomandazione 2006/576/CE che pone i seguenti valori di riferimento:  5 mg/kg (suini, equini, conigli, animali da compagnia)  10 mg/kg (pesci)  20 mg/kg (polli, vitelli, agnelli e capretti)  50 mg/kg (ruminanti adulti e visoni)  60 mg/kg per granturco e derivati Mangimi

33. FUMONISINE LEGISLAZIONE VIGENTE Regolamento CE/1881/2006 che pone I seguenti valori di riferimento:  2000 µg/kg (mais non trasformato)  1000 µg/kg (mais trasformato)  400 µg/kg (alimenti a base di mais per consumo umano diretto)  200 µg/kg (alimenti per lattanti e bambini) Alimenti

34. ANALISI DELLE FUMONISINE Metodi cromatografici (HPLC) per conferma Estrazione del campione L/L e purificazione mediante SPE C18/immunoaffinità Metodi immunoenzimatici (ELISA) per screening

35. ZEARALENONE Prodotto da F. graminearum = Gibberella zeae che cresce prevalentemente su mais ed altri cereali (grano, sorgo, riso, miglio) con temperature comprese tra 18-30°C ed umidità > 20% F. graminearum su frumento F. graminearum su mais

36. ZEARALENONE Scoperte nella metà degli anni ‘60, fu inizialmente chiamata “tossina F-2” La sua struttura è sufficientemente somigliante a quella del 17ß-estradiolo, il principale ormone ovarico, da consentire il legame dello zearalenone ai recettori estrogenici, intereferendo con le potenzialità riproduttive, soprattutto nei suini

37. ZEARALENONE Negli anni ‘70 lo zearalenone è stato testato come ormone per il trattamento dei sintomi post-menopausali e come contraccettivo orale nell’uomo, così come anabolizzante negli ovini e bovini Negli anni ‘80 è stato ipotizzato che la dieta con alimenti contaminati da zearalenone fosse la causa di menarca precoce nel Porto Rico La tossicità dello zearalenone è molto limitata (LD 50 10 g/kg nel ratto e 5 g/kg nella cavia) anche se l’attività biologica è estremamente potente: nei suini, dosi di 1-10 mg/kg sono in grado di determinare pseudogravidanze nelle femmine e diminuzioni della libido, atrofia dei testicoli e crescita delle ghiandole mammarie nei maschi giovani

38. ZEARALENONE LEGISLAZIONE VIGENTE Raccomandazione 2006/576/CE che pone i seguenti valori di riferimento: materie prime:  2 mg/kg (cereali escluso mais)  3 mg/kg (mais) mangimi completi:  0.1 mg/kg (suinetti e scrofette)  0.2 mg/kg (scofe e suini da ingrasso)  0.5 mg/kg (vitelli, bovini da latte, ovini e caprini) Mangimi

39. ZEARALENONE LEGISLAZIONE VIGENTE Regolamento CE/1881/2006 che pone I seguenti valori di riferimento:  100 µg/kg (cereali escluso mais)  200 µg/kg (mais)  75 µg/kg (cereali per consumo diretto)  50 µg/kg (pane, biscotti e merendine)  20 µg/kg (alimenti per lattanti e bambini) Alimenti

40. ANALISI DELLO ZEARALENONE Metodi cromatografici (HPLC) per conferma Estrazione del campione L/L e purificazione mediante SPE C18/immunoaffinità Metodi immunoenzimatici (ELISA) per screening

41. ANALISI DELLO ZEARALENONE

42. TRICOTECENI Costituisce una famiglia di oltre 60 micotossine prodotto da F. graminearum , altre specie di F , nonché Myrothecium , Phomopsis , Stachybotrys , Trichoderma , Trichothecium , ed altre… F. graminearum su mais Stachybotrys sulle pareti di un locale lavanderia

43. TRICOTECENI Anche se controverso, è stato ipotizzato che la decima piaga d’Egitto (Antico Testamento, Esodo 11:1 - 12:33) possa essere causata da tossine prodotte da muffe Stachybotrys

44. TRICOTECENI I tricoteceni sono potenti inibitori della sintesi proteica Nell'uomo, la tossina T-2 è causa dell’aleuchia tossico-alimentare (ATA), provocando alterazioni del sistema ematopoietico con leucopenia, emorragia nella pelle (petecchie), sepsi e necrosi del midollo osseo Tossina T-2 Deossinivalenolo (DON)

45. TRICOTECENI Importanti epidemie di ATA sono state riscontrate in USSR durante l’ultima guerra mondiale Alla fine dell’800, micotossicosi da tricoteceni sono state responsabili della elevata mortalità infantile in Russia (doppia rispetto al resto d’Europa) Nel 1943 il Ministero della Sanità Sovietico impose per i militari una dieta a base di patate e di cereali freschi Negli animali da allevamento provocano: IN ACUTO debolezza, tremori, paresi agli arti posteriori, vomito, edema della lingua, diarrea emorragica, dispnea, scolo nasale IN CRONICO anoressia, aborto, sindrome della “necrosi della coda dei vitelli”, diminuzione dell’ovoposizione e dello spessore del guscio (galline ovaiole), lesioni della mucosa del cavo orale e dell’apparato gastroenterico, rifiuto del cibo

46. TRICOTECENI Raccomandazione 2006/576/CE che pone I seguenti valori di riferimento per il DON nell’alimentazione animale: materie prime:  8 mg/kg (cereali escluso mais)  12 mg/kg (mais) mangimi completi:  5 mg/kg (in generale)  0.9 mg/kg (suini)  2 mg/kg (vitelli < 4 mesi, ovini e caprini) LEGISLAZIONE VIGENTE Dati insufficienti per proporre limiti alle tossine T-2 e HT-2. Si suggeriscono ulteriori studi, monitoraggi, messa a punto di metodiche sensibili Mangimi

47. TRICOTECENI Regolamento CE/1881/2006 che pone I seguenti valori di riferimento per il DON:  1250 µg/kg (escluso grano duro, avena e mais)  1750 µg/kg (grano duro, avena e mais)  750 µg/kg (cereali per consumo diretto e pasta secca)  500 µg/kg (pane)  200 µg/kg (alimenti per lattanti e bambini) LEGISLAZIONE VIGENTE Ancora da stabilire i limiti per le tossine T-2 e HT-2 Alimenti

48. ANALISI DEI TRICOTECENI GC-MS Estrazione del campione L/L e purificazione mediante SPE Florisil Derivatizzazione con TMS Metodi immunoenzimatici (ELISA) per screening

49. ANALISI DEI TRICOTECENI LC-MS/MS Estrazione del campione L/L e purificazione mediante SPE Immunoaffinità