presentation of the clinical research flow cytometry core facility of CHU Nancy

1. Plate-forme de Recherche Clinique
en CYTOMIQUE
 Biomarqueurs cellulaires innovants
 CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de
la Santé (ITTS-CIC-B)
 Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires
du CHUN (Pr F Plenat) dédié à la recherche
clinique et translationnelle
 Mutualisation des compétences
 Complémentarités humaines et technologiques
 Ouverture régionale et interrégionale
 Ensemble type « Flow cytometry core
facility »
 Cytométrie en flux multiparamétrique
 Cell Search Veridex
 Image Stream System (Amnis)
 Charte et soumission IBiSA

2. Cytométrie de flux multiparamétrique
 Navios (Beckman Coulter)
 Software Kaluza
 CMF 3 lasers 10 couleurs
 Laboratoire d’Immunologie (Pr GC FAURE, Pr MC BENE, Dr M de
CARVALHO)
 Service d’Hématologie biologique (Pr T LECOMPTE, Dr V
LATGER)
 Unité de thérapie cellulaire et tissulaire (Pr JF STOLTZ, Pr A
DALLOUL)
 Anatomopathologie (Pr F PLENAT, Dr K MONTAGNE)

3. Cancéropole
Cytométrie de flux multiparamétrique
Evénements rares et populations discrètes
 Onco-Hématologie
 NoE European Leukemia Net
 STIC DHOS Maladie résiduelle (LAL, LAM)
 Maladie Résiduelle LLC
 Myélodysplasies
 Projet INCA SIGLAM
 Phase périphérique des LMNH
 Réponse immunitaire anti-tumorale et thérapie
cellulaire
 Tregs, cellules dendritiques, cellules NK
 Microparticules et cellules endothéliales

4. Cytométrie de flux multiparamétrique (2)
MC Béné, au nom du GEIL, GTLLF, GOELAMS
Moelle normale
Maladie résiduelle
valorisation démarche détection et quantification
d’événements rares
au sein des « bermudes »
CD34 CD45
CD13 SSC

6. Cytométrie de flux
multparamétrique (2)
 Réponse immunitaire anti-
tumorale spécifique (M de
Carvalho, P Eschwege + …)
 Antigènes candidats (cancer
prostate)
 Problématique: événements rares
+ caractérisation
multiparamétrique phénotypique
et fonctionnelle de sous
populations cellulaires
 Signatures cytokiniques
 Transfert de l’expérience
acquise dans la réponse
spécifique anti-mycobacterium
tuberculosis et anti-adenovirus

7. Cytométrie de flux
multiparamétrique (3)
 Microparticules, thrombose et cancer (V Latger-
Cannard, Th Lecompte)
 Standardization of platelet-derived
microparticle counting using calibrated beads
and a Cytomics FC500 routine flow cytometer
: a first step towards multicenter studies?
 Robert S, Poncelet P, Lacroix R, Arnaud L,
Giraudo L, Hauchard A, Sampol J, Dignat-
George F.
 J Thromb Haemost. 2009 Jan;7(1):190-7. Epub
2008 Oct 18.

8. Cell Search Veridex®
 Combinaison de méthodes
 Immunologiques spécifiques
 Séparation immunomagnétique
 Quantification en imagerie photonique automatisée
 Standardisation et automatisation de la phase
préparative
 Très grande sensibilité (5 évts/tube de 7,5mL)
soit #10-7
 outil de choix pour l'étude des cellules
endothéliales circulantes en recherche clinique.
 Validation antérieure en recherche clinique
pour les cellules tumorales circulantes pour des
études pronostiques.
 Capacités d’isolement des cellules en vue
d’études moléculaires complémentaires

9. Projets Cell Search
Cancéropole et au-delà…
 Cellules Tumorales Circulantes (CTCs)
 Sein (CIC Cancérologie CHU-CLCC E Luporsi –
GSK/NOVARTIS – INCA?)
 Poumon
 AO Cancer 2009 Région Lorraine, Nancy Y Martinet,
JM Vignaud comparaison ISET STIC Nice, Strasbourg P
Oudet, M Beau-Faller
 Prostate (Nancy Urologie: J Hubert, P Eschwege; Paris: S
Loric LIBM)
 Validation clinique en réseau interrégional, national, voire
européen (IMI?)
 Cellules Endothéliales Circulantes (CECs)
 Thérapies antiangiogéniques
 Inflammations: sepsis (CPRC S Gibot)
 Neuroectodermoses: Sclérose tubéreuse de Bourneville (J
Hubert, Necker)

10. Cell search CTCs (1)
 CERONC – Poumon (Y Martinet, E Quoix,
M Beau-Faller, P Oudet)
 Evaluation de l’intérêt clinique de la détection
des cellules tumorales circulantes dans le
cancer bronchique métastatique
 Avec ajout de marqueurs d’intérêt (X)
 Isolement des cellules en vue d’études
moléculaires
 CERONC – Prostate (P Eschwege, J
Hubert, D Peiffert)
 Evaluation préthérapeutique

11. Cell Search CECs (2)
 Projet Sepsis
 CPRC CHU Nancy (Pr S Gibot, GCF)
 Quantification des CEC
 Isolement des CECs pour études
moléculaires
 Projet STB (Sclérose Tubéreuse de Bourneville)
 Evaluation des CECs comme biomarqueurs
d’angiogénèse pour l’évaluation et le suivi des
tumeurs vasculaires rénales
 Demande en cours ASTB, PHRC maladies rares
(GCF, Pr J Hubert, Necker – D Joly, Lyon – O
Rouvière)

12. Imagerie en flux
Image stream X AMNIS®
 Le système AMNIS®, système d’imagerie en flux
combinant cytométrie en flux et imagerie photonique
 Observation directe, de la localisation
précise, cellule par cellule, des marqueurs
fluorescents utilisés pour identifier:
membrane, organites intracellulaires, noyau.
 Parmi les applications réalisables en simultané
 Marquages membranaires multiples et colocalisation de
marqueurs de surface
 Marquages nucléaires (FISH en suspension)
 Translocation nucléaire, apoptose
 Etudes fonctionnelles
 Coopérations cellulaires (synapse immunologique)

13. Image stream X AMNIS
Applications…. etc
 Biologie cellulaire – Immunologie
 Cancérologie
Cycle Cellulaire
Signalisation Cellulaire Analyse Morphologique
Mort cellulaire
Dommage de l’ADN
Interactions cellulaires

14. Plate-forme de recherche clinique
en CYTOMIQUE
 Biomarqueurs cellulaires innovants
 CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de
la Santé (ITTS-CIC-B)
 Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires
du CHUN (Pr F Plenat; REDIF: Pr Th Lecompte;
CIC-B Pr GC Faure) dédié à la recherche clinique
 Mutualisation des compétences
 Complémentarités humaines et technologiques
 Ouverture régionale et interrégionale
 Ensemble type « Flow cytometry core
facility »
 Cytométrie en flux multiparamétrique
 Cell Search Veridex
 Image Stream System (Amnis)
 Charte et soumission IBiSA

16. R3
MONOMONOMONO
T CELLT CELLT CELL
MONOMONOMONO
T CELLT CELLT CELL
1e50 1e4-1e3 1e3 1e6
Intensity_A-750 CD3
1e5
1e6
1e4
-1e3
0
1e3
Intensity_PECD14
9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3
325
718
969
1246
9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3
316
943
1142
3592
Monocytes
T cells
NF-kB translocation in whole blood subsets