Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (oryza sativa)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM
GÂY BỆNH TRÊN LÚA (Oryza sativa)
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG
ThS. LÊ QUỲNH LOAN
Sinh viên thực hiện :NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG
MSSV: 1311100334 Lớp: 13DSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2017

Đồ án tốt nghiệp
i
CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu
thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn
Hoàng Dũng, ThS. Lê Quỳnh Loan. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong
đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào.
Những thông tin tham khảo đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thanh Hương

ii
LỜI CÁM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ
Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn, em đã
hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới,
Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm
đề tài.
TS. Nguyễn Hoàng Dũng và ThS. Lê Quỳnh Loan phòng Vi Sinh, Viện Sinh
Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng
dẫn, giảng dạy và giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đồ án.
Thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa
Học và Công Nghệ Việt Nam giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy, cô khoa Công nghệ sinh học –
Thực phẩm – Môi trường của trường đại học HUTECH đã tận tình truyền đạt kiến
thức và kinh nghiệm trong suốt 4 năm qua.
Các bạn lớp 13DSH02 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt
thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều
kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội, người đã luôn bên cạnh động
viên, định hướng cho con những khi gặp khó khăn trong công việc.
Xin trân trọng cảm ơn!
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thanh Hương

iii
MỤC LỤC
CAM ĐOAN ................................................................................................................i
LỜI CÁM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC................................................................................................................. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG.........................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài........................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu ............................................................................1
3. Mục đích nghiên cứu .............................................................................2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu.............................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................3
6. Kết quả đạt được....................................................................................3
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp ................................................................3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................4
1.1. Sơ lược về cây lúa...................................................................................4
1.2. Một số bệnh thường gặp trên lúa .........................................................5
1.2.1. Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lá lúa) ..................................................5
1.2.2. Bệnh đốm nâu trên lúa..............................................................11
1.2.3. Bệnh tiêm lửa hại lúa................................................................13
1.2.4. Bệnh khô vằn ............................................................................15
1.3. Định danh bằng sinh học phân tử ......................................................20
1.3.1. Phương pháp ly trích DNA.......................................................20
1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật...............................................22
1.4. Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch..............................................25
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................27
2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất ...............................................................27

iv
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị....................................................................27
2.1.2. Nguồn mẫu................................................................................28
2.1.3. Hóa chất ....................................................................................28
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................29
2.2.1. Thu mẫu ....................................................................................29
2.2.2. Phân lập và làm thuần nấm.......................................................29
2.2.3. Phương pháp phòng ẩm ............................................................29
2.2.4. Phương pháp bảo quản chủng nấm...........................................30
2.2.5. Định danh bằng sinh học phân tử (kỹ thuật PCR)....................31
2.2.6. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo ..................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.........................................................35
3.1. Kết quả phân lập và làm thuần nấm bệnh ........................................35
3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu lá bị bệnh ..............................................35
3.1.2. Kết quả phân lập, làm thuần và quan sát hình thái...................36
3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS .................................44
3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS ............................................................45
3.4. Kết quả tái nhiễm theo quy tắc Koch ................................................48
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................51
4.1. Kết luận.................................................................................................51
4.2. Kiến nghị...............................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................52
PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường................................................................1
PHỤ LỤC B: So sánh trình tự tương đồng của các đoạn gene trên NCBI.........2
PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS………………………….6

v
DANH MỤC CHỮ VIẾTTẮT
Bp Base Pair
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DNA Deoxyribonucleotide Acid
EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid
ITS Internal transcribed spacer
PCR Polymerase Chain Reation
PDA Potato Dextrose Agar
PDB Potato Dextrose Broth
TAE Tri – Acetic acid – Ethylenediamine – Tetraacetate
TE Tris – Ethylenediamine – Tetraacetate

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại nấm M. oryzae............................................................................9
Bảng 1.2. Phân loại nấm C. lunata...........................................................................11
Bảng 1.3. Phân loại nấm B. oryzae...........................................................................14
Bảng 1.4. Phân loại nấm R. solani............................................................................17
Bảng 1.5. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS........................................................24
Bảng 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu tại đồng ruộng ..........................................35

vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Bản đồ mồi vùng gen ITS.........................................................................24
Hình 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được trên đồng ruộng ...............................36
Hình 3.2. Chủng nấm CG1.......................................................................................37
Hình 3.3. Chủng nấm CG2.......................................................................................38
Hình 3.4. Chủng nấm CG3.......................................................................................39
Hình 3.5. Chủng nấm BL1 .......................................................................................40
Hình 3.6. Chủng nấm BL2 .......................................................................................40
Hình 3.7. Chủng nấm BL3 .......................................................................................41
Hình 3.8. Chủng nấm VL1 .......................................................................................42
Hình 3.9. Chủng nấm VL2 .......................................................................................42
Hình 3.10. Chủng nấm HM1....................................................................................43
Hình 3.11. Chủng nấm HM2....................................................................................44
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm ly trích và PCR. ............................................45
Hình 3.13. Mẫu lúa đối chứng (phun nước cất) .......................................................49
Hình 3.14. Mẫu lúa thí nghiệm (phun dịch bào tử ở nồng độ 106
tế bào/ml) ..........49
Hình 3.15. Chủng nấm phân lập từ thí nghiệm tái nhiễm ........................................50

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lúa (Oryza sativa) là loại lương thực quan trọng được trồng nhiều trên thế
giới đặc biệt là ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam. Nó có vai trò quan trọng
trong sản xuất nông nghiệp, là nguồn cung cấp lương thực chính. Tuy nhiên do ảnh
hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nông nhiệp, tình hình dịch bệnh có
nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy giảm do sự tác động
của nấm bệnh, đặc biệt là các bệnh như đạo ôn, bệnh đốm nâu,… gây hại ở tất cả
các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa. Triệu chứng ban đầu của các bệnh này trên lá
khá giống nhau, vì vậy việc xác định các tác nhân gây bệnh này thường rất mất thời
gian và khó khăn. Do đó, việc phát hiện kịp thời và chính xác các tác nhân gây bệnh
trên lúa sẽ giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị sớm, kịp
thời và hiệu quả.
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ
sinh học, nhiều kỹ thuật mới ra đời trong đó có kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction) được xem là một phương pháp phổ biến và thông dụng trong việc xác
định các tác nhân gây bệnh cây trồng vì đáng tin cậy, tiết kiệm thời gian và tính
chính xác cao, tìm ra được tác nhân gây bệnh ngay ở giai đoạn đầu khi mới nhiễm
bệnh.
Trên cơ sở đó, tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và định danh một số
chủng nấm gây bệnh trên lúa (Oryza sativa)” bằng kỹ thuật PCR sử dụng đoạn
mồi ITS1 – F và ITS4, nhằm phát hiện bệnh một cách chính xác và nhanh chóng,
đưa ra cách phòng trừ hữu hiệu, giảm thiệt hại đến mức thấp nhất.
2. Tình hình nghiên cứu
❖ Các nghiên cứu trong nước
– Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu bệnh đạo ôn trên một số dòng,
giống lúa của viện cây lương thực và cây thực phẩm, vụ xuân 2010”. Phạm
Tự Bắc (2010). Mục đích của đề tài này nhằm nắm được tác hại và đặc
điểm phát sinh, phát triển của bệnh đạo ôn trên một số giống lúa tại Viện

2
Cây lương thực – Cây thực phẩm trong vụ xuân 2010, xác định chủng sinh
lý nấm đạo ôn và nghiên cứu một số đặc tính của chúng.
– Báo cáo khoa học “Xác định nấm gây bệnh lem lép hạt lúa tại Đồng bằng
sông Cửu Long”. Trần Thị Thu Thủy (2011). Tạp chí khoa học 2011 17a
155 – 163, Trường Đại học Cần Thơ. Đề tài này được thực hiện nhằm xác
định nấm gây bệnh lem lép hạt tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, đã
xác định được 11 chủng nấm.
– Báo cáo khoa học “Ứng dụng phương pháp PCR trong việc xác định nấm
gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae”. Đoàn Thị Hòa et al.
(2016). Tạp chí khoa học Đại học mở TP.HCM, số 4 (49) 104 – 110. Xác
định nấm đạo ôn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt nhằm giúp
giảm chi phí, thời gian và công sức.
❖ Các nghiên cứu ngoài nước
– Hajano et al. (2011). “Rice blast – mycoflora, symptomatology and
pathogencity”. Nghiên cứu về đặc tính, triệu chứng của một số loại nấm
gây bệnh trên lúa được phân lập từ hạt và lá lúa.
– Kamaluddeen et al. (Dec 2013). “A new blight disease of rice caused by
Curvularia lunata from Uttar Pradesh”. Nghiên cứu này mô tả về bệnh
đốm nâu do Curvularia lunata gây ra.
3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa thu thập ở 2 tỉnh
đồng bằng sông Cửu Long (Long An, Vĩnh Long) và huyện Hóc Môn, từ những kết
quả của nghiên cứu này, có thể dựa vào những đặc điểm và những nghiên cứu về
nấm bệnh rồi đưa ra các biện pháp khắc phục kịp thời, nhanh chóng, tránh tổn thất.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
– Phân lập và làm thuần nấm bệnh
– Quan sát đặc điểm hình thái (khuẩn ty và bào tử)
– Định danh bằng sinh học phân tử
– Tái nhiễm nấm bệnh trên cây lúa.

3
5. Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp phân lập và làm thuần nấm bệnh
 Phương pháp phòng ẩm (xem sợi khuẩn ty và bào tử)
 Phương pháp tách chiết và thu nhân bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB)
 Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1 – F và ITS4
 Phương pháp tái nhiễm của Robert Koch.
6. Kết quả đạt được
 Đề tài đã phân lập và làm thuần được 10 chủng nấm gây bệnh trên lúa.
 Thu nhận bộ gen DNA của 3 chủng nấm.
 Nhân bản thành công vùng gen ITS bằng phương pháp PCR.
 Thực hiện tái nhiễm theo phương pháp Koch, kết quả có 1 loài có khả năng
tái nhiễm trên lúa.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Nội dung của đồ án tốt nghiệp này gồm 4 chương:
 Chương 1 là tổng quan tài liệu: Giới thiệu sơ lược về cây lúa, một số bệnh
thường gặp và chủng nấm gây bệnh trên lúa.
 Chương 2 là vật liệu và phương pháp: Mô tả các phương pháp nghiên cứu
được sử dụng.
 Chương 3 là kết quả và biện luận: Đưa ra kết quả đạt được và nhận xét, biện
luận các kết quả này.
 Chương 4 là kết luận và kiến nghị: Kết luận về các kết quả thí nghiệm đã đạt
được và kiến nghị tiếp tục hoàn thiện thêm các kết quả chưa đạt được.

4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây lúa
Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae),
họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima.
Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu
Phi. Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi
Oryza. Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa,
granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài [8] .
Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định
danh các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp
phân tích các loài lúa được chính xác hơn [8].
Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa Quốc
tế, Philippines năm 1967 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa dại
và hai loài lúa trồng [14].
Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea
là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn
nhóm genome [22].
Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài, trong đó
21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc
loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây
và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia
thành hai loài phụ là Indica và Japonica. Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài
hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như Javanica v.v...
[7], [9].
Tang và ctv (2004), so sánh bộ gen lục lạp của giống lúa 93 – 11 (đại diện
loài phụ Indica) và giống lúa Peiai'64S (giống lúa lai thuộc loài phụ Indica, nhưng
nguồn gốc mẹ thuộc loài phụ Japonica) cho thấy sự phân chia bộ gen lục lạp của
hai loài phụ Indica và Japonica xảy ra cách đây khoảng 86.000 – 200.000 năm
trước [21].

5
Vitte và ctv (2004) cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica được phân
hoá độc lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm. Trong khi đó, tác giả Jianxin
phân tích ADN nhân tế bào và cho rằng lúa Indica và Japonica được tách ra từ một
tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm [23], [18].
Jason và ctv (2006), nghiên cứu biến đổi trình tự ADN của ba vùng gen bằng
phương pháp địa lý - thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng. Kết quả cho
thấy, cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau
của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai loài phụ
là Indica và Japonica [17].
Zhu và ctv (2007), trên cơ sở giải mã trình tự ADN của 10 gen ở nhân tế bào
của lúa cho rằng, quá trình thuần hoá liên quan chặt chẽ với quá trình giảm đa dạng
di truyền của các giống lúa dại. Đa dạng di truyền của lúa Japonica thấp hơn 2 lần
so với đa dạng di truyền của lúa Indica [24].
1.2. Một số bệnh thường gặp trên lúa
1.2.1. Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lá lúa)
Bệnh chính thức được phát hiện ở Ý vào năm 1560. Sau đó bệnh được quan
sát thấy ở các nước châu Á như: Trung Quốc 1637, Nhật Bản 1760, Ấn Độ 1913,…
đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới. Ở nước
ta, Vincens (người Pháp) đã phát hiện một số bệnh ở Nam bộ vào năm 1921. Năm
1951, Roger (người Pháp) đã xác định sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc
bộ. Ở miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà
Đông bị thiệt hại nặng. Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao
điểm của bệnh là tháng 11 – 12 dương lịch và tháng 5 – 6 dương lịch. Các huyện
Châu Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là
những nơi thường có bệnh [10], [11].
1.2.1.1. Triệu chứng của bệnh
Bệnh đạo ôn là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, hay còn gọi là
bệnh cháy lá lúa. Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng
sẽ giảm rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Tác nhân gây bệnh có thể

6
tấn công mọi giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ
cho đến trước trổ thì gọi là bệnh cháy lá. Bệnh có thể gây hại trên cổ lá gọi là thối
cổ lá, hoặc gây hại trên cổ bông được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh
có thể gây lem vỏ hạt lúa [10].
Trên mạ: vết bệnh lúc đầu hình bầu dục nhỏ sau tạo thành hình thoi nhỏ hoặc
dạng tương tự hình thoi, màu nâu hoặc nâu vàng. Khi bệnh nặng, từng đám vết bệnh
kế tiếp nhau làm cây mạ có thể héo khô hoặc chết.
Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu,
giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu
nhạt. Kích thước vết bệnh biến thiên từ một chấm nhỏ như mũi kim đến chiều dài
1,5 cm, khi bệnh nặng các vết bệnh nối với nhau tạo thành những vệt lớn làm cho lá
bị cháy.
Trên cổ lá: vết bệnh hình khum theo chiều cong giữa cổ lá và phiến lá. Từ cổ
lá bệnh lan ra bẹ lá và phiến lá làm lá lúa khô lụi và gãy gục.
Trên đốt thân: lúc đầu là một đốm nhỏ màu nâu sau lớn rộng ra thành một
vành tròn bao quanh đốt thân làm cho thân tóp lại, màu đen. Khi gặp trời mưa ẩm
thân mềm nhũn dễ bị gãy khi mưa giông, gió.
Trên cổ bông và gié lúa: vết bệnh ban đầu là đốm nhỏ, sau lan ra theo chiều
dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô. Nếu nhiễm bệnh sớm (ngay sau trổ)
làm cho toàn bộ bông lúa bị lép trắng; nhiễm bệnh muộn (vào thời kỳ làm hạt – chín)
gây ra hiện tượng bông lúa nhỏ, có nhiều hạt lép, dễ gãy, gié lúa dễ rụng dẫn đến
làm giảm năng suất lúa.
Trên hạt: vết bệnh gây trên hạt không đồng nhất về hình dạng như trên lá lúa
mà có dạng đốm tròn hoặc không định hình, có màu nâu đen hoặc xám. Nấm ký
sinh ở vỏ trấu và có thể ở bên trong hạt. Hạt giống bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh lây
truyền từ vụ này sang vụ khác [10], [11].
1.2.1.2. Quy luật phát sinh phát triển của bệnh
Bệnh phát sinh thất thường, tùy thuộc vào yếu tố ngoại cảnh. Bệnh có thể
phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ thấp (20o
C), ẩm độ không khí cao và gió

7
mạnh. Khi không đủ ánh sáng do mây mù, lúa sẽ tập trung nhiều Glutamic và nhiều
amino acid khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây [10].
❖ Ảnh hưởng của thời tiết khí hậu
Nấm đạo ôn ưa nhiệt độ tương đối thấp, điều kiện nhiệt độ 20 – 28o
C, ẩm độ
không khí bão hòa và thời tiết âm u trong vụ lúa đông xuân là rất thích hợp cho
bệnh phát sinh gây hại nặng nhất.
Độ ẩm không khí và độ ẩm đất có tác dụng lớn tới tính mẫn cảm của cây đối
với sự phát triển của nấm bệnh. Trong điều kiện khô hạn, ẩm độ đất thấp hoặc ở
điều kiện ngập úng kéo dài cây lúa dễ bị nhiễm bệnh, ẩm độ không khí cao lại thuận
lợi cho vết bệnh phát triển. Ở các vùng nhiệt đới có mưa thường xuyên kéo dài tạo
điều kiện thuận lợi cho bệnh gây hại nghiêm trọng [10].
❖ Ảnh hưởng của đất đai, phân bón đến bệnh
Những chân ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nước; những vùng đất
mới vỡ hoang, đất nhẹ, giữ nước kém, khô hạn và những chân ruộng có lớp sét nông
rất phù hợp cho nấm bệnh đạo ôn phát triển và gây hại.
Phân bón giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự phát sinh phát triển của
bệnh đạo ôn ngay cả khi thời tiết không thuận lợi cho nấm phát triển nhưng do bón
phân không hợp lý tạo điều kiện thúc đẩy bệnh phát sinh và gây hại mạnh.
Mức độ ảnh hưởng của phân đạm tới bệnh biến động tùy theo loại đát,
phương pháp bón và diễn biến khí hậu khi bón phân cho cây. Khi sử dụng dạng đạm
tác dụng nhanh như amonium sunfat quá nhiều, qua muộn hoặc bón vào lúc nhiệt
độ không khí thấp và cây còn non đều làm tăng tỷ lệ bệnh và mức độ gây hại của
bệnh.
Phân lân ảnh hưởng ít đến mức độ nhiễm bệnh của cây. Bón phân ở liều
lượng nào đó đối với đất thiếu lân có thể làm giảm tỷ lệ bệnh nhưng nếu sử dụng
lân không hợp lý thì bệnh vẫn có thể tăng.
Nếu bón kali trên nền đạm cao sẽ làm bệnh tăng so với trên nền đạm thấp.
Trong đất giàu kali nếu tăng mức độ bón phân kali trên nền đạm cao cũng có thể
làm tăng mức độ bệnh của cây.

8
Phân silic có tác dụng làm giảm độ nhiễm bệnh của cây. Mức độ nhiễm bệnh
của cây tỷ lệ nghịch với hàm lượng silic trong cây, do đó bón nhiều silic sẽ làm
giảm mức độ nhiễm bệnh của cây [10], [2].
❖ Ảnh hưởng của giống lúa
Ngoài các yếu tố khí hậu thời tiết, đất đai và phân bón, đặc tính của giống có
nhr hưởng rất lớn tới mức độ phát triển của bệnh trên đồng ruộng. Những giống
nhiễm bệnh nặng (giống mẫn cảm) không không những là những điểm bệnh phát
sinh ban đầu mà còn là điều kiện cho bệnh dễ dàng lây lan hàng loạt hình thành nên
dịch bệnh trên đồng ruộng.
Đặc tính chống bệnh của cây lúa tăng khi tỷ lệ SiO2/N tăng. Giống lúa chống
bệnh chứa nhiều polyphenol hơn ở giống nhiễm bệnh. Trong giống lúa chống bệnh
sẽ sản sinh ra hàm lượng lớn hợp chất Phytoalexin có tác dụng ngăn cản sự phát
triển của nấm trong cây. Tính chống bệnh của cây lúa do 23 gen kháng đạo ôn đã
được phát hiện và đồng thời còn phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo của giống. Nhìn
chung, các giống đẻ nhánh tập trung, cứng cây, chịu phân, tỷ số khối lượng thân
trên khối lượng 20 cm gốc nhỏ, ống rơm dày... là những giống thể hiện khả năng
chống chịu bệnh tốt.
Nhiều giống lúa đã khảo nghiệm và đánh giá là những giống có năng suất
cao và chống chịu đạo ôn như IR1820, IR17494, C70, C71, RSB13, Xuân số 2,
Xuân số 5, X20, X21, V14, V15, v.v… và đã được gieo trồng rộng rãi ở miền Trung
và vùng đồng bằng sông Hồng.
Một số giống lúa nếp hoặc NN8, CR203 là giống mẫn cảm bệnh đạo ôn [10],
[7].
1.2.1.3. Nguyên nhân gây bệnh
❖ Nguồn gốc và phân loại
Bệnh do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, thuộc họ Moniliales, lớp nấm Bất
toàn. Phân loại khoa học của nấm M. oryzae được mô tả ở bảng 1.1 [10].

9
Bảng 1.1. Phân loại nấm M. oryzae [27]
Giới (Kingdom) Fungi
Ngành (Phylum) Ascomycota
Lớp (Class) Sordariomycetes
Bộ (Order) Magnaporthales
Họ (Family) Magnaporthaceae
Chi (Genus) Magnaporthe
Loài (Species) M. oryzae
❖ Đặc điểm hình thái và sinh lý
Cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và
hơi gấp khúc. Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc. Bào tử phân sinh
hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 vách ngăn ngang, bào tử không
màu, kích thước trung bình của bào tử nấm 19 – 23 x 10 – 12 µm. Nhìn chung, kích
thước của bào tử nấm biến động tùy thuộc vào các isolates, điều kiện ngoại cảnh
khác nhau cũng như trên các giống lúa khác nhau.
Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 24 – 28o
C và ẩm độ không khí
là 93% trở lên. Phạm vi nhiệt độ nấm sinh sản bào tử là 10 – 30o
C. Ở 28o
C cường
độ sinh bào tử nhanh và mạnh nhưng sức sinh sản giảm dần sau 9 ngày, trong khi
đó ở 16o
C, 20o
C và 24o
C sự sinh sản tăng và kéo dài tới 15 ngày sau đó mới giảm
xuống. Điều kiện ánh sáng âm u có tác động thúc đẩy quá trình sinh sản bào tử của
nấm.
Bào tử này nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24 – 28o
C và có giọt nước.
Quá trình xâm nhập của nấm vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm
độ không khí và ánh sáng. Ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 24o
C và ẩm độ bão hòa là
thuận lợi nhất cho nấm xâm nhập vào cây.
Trong quá trình gây bệnh nấm tiết ra một số độc tố như acid α – pycolinic
(C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy

10
các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa. Nấm đạo
ôn có khả năng biến dị cao, tạo ra nhiều chủng, nhóm nòi sinh học. Các vùng trồng
lúa trên thế giới đã có tới 256 loài xuất hiện. Ở nước ta xác định trên bộ giống chỉ
thị nòi quốc tế đã thấy sự xuất hiện của nhiều nhóm nòi đạo ôn ký hiệu là IB, IC, ID,
IE và IG phân bố từ Quảng Nam – Đà Nẵng đến các tỉnh đồng bằng Bắc bộ. Các
nhóm nòi có sức gây bệnh cao ở các tỉnh miền Bắc là IB, IE, IG, IF và IC – 1, IA –
71 và IC – 23. Các nhóm IA, ID và IG có khả năng gây bệnh cao ở các tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long.
Nguồn bệnh của nấm đạo ôn tồn tại ở dạng sợi nấm và bào tử trong rơm rạ
và hạt bị bệnh, ngoài ra nấm còn tồn tại trên một số cây cỏ dại khác. Ở điều kiện
khô ráo trong phòng bào tử có thể sống được hơn một năm và sợi nấm sống được
gần 3 năm, nhưng trong điều kiện ẩm ướt chúng không sống sót được sang vụ sau.
Tuy nhiên, ở vùng nhiệt đới, bào tử nấm có thể tồn tại quanh năm đồng thời nấm có
thể chuyển ký chủ từ cây lúa bị bệnh sang các cây ký chủ phụ sinh trưởng phát triển
quanh năm [10].
1.2.1.4. Biện pháp phòng trừ
Theo dõi và phân tích các điều kiện liên quan đến sự phát sinh của bệnh như:
vị trí tồn tại của nguồn bệnh, khí hậu thời tiết, sự sinh trưởng của cây, điều kiện đất
đai, phân bón và giống lúa.
Dọn sạch tàn dư rơm rạ và cây cỏ dại mang bệnh ở trên đồng ruộng.
Bón phân N, P, K hợp lý, đúng giai đoạn, không bón đạm tập trung vào thời
kỳ lúa dễ nhiễm bệnh. Khi có bệnh xuất hiện phải tạm ngừng bón thúc đạm và tiến
hành phun thuốc phòng trừ.
Tăng cường sử dụng giống lúa chống chịu bệnh có nhiều gen kháng trong cơ
cấu giống ở những vùng bệnh thường hay xảy ra và ở mức độ gây hại nặng.
Kiểm tra hạt giống nếu nhiễm bệnh thì cần xử lý hạt giống tiêu diệt nguồn
bệnh bằng nước nóng 54o
C trong 10 phút hoặc xử lý bằng thuốc trừ đạo ôn.
Khi phát hiện bệnh trên đồng ruộng cần tiến hành phun thuốc sớm và trừ
nhanh. Một số thuốc hóa học thường được sử dụng như: Fuji – one 40EC (1 l/ha);

11
New Hinosan 30EC (1 l/ha); Kitazin EC (1 – 1,5 l/ha); Kasai 21,2WP (1 – 1,5
kg/ha); Benomyl (Benlate) 50WP 1 kg/ha; Triozol 20WP (Beam 20WP) 1 kg/ha
[10].
1.2.2. Bệnh đốm nâu trên lúa
Bệnh làm tăng số hạt lép, giảm khối lượng hạt ảnh hưởng tới năng suất, bệnh
nặng kéo dài tới cuối kỳ sinh trưởng có thể làm cây lúa cằn lại, trỗ kém. Hạt bị bệnh
tỷ lệ lép lên tới 60 – 70% [10].
Bệnh có thể xuất hiện từ thời kỳ mạ cho đến lúc lúa chín, phá hoại chủ yếu lá
và hạt. Vết bệnh trên lá hình tròn, sọc ngắn hoặc không định hình màu nâu. Trên hạt
lúa vết bệnh tròn nhỏ màu nâu. Vết bệnh trên lá và trên hạt dễ lẫn với bệnh tiêm lửa.
Hạt bị bệnh thường biến màu [10].
Có khoảng 14 loài nấm Curvularia có liên quan đến bệnh nhưng phổ biến
nhất là Curvularia lunata (Walker) Boedjin và Curvularia geniculata Tracy and
Early, thuộc lớp Nấm Bất toàn. Giai đoạn hữu tính là Cochliobolus lunatus Nelson
and Haasis và Cochliobolus genculata Nelson. Phân loại khoa học của nấm C.
lunata được mô tả ở bảng 1.2 [10], [20].
Bảng 1.2. Phân loại nấm C. lunata [26]
Lớp (Class) Euascomycetes
Bộ (Order) Pleosporales
Họ (Family) Pleosporaceae
Chi (Genus) Curvularia
Loài (Species) C. lunata

12
Trên lá và hạt bị nhiễm bệnh nấm mọc thành lớp mốc màu xám đến nâu xám.
Cành bào tử phân sinh màu nâu đậm, đa bào, không phân nhánh mọc đơn hoặc
thành cụm, đỉnh hơi tròn, kích thước 70 – 210 x 2 – 8 µm. Bào tử phân sinh mọc
thành cụm ở đỉnh, cong, hình gù vai trâu, đa bào, có 2 – 5 vách ngăn ngang, đa số
có 3 ngăn ngang, đỉnh tròn hơn thắt ở gốc. Nấm có thể kết hợp gây hại với nấm tiêm
lửa và một số loài nấm khác.
Nấm tồn tại chủ yếu trên bề mặt hạt giống hoặc dưới lớp vỏ trấu dưới dạng
sợi nấm và bào tử phân sinh.
Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ 20 – 27o
C, khi thời tiết
biến động, cây lúa phát triển kém thiếu dinh dưỡng. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng
của cây bệnh thường xuất hiện vào hai cáo điểm từ mạ đến lúa hồi xanh và từ thời
kỳ làm đòng đến lúa chín.
Bệnh phát sinh mạnh ở những chân đất chua, mặn, đất bạc màu. Bón đạm
thấp, đặc biệt là các giống lúa dài ngày nếu thiếu đạm vào thời kỳ làm đòng bệnh
phát triển mạnh. Bón phân cân đối (phân chuồng, NPK) đầy đủ, bón tập trung vào
giai đoạn đầu bệnh nặng hơn so với bón rải rác nhiều lần [10], [20].
1.2.2.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh
Bệnh thường phát sinh và phá hoại vào vụ mùa và vụ chiêm xuân. Bệnh chỉ
phá hại trên các trà lúa cấy muộn (trỗ trung tuần tháng 5 – 6 và hạ tuần tháng 10 –
11), các chân ruộng thiếu phân. Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ
20 – 270
C, khi thời tiết biến động, cây lúa phát triển kém thiếu dinh dưỡng. Trong
suốt thời kỳ sinh trưởng của cây bệnh thường xuất hiện vào hai cáo điểm từ mạ đến
lúa hồi xanh và từ thời kỳ làm đòng đến lúa chín.
Bệnh phát sinh mạnh ở những chân đất chua, mặn, đất bạc màu. Bón đạm
thấp, đặc biệt là các giống lúa dài ngày nếu thiếu đạm vào thời kỳ làm đòng bệnh
phát triển mạnh. Bón phân cân đối (phân chuồng, NPK) đầy đủ, bón tập trung vào
giai đoạn đầu bệnh nặng hơn so với bón rải rác nhiều lần.

13
Nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên các hạt giống và rơm rạ của các cây nhiễm
bệnh. Ngoài ra, ở Mỹ người ta còn phát hiện thấy nấm C. lunata gây bệnh cho quả
cà chua và ớt. còn C. geniculata gây bệnh cho cải bắp, đạu Hà Lan… [10].
Dùng hạt giống sạch bệnh, sáng màu, mảy chắc. Chăm sóc mạ tốt, cấy đúng
thời vụ. Bón đầy đủ các loại phân chuồng, N, P, K, bón phân cân đối, bón vào các
giai đoạn lúa cần dinh dưỡng như đẻ nhánh, đón đòng. Trên các chân đất chua cần
bôi thêm vôi để cải tạo đất.
Điều tiết nước hợp lý, nước sâu khoảng 5 – 10 cm, không để lúa bị hạn hoặc
ngập úng quá. Nếu bệnh phát triển có thể phun các loại thuốc sau: New Hinosan
30EC (1,2 l/ha); Kitazin 50EC (1 – 1,5 l/ha); Rovral 50WP (0,1 – 0,2 %); Zineb 80
WP (1kg/ha) [10], [11].
1.2.3. Bệnh tiêm lửa hại lúa
Bệnh được phát hiện năm 1901 ở Nhật Bản. Bệnh có phạm vi phân bố rộng,
phổ biến ở các nước trồng lúa thuộc châu Á, châu Mỹ và châu Phi. Ở Philippines và
miền Bắc Việt Nam trong những năm 60 bệnh gây hại nặng, mạ còi cọc, chết khô lá
gây tình trạng thiếu mạ ở một số vùng trồng lúa [7].
Bệnh có thể xuất hiện trên lá mầm, bẹ lá, lá và hạt. Khi hạt nhiễm bệnh nảy
mầm, vết bệnh là các đốm nhỏ màu nâu trên lá mầm và các rễ non cũng có thể bị
bệnh dưới dạng các vết đen nhạt. Vết bệnh ban đầu trên lá là các chấm nhỏ màu
vàng, sau chuyển sang màu nâu nhạt và vết bệnh điển hình có hình bầu dục giống
hạt vừng, có màu nâu non, xung quanh có vầng vàng. Đôi khi bệnh phát triển mạnh
làm lá khô vàng và chết. Kích thước số lượng vết bệnh tùy thuộc vào thời tiết và
giống. Trên các giống mẫn cảm vết bệnh lớn và nhiều, ngược lại trên các giống lúa
chịu hoặc kháng vết bệnh nhỏ và ít. Vết bệnh trên bẹ lá đòng và trên vỏ hạt lúa có
màu nâu không có hình dạng nhất định, khi bệnh nặng nấm có thể phát triển và bao
phủ hoàn toàn bộ lớp vỏ hạt và xâm nhập vào nội nhũ [7].

14
Bệnh do nấm Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoem. gây ra tên khác là
Helminthosporium oryzae Breda de Haan thuộc nhóm Nấm Bất toàn, giai đoạn sinh
sản hữu tính thuộc lớp Nấm Túi Ascomycetes có tên là Ophiobolus miyabeanus Ito
and Kuribayashi. Phân loại khoa học của nấm B. oryzae được mô tả ở bảng 1.3 [7].
Bảng 1.3. Phân loại nấm B. oryzae [29]
Lớp (Class) Dothideomycetes
Bộ (Order) Pleosporales
Họ (Family) Pleosporaceae
Chi (Genus) Bipolaris
Loài (Species) B. oryzae
Sợi nấm đa bào, phân nhánh, đường kính 4 – 8 µm màu nâu đến xám nhạt.
Cành bào tử phân sinh mọc thành cụm, đa bào, phần gốc lớn hơn phần đỉnh cành và
hơi gãy khúc. Bào tử phân sinh hình con nhộng thon dài thẳng hoặc hơi cong, hai
đầu tròn có từ 3 – 11 ngăn ngang. Kích thước bào tử biến động từ 15 – 170 x 7 – 26
µm, phần gốc bào tử thon tròn. Trên môi trường nhân tạo bào tử nấm có màu xám
đến hơn đen. Bào tử hữu tính ít gặp, bào tử hình sợi dài có từ 6 – 15 ngăn ngang, túi
nằm trong quả thể và mỗi túi có 8 bào tử. Quả thể hình nậm màu vàng nhạt, có thể
tìm thấy trong rơm rạ.
Trên hạt giống mầm tồn tại trên vỏ hạt, ở mày hạt, giữa lớp mày và vỏ hạt
đôi khi ở nội nhũ.
Nấm sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ khá rộng. Nhiệt độ thích hợp nhất
cho nấm sinh trưởng là 27 – 30o
C, cho bào tử nảy mầm là 25 – 30o
C trong điều kiện
độ ẩm 60 – 100%. Bào tử hình thành từ 5 – 38o
C, pH 4 – 10. Bào tử chết ở nhiệt độ

15
50 – 51o
C, sợi nấm chết ở nhiệt độ 48 – 50o
C trong 10 phút. Trong điều kiện thuận
lợi nấm xâm nhập vào cây trong 4 giờ [7].
1.2.3.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển
Nấm có thể tồn tại trên rơm rạ trong đất và sống sót trên hạt giống trong bảo
quản dưới dạng bào tử hoặc sợi nấm tiềm sinh trong khoảng thời gian từ 2 – 3 năm.
Nguồn bệnh đầu tiên thường từ hạt giống nhiễm bệnh, nấm gây bệnh trên chồi non
và rễ làm giảm tỷ lệ nảy mầm khoảng 11 – 29% và giảm sức sống của cây con. Tỷ
lệ bệnh truyền qua hạt giống trên các lô giống bị nhiễm bệnh có thể lên đến 59,4%.
Trên đồng ruộng, bệnh lan truyền nhờ gió. Nấm có thể gây hại trên 23 loài cỏ dại
một lá mầm.
Bệnh gây hại chủ yếu trên các giống lúa dài ngày, thiếu dinh dưỡng và vào
các thời kỳ khủng hoảng dinh dưỡng trong giai đoạn sinh trưởng của cây lúa (cuối
mạ, lúa bị hạn, sau đẻ nhánh, đòn non). Mức độ thâm canh càng cao bệnh càng ít
gây hại [10].
Chủ yếu dùng biện pháp canh tác bao gồm các khâu: vệ sinh đồng ruộng,
dọn sạch cỏ dại và tàn dư rơm rạ, cấy đúng thời vụ, bón phân đúng kỹ thuật, đảm
bảo đủ nước cho lúa, luân canh và cải tạo đất. Đảm bảo cung cấp dầy đủ dinh dưỡng
cho lúa là quan trọng nhất.
Có thể dùng biện pháp xử lý giống bằng nước nóng 54o
C trong 10 phút hoặc
xử lý bằng thuốc diệt nấm. Trong trường hợp cần thiết có thể phun thuốc trừ nấm
như: New Hinosan 30EC (1,2 l/ha); Kitazin 50EC (1 – 1,5 l/ha); Rovral 50WP
(0,1 – 0,2%); Zineb 80 WP (1kg/ha) [10], [11].
1.2.4. Bệnh khô vằn
Bệnh khô vằn được phát hiện ở Nhật Bản (Miyake, 1910; Sawada, 1912) và
một số nước khác (Reiking, 1918 và Palo, 1926). Là bệnh nghiêm trọng thứ hai sau
bệnh đạo ôn và là loài bệnh gây hại chủ yếu trên lúa hè thu và lúa mùa [10], [11].

16
Bệnh khô vằn gây hại chủ yếu ở một số bộ phận cây như bẹ lá, phiến lá và cổ
bông. Các bẹ lá sát mặt nước hoặc bẹ lá già ở dưới gốc thường là nơi phát sinh bệnh
đầu tiên.
Vết bệnh ở bẹ lá lúc đầu là vết đốm hình bầu dục màu lục tối hoặc xám nhạt,
sau lan rộng thành vết vằn da hổ, dạng đám mây. Khi bệnh nặng, cả bẹ và phần lá
phía trên bị chết lụi.
Vết bệnh ở lá tương tự như bẹ lá, thường vết lan rộng ra rất nhanh chiếm hết
cả bề rộng phiến lá tạo ra từng mảng vân mây hoặc dạng vết vằn da hổ. Các lá già ở
dưới hoặc lá sát mặt nước là nơi bệnh phát sinh trước sau đó lan lên các lá ở trên.
Vết bệnh ở cổ bông thường là vết kéo dài bao quanh cổ bông, hai đầu vết
bệnh có màu xám loang ra, phần giữa vết bệnh màu lục sẫm co tóp lại.
Trên vết bệnh ở các vị trí gây hại đều xuất hiện hạch nấm màu nâu, hình tròn
dẹt hoặc hình bầu dục nằm rải rác hoặc thành từng đám nhỏ trên vết bệnh. Hạch
nấm rất dễ dàng rơi ra khỏi vết bệnh và nổi trên mặt nước ruộng [11].
Do nấm Rhizoctonia solani gây ra, thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp
nấm bất toàn Fungi imperfecti. Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là
Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, là
nấm ký sinh không chuyên tính, có phổ ký chủ rộng. Phân loại khoa học của nấm R.
solani được mô tả ở bảng 1.4 [11].

17
Bảng 1.4. Phân loại nấm R. solani [28]
Ngành (Phylum) Basidiomycota
Lớp (Class) Agaricomycetes
Bộ (Order) Cantharellales
Họ (Family) Ceratobasidiaceae
Chi (Genus) Rhizoctonia
Loài (Species) R. solani
Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn
non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa
bào, có đường kính từ 8 – 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh
hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê
Lương Tề, 1998). R. solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm
phân nhánh (lobate hyphae) và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo
Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) [6], [11].
Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất hay
thay đổi. Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu,
nâu đen, nâu xám và trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, đôi khi hình
cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976).
Đường kính hạch nấm từ 1 – 6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo
thành hạch nấm to. Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi
lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) [2], [6].
Sợi nấm của R. solani có nhiều nhân (thông thường từ 4 đến 8 nhân) trong
một tế bào. Điều này khác biệt với các nấm Rhizoctonia khác có đặc tính của sợi
nấm tương tự Rhizoctonia solani, nhưng chỉ với 2 nhân trong tế bào và được gọi là
binucleate Rhizoctonia.

18
Sự sinh sản hữu tính của nấm tạo ra bào tử đảm. Thông thường có khoảng 4
bào tử đảm đơn bào được tạo thành khi môi trường trở nên ấm ướt và thuận lợi cho
sự phát triển của nấm. Bào tử đảm phân tán theo gió và nảy mầm khi gặp môi
trường ẩm ướt. Mỗi bào tử đảm có 1 nhân đơn và có hình trứng hoặc hình bầu dục.
Thông thường không tìm thấy sự xuất hiện của bào tử đảm trên những mẫu
cây bệnh. Nhiều phương pháp đã được phát triển nhằm tạo bào tử đảm trên mô kí
chủ nhưng nó hình thành rất khó khăn.
Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm sinh trưởng thích hợp ở
nhiệt độ 28 – 32o
C, ở nhiệt độ dưới 10o
C và cao hơn 38o
C nấm ngừng sinh trưởng.
Hạch nấm hình thành nhiều ở nhiệt độ 30 – 32o
C. Khi nhiệt độ quá thấp (12o
C) và
quá cao (40o
C), nấm không hình thành hạch. Nấm có thể phát triển được trong
phạm vi pH rộng từ 3,4 – 9,2; thích hợp nhất ở độ pH 6 – 7 [11].
Hạch nấm hình thành nhiều nhất ở ngoài ánh sáng và khi nhiệt độ môi trường
giảm đột ngột. Các hạch nấm này nảy mầm ở nhiệt độ 16 – 30o
C, nhiệt độ tối ưu
28 – 30o
C. Ẩm độ tương đối 95 – 96% thích hợp cho hạch nấm nảy nầm. Hạch nấm
có kích thước càng lớn, số lượng hạch càng nhiều thì độc tính càng cao. Hạch nấm
có thể sống được 4 – 5 tháng trong đất khô, 7 tháng trong điều kiện ngập nước
(Đường Hồng Dật, 1976) [2].
R. solani có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng (20 – 30o
C) từ 6 – 12 tháng
trong ống nghiệm chứa môi trường PDA (potato dextrose agar), PDYA (potato
dextrose yeast extract agar) hoặc các vật liệu cây trồng tự nhiên. Nấm có thể tồn trữ
trên môi trường hạt đậu khô đến 9 năm mà không làm mất tính độc. Tính độc của
chúng bị mất trong vòng 2 – 3 tháng khi tồn trữ ở nhiệt độ từ 0 – 70o
C.
Nấm R. solani không đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng chuyên biệt, nó có thể phát
triển tốt trên nhiều loại môi trường khác nhau. Hạch nấm thường hình thành sau 3 –
4 ngày nuôi cấy. Hạch nấm hình thành nhiều hay ít, có hình thành hay không phụ
thuộc vào môi trường nuôi cấy, điều kiện ngoại cảnh cũng như phụ thuộc vào các
nhóm nấm khác nhau. Hạch nấm thường mọc rải rác khắp đĩa, có loài mọc rời, cũng
có loài mọc thành từng mảng liên kết với nhau. Tuy nhiên cũng có loài không hình

19
thành hạch (Nguyễn Minh Nguyệt, 2003). Hạch nấm mọc trên môi trường nuôi cấy
có kích thước lớn hơn so với hạch nấm mọc trên cây kí chủ tự nhiên. Nhìn chung,
tốc độ phát triển của R. solani rất nhanh, tản nấm của chúng có thể phát triển trên
toàn bộ đĩa petri 90 mm trong vòng 3 ngày [5].
1.2.4.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh
Bệnh khô vằn phát sinh mạnh trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao. Nhiệt
độ khoảng 24 – 32o
C và ẩm độ bão hòa hoặc lượng mưa cao thì bệnh phát sinh phát
triển mạnh, tốc độ lây lan nhanh. Bệnh thường phát sinh trước tiên ở các bẹ lá và lá
già sát mặt nước hoặc ở dưới gốc. Tốc độ lây lan lên các lá phía trên phụ thuộc rất
nhiều vào thời tiết mưa nhiều, lượng nước trên đồng ruộng quá cao, đặc biệt ở các
vùng nước cấy quá dày.
Sự phát triển của bệnh khô vằn ở thời kỳ đầu cây mạ đến đẻ nhánh có mức
độ bệnh ít. Giai đoạn đòng trỗ đến chín sáp là thời kỳ nhiễm bệnh nặng. Ở miền Bắc
nước ta, bệnh khô vằn gây hại trong vụ mùa lớn hơn ở vụ chiêm xuân.
Sự phát sinh phát triển của bệnh có liên quan nhiều tới chế độ nước trên đồng
ruộng và chế độ phân bón. Bón phân đạm nhiều, bón phân đạm tập trung thúc đòng
bệnh sẽ phát sinh phát triển mạnh hơn. Bón nhiều lần cũng làm cho mức độ bị bệnh
cao. Bón kali có tác dụng làm giảm mức độ nhiễm bệnh của cây.
Nguồn bệnh chủ yếu là hạch nấm tồn tại ở trên đất ruộng, sợi nấm ở gốc rạ
và lá bị bệnh còn sót lại sau khi thu hoạch. Hạch nấm có thể sống một thời gian dài
sau thu hoạch lúa, thậm chí trong điều kiện ngập nước vẫn còn tới 30% số hạch giữ
được sức sống, nảy mầm thành sợi và xâm nhiễm gây bệnh cho vụ sau. Quá trình
xâm nhiễm lặp lại thường xảy ra qua tiếp xúc giữa hạch và bẹ lá lúa.
Chỉ số của đợt gây bệnh lần đầu có liên quan mật thiết với số lượng tiếp xúc
với cây, nhưng sự phát triển của bệnh sau khi tiếp xúc với ký chủ lại chịu ảnh
hưởng lớn của nhiệt độ, độ ẩm và tính mẫn cảm của cây ký chủ.
Phản ứng của các giống lúa đều nằm trong phạm vi từ nhiễm nặng đến tương
đối chống chịu. Chưa có giống lúa nào thể hiện đặc tính chống bệnh cao. Giống lúa
Indica chống chịu bệnh tốt hơn giống lúa Japonica.

20
Ở nước ta, hầu hết các giống lúa đại phương và giống nhập nội đều có mức
độ nhiễm bệnh khô vằn từ trung bình đến nhiễm nặng. Một số ít các giống như
KV10, JR9965, IF50, IR17494, OM80 có mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các
giống khác [11].
Phòng trừ bệnh khô vằn chủ yếu là áp dụng các biện pháp tiêu diệt nguồn
bệnh ở trong đất và quản lý kỹ thuật trồng trọt thâm canh thích hợp. Tiêu diệt nguồn
bệnh ở trong đất tiến hành ngay sau khi thu hoạch, cày sâu để vùi lấp hạch nấm,
phối hợp với các biện pháp gieo cấy đúng thời vụ, đảm bảo mật độ hợp lý, bón phân
đúng tỷ lệ tránh bón tập trung đạm đón đòng, có thể phối hợp thêm kali với tro bếp
để tăng cường tính chống bệnh của cây. Hệ thống tưới tiêu chủ động và không để
mức nước quá cao trong trường hợp bệnh lây lan mạnh.
Ngoài ra có thể dùng thuốc hóa học như Vida 3SC (Wida 5WP) =
Validamycin A5% (1 l/ha); Bonanza 100 DD (0,4 l/ha); Tilt 250ND (0,3 – 0,5 l/ha);
Anvil 5SC (50 – 100g a.i/ha); Roval 50WP (0,1 – 0,2 l/ha); Monceren 25WP (1
kg/ha) để phối hợp với các biện pháp canh tác kỹ thuật phòng trừ bệnh. Sử dụng
thuốc hóa học phòng trừ bệnh chỉ đưa lại hiệu quả khi bệnh mới phát sinh ở những
bẹ lá già và thuốc hóa học phải được phun tiếp xúc với tầng lá dưới của cây kết hợp
với rút cạn nước trên đồng ruộng.
Biện pháp sinh học như sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma để ức chế sự
phát triển sợi nấm và hạch nấm khô vằn cũng có tác dụng phòng trừ bệnh, đảm bảo
an toàn môi trường [10], [11].
1.3. Định danh bằng sinh học phân tử
1.3.1. Phương pháp ly trích DNA
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu
nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp
theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận
được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác
nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải

21
bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic
acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các
enzyme nội bào (deoxyribonuclease – DNase và ribonuclease – RNase).
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay
đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn
hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh
vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt
của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách
chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá
trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc
để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp
ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương
pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp [4].
Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên
thường được sử dụng:
 Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương
pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi
sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương
pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong
2 – 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium
bromide và proteinase K.
 Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là
phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB
là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB
được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly
trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết.
 Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương
đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia

22
nhiệt đến 65o
C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh
chóng và mang lại kết quả khá cao.
 Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ
thuật đóng băng và tan băng ở - 65o
C trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá
vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều
kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường
tự nhiên [4].
1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được mô tả bởi Kary Mullis và
các cộng sự (1983).
Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại
nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật
sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi
trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo
ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen.
PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình
tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng
triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc
hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ
sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase,
đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình
thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer
sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi
nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích
khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự
base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này
gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [3].

23
Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
– Gây biến tính (denaturation) ở 90 – 95o
C. Trong giai đoạn biến tính phân tử
DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single
strands).
– Gắn primer (annealing) ở 40 – 65o
C. Trong giai đoạn này các primer gắn vào
các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các liên kết ion tạo
thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ
DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt
đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.
– Kéo dài phân tử (extension) ở 70 – 72o
C. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích
cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer
theo chiều 5’3’ [3].
1.3.2.2. Vùng trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer)
Internal Transcribed Spacer (ITS) là vùng phiên mã bên trong, có rất nhiều
sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của
vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ
xác định các biệt hóa trong cùng loài [16].
Các mồi vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S
và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Mồi ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng
lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe
và S. cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S.
cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Mồi ITS5 có trình tự
giống với rDNA 18S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách mồi ITS1 25bp. Trình tự
đoạn mồi và bản đồ đoạn mồi vùng gen ITS được mô tả ở bảng 1.5 và hình 1.1.

24
Bảng 1.5. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [33]
ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G White và ctv, 1990
ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes và Bruns, 1993
ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC White và ctv, 1990
ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC White và ctv, 1990
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White và ctv, 1990
ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG Gardes và Bruns, 1993
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G White và ctv, 1990
Hình 1.1. Bản đồ mồi vùng gen ITS [33]
Đề tài này sử dụng cặp mồi ITS – F và ITS4 để phân tích di truyền và
định danh các loài nấm đã phân lập.
1.3.2.3. Các ứng dụng của kỹ thuật PCR
Kể từ khi ra đời, phương pháp PCR ảnh hưởng sâu sắc tới các nghiên cứu về
sinh học phân tử. các ứng dụng tiêu biểu của PCR gồm: sản xuất mẫu dò dùng trong
phương pháp lai phân tử, xác định trình tự nucleic acid, tạo đột biến điểm định
hướng. ngoài ra, PCR còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như:
 Y học: chẩn đoán nhanh các bệnh có nguyên nhân là vi sinh vật mà không có
khả năng mọc trên môi trường nuôi cấy hoặc chậm phát triển thông qua việc
khuếch đại và phát hiện đoạn DNA đặc hiệu.
 Pháp y: dùng để thiết lập dấu vân tay DNA.

25
 Và gần đây nhất là sự đóng góp thiết thực trong việc giải mã bộ gen con
người bằng kỹ thuật PCR.
1.4. Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch
Năm 1884, R. Koch đưa ra 4 nguyên tắc về tác nhân gây bệnh mà cho đến
ngày nay vẫn còn được áp dụng là nguyên tắc chuẩn để chứng minh khả năng gây
bệnh đặc trưng của một loài vi sinh vật nào đó. Các nguyên tắc đó là:
– Tác nhân gây bệnh phải luôn được tìm thấy trên sinh vật bị nhiễm bệnh
nhưng không có ở sinh vật khỏe.
– Tác nhân gây bệnh phải được nuôi trong điều kiện thực nghiệm bên ngoài cơ
thể sinh vật.
– Tác nhân gây bệnh phải có khả năng gây bệnh khi gây nhiễm vào con vật
mẫn cảm.
– Tác nhân gây bệnh phải được xác định từ kết quả tái phân lập [32].
Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng
trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh. Việc lây
bệnh nhân tạo có thể cung cấp thông tin để:
 Khẳng định một sinh vật được phân lập là tác nhân gây bệnh theo quy tắc
Koch
 Xác định phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh
 Đo độc tính các mẫu cấy khác nhau của tác nhân gây bệnh.
Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch,
nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được
phân lập. Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần với các
triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên – các giống cây trồng có thể có độ mẫn
cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh [1].
❖ Các bước thực hiện quy tắc Koch
– Mô tả các triệu chứng biểu hiện ở cây trồng bị bệnh.
– Phân lập vi sinh vật có thể là tác nhân gây bệnh – các mẫu cấy giống nhau
được phân lập từ các cây có triệu chứng giống nhau.

26
– Dùng một mẫu cấy sạch đã được làm thuần để lây lên cây khỏe mạnh.
– Quan sát các triệu chứng biểu hiện ở các cây đã được lây bệnh – triệu chứng
phải giống như đã quan sát ban đầu trên cây trồng bị bệnh.
– Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ các bộ phận cây mới bị bệnh – mẫu cấy
phải giống như mẫu cấy được làm thuần ban đầu.
Các yếu tố cần được cân nhắc trong quá trình lây bệnh nhân tạo bao gồm:
 Nhiệt độ
 Quá ít hoặc quá nhiều nước
 Độ độc hoặc thiếu hụt chất dinh dưỡng
 Lượng nguồn bệnh trộn vào đất không thực tiễn (quá ít hoặc quá nhiều)
 Các điều kiện trồng nói chung.
Luôn luôn bố trí công thức đối chứng (bao gồm các cây không được lây bệnh)
trong các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo.
Độ ẩm cao tạo điều kiện cho việc xâm nhiễm và lan truyền của nhiều bệnh.
Phun sương hoặc để ẩm (bằng túi ny lông che phủ chậu trồng cây) có thể tạo một
môi trường ẩm và làm tăng đáng tỷ lệ thành công của thí nghiệm lây bệnh nhân tạo.
Không nên đặt các chậu trong tủ ẩm hoặc có ny lông che phủ trực tiếp dưới ánh
nắng [1].

27
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị
❖ Dụng cụ:
– Đĩa petri
– Đèn cồn
– Ống nghiệm
– Erlen
– Que cấy
– Dao
– Ống đong
– Lame, lamelle
– Micropipet, pipetman
– Đầu tip
– Eppendorf.
❖ Thiết bị:
– Cân phân tích (A&D HR – 200)
– Nồi hấp khử trùng (TOMY ES – 315)
– Máy vortex (GENIE)
– Máy lắc
– Bể ổn nhiệt (Cole Parmer BT – 15)
– Máy ly tâm thường (Hettich Mikro 20), máy ly tâm lạnh (Hettich Mikro
220R)
– Kính hiển vi quang học
– Máy PCR (Sprint Thermo Cycler)
– Máy điện di.

28
2.1.2. Nguồn mẫu
Địa điểm thu mẫu: Các mẫu lúa bị nhiễm bệnh được thu tại đồng ruộng ở 2
tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Long An, Vĩnh Long) và huyện Hóc Môn,
Tp.HCM.
Thời gian thu mẫu: tháng 2 và 3 năm 2017.
Bảo quản: Mẫu được giữ trong túi PE, được dán nhãn để phân biệt và để
trong tủ mát khoảng 10o
C.
2.1.3. Hóa chất
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bổ sung chloramphenicol 0,05%.
Môi trường PDB (Potato Dextrose Broth).
Thành phần môi trường được mô tả ở phụ lục A (trang 1).
2.1.3.2. Các hóa chất ly trích DNA
 Đệm CTAB (0,2M Tris – Cl pH 7,5; 2M NaCl; 0,05M EDTA; 2% CTAB)
 Polyphenol – Chloroform – Isoamyl alcohol P:C:I (25:24:1)
 Isopropanol
 Ethanol 70%
 6X DNA Loading Dye
 TAE 1X (40mM Tris pH 7,6; 20mM acetic acid; 1mM EDTA)
 Agarose
 Ethidium bromide
 Thang DNA 1kb (HyperLadder 1kb).
2.1.3.3. Các hóa chất phản ứng PCR
 Nước khử ion.
 Master Mix (2x Mytaq HS Mix)
 Mồi xuôi ITS1-F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG (Tm = 49,7o
C)
 Mồi ngược ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC (Tm = 52,1o
C)

29
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu mẫu
Các mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh được thu nhận vào các tháng 2 và 3 năm 2017
tại các địa điểm:
– Huyện Cần Giuộc và huyện Bến Lức tỉnh Long An.
– Huyện Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long.
– Huyện Hóc Môn, Tp. HCM
Mô tả đặc điểm bệnh trên lá: trên lá xuất hiện các vết bệnh nhỏ màu nâu, các
vết bệnh lớn có màu nâu, tâm màu xám, nếu cây bị bệnh nặng các vết bệnh liên kết
lại với nhau tạo thành mảng lớn và làm lá bị cháy khô. Mẫu được giữ trong túi PE,
được dán nhãn để phân biệt và mang đến phòng thí nghiệm để phân lập nấm gây
bệnh.
2.2.2. Phân lập và làm thuần nấm
Nấm được phân lập và làm thuần tại phòng thí nghiệm phòng vi sinh, viện
Sinh học nhiệt đới.
Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Mẫu bệnh được cắt thành đoạn nhỏ, sau đó rửa bằng nước cất vô trùng 3 – 4
lần. Dùng bông thấm cồn 70o
rửa nhẹ trên bề mặt mẫu trong 2 – 3s.
Mẫu được cấy vào đĩa thạch môi trường PDA (bổ sung kháng sinh
chloramphenicol).
Các đĩa phân lập được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để nấm phát triển,
kích thích sự hình thành bào tử nấm.
Theo dõi sự phát triển của hệ sợi nấm trên môi trường và tiến hành cấy
chuyền để làm thuần. Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong môi trường PDA thạch
nghiêng ở 4o
C.
2.2.3. Phương pháp phòng ẩm
Chuẩn bị dụng cụ như lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới, thanh thủy
tinh chữ “U”, môi trường PDA và nước cất. Mang đi hấp khử trùng.
Cách tiến hành:

30
– Dùng pipetman hút môi trường và nhỏ vào lame sao cho môi trường trang
mỏng khoảng 2/3 lame, để môi trường đông tự nhiên.
– Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm lên rồi đậy lamelle lại.
– Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm đều giấy, đậy nắp lại và ủ ở nhiệt độ phòng.
– Quan sát dưới kính hiển vi.
2.2.4. Phương pháp bảo quản chủng nấm
❖ Phương pháp cấy truyền (bảo quản trong ống thạch nghiêng)
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng nấm được cấy trên môi
trường thạch trong ống nghiệm và giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp cho nấm
phát triển đạt đến độ cần thiết. Sau đó chủng nấm này được bảo quản ở 4 – 8o
C,
thông thường giống được bảo quản từ 3 – 6 tháng.
Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng nấm
luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết.
Phương pháp này thường được sử dụng để bảo quản các chủng nấm đã phân
lập được trong phòng thí nghiệm trong thời gian ngắn từ 3 – 6 tháng [25].
❖ Phương pháp bảo quản lạnh sâu (-80o
C)
Vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt
động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu. Cách thực hiện như sau:
– Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu.
– Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO (chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu
và làm tan nhanh để không làm tế bào bị vỡ) đã thanh trùng trước để đạt
nồng độ cuối cùng là 20% và mật độ tế bào là 106
.
– Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp, để ở nhiệt độ
phòng trong 30 phút để cân bằng áp suất.
– Hoạt hóa mẫu: mẫu được hoạt hóa bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể.
Tế bào có khả năng sống khoảng 95% [25].

31
2.2.5. Định danh bằng sinh học phân tử (kỹ thuật PCR)
Từ các mẫu phân lập, chọn những mẫu có đặc điểm hình thái tương tự các
loài nấm gây bệnh trên lúa đã biết, đồng thời có khả năng gây tái nhiễm theo quy
luật Koch để định danh bằng phương pháp sinh học phân tử và xác định danh pháp
khoa học.
2.2.5.1. Ly trích DNA bằng phương pháp CTAB
Nguyên tắc: thành tế bào bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy
mạnh. DNA được giải phóng và được kết tủa trong Ethanol và thu lại nhờ ly tâm.
– Phá màng tế bào
Bước 1: Cho tế bào nấm đã tăng sinh vào ống eppendorf (nghiền nhỏ),
thêm 1ml nước cất vô trùng vào, mang đi ly tâm 10.000 rpm/15 phút.
Bước 2: Sau khi ly tâm thu tủa bỏ dịch, cho 800µl đệm CTAB vào,
vortex mạnh. Mang ủ ở bể điều nhiệt (60o
C/1h).
Bước 3: Ly tâm 13.000 rpm/15 phút, thu dịch (600µl) vào eppendorf mới,
bỏ tủa.
 Loại bỏ protein
Bước 4: Thêm vào thể tích P:C:I (25:24:1) tương đương với thể tích phần
dịch lấy ra (600µl), trộn đều bằng cách lắc, ly tâm lạnh 14.000 rpm/10 phút/4o
C. Có
thể lặp lại 2 lần.
Bước 5: Sau khi ly tâm thì hỗn hợp tách thành 3 lớp, cẩn thận hút lớp
trên cùng cho vào eppendorf mới.
 Tủa DNA
Bước 6: Tủa DNA bằng Isopropanol tỷ lệ 1:1 (hoặc Ethanol tỷ lệ 1:2,5),
trộn đều. Ủ ở -80o
C khoảng 30 phút (hoặc vài giờ).
Bước 7: Ly tâm 14.000 rpm/15 phút/4o
C, bỏ dịch thu tủa.
Bước 8: Cho 1ml Ethanol 70% vào, ly tâm 14.000 rpm/15 phút/4o
C. Sau
khi ly tâm, bỏ dịch thu tủa và để khô tự nhiên.

32
Bước 9: Sau khi Ethanol đã bay hơi hết, cho khoảng 50µl nước SHPT,
bảo quản ở -4o
C. Kiểm tra sự có mặt của DNA sau khi ly trích bằng cách điện di
trên gel agarose 1,5 % [13].
2.2.5.2. Phản ứng PCR
Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm. Mồi là những đoạn DNA ngắn
có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của
DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới.
Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase.
Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một
trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA
polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn
các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và
điện di trên gel agarose [12].
2.2.5.3. Dùng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS
❖ Thành phần phản ứng
Master mix 9,5 µl
ITS1F 1 µl
ITS4 1 µl
DNA 1 µl
H2O 12,5 µl
Tổng 25 µl
❖ Chu trình phản ứng PCR
 Bước 1: Biến tính DNA, 94o
C trong 5 phút
 Bước 2: Gồm 35 chu kỳ
94o
C trong 45 giây
58o
C trong 50 giây
72o
C trong 1 phút

33
 Bước 3: Kết thúc, 72o
C trong 10 phút
 Bước 4: Bảo quản 4o
C
❖ Kiểm tra kết quả PCR
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose
1,5%
 Điều kiện điện di: 90 – 95V, trong 25 phút
 Chạy điện di trên gel agarose
Nhuộm gel với dung dịch Ethidium Bromide trong 20 phút. Sau đó rửa lại
bằng nước cất, quan sát dưới đèn UV và ghi nhận kết quả. Sản phẩm PCR vùng ITS
với cặp mồi ITS1-F và ITS4 có kích thước 600 – 700 bp.
2.2.5.4. Giải trình tự gen và định danh
Sản phẩm PCR vùng ITS được gửi đi giải trình tự gen tại Công ty CNSH
Nam Khoa, địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn – Phường Tân Hưng, Quận 7 – Thành
phố HCM – Việt Nam.
Kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm DNAStar
Lasergene 14.0 và Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để định danh đến
loài và xây dựng cây phát sinh loài.
2.2.6. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo
Thử nghiệm về khả năng lây bệnh nhân tạo được tiến hành để xác nhận lại
nguyên nhân gây bệnh. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh
lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa
mầm bệnh trực tiếp vào cây.
❖ Chuẩn bị dịch bào tử
Dịch bào tử được thu nhận từ nấm đã nuôi cấy khoảng từ 14 ngày tuổi.
Cho 10 ml nước cất đã hấp khử trùng vào đĩa PDA chứa mẫu nấm cần lây
bệnh.
Bào tử hòa cùng với nước được thu lại trong ống nghiệm vô trùng.
Điểu chỉnh mật độ bào tử 1 x 106
/ml bằng buồng đếm hồng cầu.
❖ Lây bệnh lên lá

34
Do nấm được phân lập từ mẫu lá luá bị bệnh cho nên tái nhiễm lên lá lúa.
– Phun dịch bào tử lên lá cây được lây bệnh (hoặc nhỏ vài giọt dịch bào tử lên
một số lá).
– Phun nước vô trùng lên lá cây dùng làm đối chứng (hoặc nhỏ vài giọt nước
vô trùng lên một số lá).
– Đặt chậu trong tủ ẩm hoặc che bằng túi ny lông trong nhà lưới, tránh ánh
nắng trực tiếp.
– Kiểm tra và so sánh những cây được lây bệnh với những cây đối chứng.
Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với
các triệu chứng đã quan sát được trên đồng ruộng.
Sau khi lây bệnh lên lá, ủ cây ở nhiệt độ 25o
C – 28o
C, độ ẩm 100% trong
vòng 72 giờ dưới bóng tối để bào tử xâm nhập vào cây.
Các cây phun nước cất vô trùng được dùng làm đối chứng [1].
❖ Phân lập lại nấm sau khi tái nhiễm
Việc phân lập lại được thực hiện từ cây đã được phun dịch bào tử nấm để lây
bệnh.
Các bước phân lập giống như đã mô tả ở mục 2.2.2.
Nấm được phân lập trên môi trường PDA đến khi thuần.

35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và làm thuần nấm bệnh
3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu lá bị bệnh
Mẫu được thu thập từ đồng ruộng ở 2 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Long
An, Vĩnh Long) và huyện Hóc Môn, Tp.HCM, vào các tháng 2 và 3 năm 2017. Các
mẫu được thu thập tập trung vào nhóm bệnh cháy lá.
Tổng cộng thu thập được 4 mẫu (hình 3.1) và được ký hiệu như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu tại đồng ruộng
STT Địa điểm Thời gian Ký hiệu Mô tả
1 Cần Giuộc, Long An 2/2017 CG Vết bệnh là các đốm nhỏ
hình tròn, màu nâu vàng ở
rìa, ở giữa có màu trắng
xám.
2 Bến Lức, Long An 2/1017 BL Vết bệnh dài, hình thoi, rìa
màu nâu đậm.
3 Vũng Liêm, Vĩnh
Long
3/2017 VL Vết bệnh nhỏ, dài, ở rìa có
màu nâu, tâm có màu trắng
xám.
4 Hóc Môn, Tp.HCM 3/2017 HM Vết bệnh là các đốm tròn
hoặc dài hình thoi, xuất hiện
nhiều, rìa màu nâu, tâm có
màu trắng xám.

36
Hình 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được trên đồng ruộng
a, Cần Giuộc; b, Bến Lức; c, Vũng Liêm; d và e, Hóc Môn
Nấm gây ra bệnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa. Trên lá lúa dễ
bị bệnh, vết bệnh ban đầu xuất hiện như là các chấm màu xám hoặc nâu, nâu vàng
dọc theo rìa lá. Sau đó, chúng biến thành các đốm hình elip dài và có hình thoi với
đầu nhọn. Những đốm này trở nên hoại tử, ở giữa có màu nâu hoặc nâu đỏ. Những
chỗ này lan ra và hình thành các vết thương lớn hơn. Trên thân, nấm tạo ra các vết
thương dài, xám đến đen. Bệnh cũng xuất hiện trên các hạt giống lúa như dạng hình
thoi màu nâu (hình 3.1).
3.1.2. Kết quả phân lập, làm thuần và quan sát hình thái
Các mẫu lá lúa bị bệnh được thu nhận và phân lập trên môi trường PDA bổ
sung thêm kháng sinh chloramphenicol.
a b
c d e

37
Từ các mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh, phân lập, làm thuần và chọn lọc được 10
chủng nấm ký hiệu lần lượt là CG1, CG2, CG3, BL1, BL2, BL3, VL1, VL2, HM1,
HM2.
3.1.2.1. Hình thái chủng nấm thu được ở Cần Giuộc
Từ mẫu lá lúa thu nhiễm bệnh thu được ở Cần Giuộc, phân lập được 3 chủng
lần lượt là CG1, CG2 và CG3. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử
dưới kính hiển vi.
Hình 3.2. Chủng nấm CG1
a, mặt trước; b, mặt sau; c, khuẩn ty; d, bào tử (vật kính 100X)
Chủng nấm CG1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung chloramphenicol
(hình 3.2a và b) ở nhiệt độ 25 - 30o
C trong 7 ngày mọc nhanh, có kích thước khuẩn
lạc 90 mm, sợi nấm màu nâu đen dạng nhung mịn, bào tử màu nâu đen, mặt trước
và mặt sau đều cùng màu nâu sậm.
a b
c d

38
Dựa vào hình ảnh sự hình thành sợi khuẩn ty và bào tử (hình 3.2c và d; vật
kính 100X) quan sát được của chủng CG1 cho thấy sợi nấm có dạng phân nhánh,
cuống bào tử đính hình thành cấu trúc bó sợi và bào tử hơi cong với một đỉnh nhọn,
có hình lưỡi cày, có 2 – 3 vách ngăn, màu nâu, phân đốt.
a, mặt trước; b, mặt sau; c, bào tử (vật kính 40X)
Chủng nấm CG2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
chloramphenicol (hình 3.3a và b) ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày mọc nhanh, có kích
thước khuẩn lạc là 30 – 35 mm, sợi nấm màu xám nâu dạng nhung mịn, bào tử màu
nâu đậm, mặt trước màu nâu xám xung quanh có tơ trắng và mặt sau có màu nâu
đậm rìa màu trắng xám.
Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.3c; vật kính 40X) quan sát
được của chủng CG2 bào tử có hình tròn, dạng chuỗi, màu nâu nhạt.
a
c
b

39
a, mặt trước; b, bào tử (vật kính 100X)
Chủng nấm CG3 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
chloramphenicol (hình 3.4a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, có kích
thước khuẩn lạc là 90 mm, sợi nấm màu trắng, không có bào tử, mặt trước và mặt
sau có cùng màu trắng vàng.
Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.4b; vật kính 100X) của chủng
CG3 cho thấy bào tử trong suốt, dài, hơi cong hình lưỡi liềm, có nhiều vách ngăn,
phân đốt, nhọn ở hai đầu.
3.1.2.2. Hình thái chủng nấm thu được ở Bến Lức
Từ mẫu lá lúa nhiễm bệnh thu được ở Bến Lức, phân lập được 3 chủng lần
lượt là BL1, BL2 và BL3. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử dưới
kính hiển vi.
b
a
b
a

40
Hình 3.5. Chủng nấm BL1
Chủng nấm BL1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung chloramphenicol
(hình 3.5a) ở nhiệt độ 25 – 30o
C trong 7 ngày mọc nhanh, có kích thước khuẩn lạc
80 – 85 mm, sợi nấm màu xanh xám dạng nhung mịn, rìa có màu trắng xám, bào tử
cùng màu với tơ nấm.
Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.5b; vật kính 100X) quan sát
được của chủng BL1 bào tử hơi dài, hình bầu dục, có 2 – 3 vách ngăn, màu nâu,
phân đốt, ở giữa vách ngăn có nhân.
Chủng nấm BL2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
chloramphenicol (hình 3.6a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, khuẩn lạc
có kích thước nhỏ, riêng lẻ, không có tơ nấm, bào tử màu xanh nhạt, mặt trước có
màu xanh hơi vàng.
BL2 cho thấy bào tử nhỏ, không có hình dạng xác định, không có vách ngăn đặc
trưng.
b
a
3

41
Chủng nấm BL3 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
chloramphenicol (hình 3.7a) ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày mọc nhanh, có kích
thước khuẩn lạc là 90 mm, sợi nấm màu trắng hơi vàng, mặt trước có màu trắng
vàng.
BL3 cho thấy bào tử nhỏ, đính trên cuống bào tử, màu nâu đen, hơi dài, không có
hình dạng xác định, hai đầu tròn.
3.1.2.3. Hình thái chủng nấm thu được ở Vũng Liêm
Từ mẫu lá lúa nhiễm bệnh thu được ở Vũng Liêm, phân lập được 2 chủng lần
lượt là VL1, và VL2. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử dưới kính
hiển vi.
b
a

42
Hình 3.8. Chủng nấm VL1
Chủng nấm VL1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
chloramphenicol (hình 3.8a) ở nhiệt độ 22 – 26o
C trong 3 ngày có kích thước khuẩn
lạc là 30 – 35 mm, sợi nấm màu xanh đậm, ở rìa có màu trắng xám, xung quanh có
màu nâu đỏ.
VL1 cho thấy bào tử nhỏ, có dạng hình tròn, màu nâu đen. Dựa vào đặc điểm hình
thái quan sát được từ khuẩn lạc và bào tử.
Hình 3.9. Chủng nấm VL2
b
a
b
a
VL1

43
Chủng nấm VL2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
có kích thước nhỏ và mọc riêng lẻ, bào tử màu xanh đậm, xung quanh có tơ nấm
màu trắng, mặt trước có màu xanh đậm, xung quanh có viền màu trắng.
VL2 cho thấy bào tử nhỏ, màu nâu nhạt, hơi dài, có nhiều vách ngăn, đính trên
cuống bào tử.
3.1.2.4. Hình thái chủng nấm thu được ở Hóc Môn
Từ mẫu lá lúa thu được ở Hóc Môn, phân lập được 2 chủng lần lượt là HM1,
và HM2. Các chủng được mô tả hình thái và quan sát bào tử dưới kính hiển vi.
Hình 3.10. Chủng nấm HM1
Chủng nấm HM1 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
có kích thước khoảng 25 – 30 cm, có màu trắng xám, xung quanh có viền trắng, bào
tử có màu xanh đậm.
Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.10b) của chủng HM1 cho
thấy bào tử nhỏ, hình bầu dục, hai đầu hơi nhọn, màu nâu nhạt. Quan sát đặc điểm
hình thái khuẩn lạc và bào tử.
b
a
HM1

44
Hình 3.11. Chủng nấm HM2
a: mặt trước; b: bào tử (vật kính 100X)
Chủng nấm HM2 được nuôi trên môi trường PDA bổ sung thêm
có kích thước trung bình, mọc không đều xung quanh đĩa, bào tử màu xanh đậm,
không có tơ nấm xung quanh, mặt trước có màu xanh đậm.
Dựa vào hình ảnh sự hình thành bào tử (hình 3.11b; vật kính 100X) của
chủng HM2 cho thấy bào tử nhỏ, màu nâu đậm, hơi tròn, đính trên cuống bào tử.
Qua các kết quả sơ bộ về hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử của các
chủng nấm gây bệnh được phân lập từ lá lúa bị nhiễm bệnh, từ 10 chủng nấm chọn
ngẫu nhiên 3 chủng nấm ở Cần Giuộc, Bến Lức và Vũng Liêm để tiếp tục định danh
ở mức độ phân tử dựa vào vùng gen ITS với cặp mồi ITS1 – F và ITS4.
3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS
Từ 10 chủng nầm phân lập được, bước đầu chọn 3 chủng nấm CG1, BL1,
VL1 để tăng sinh trong môi trường PDB, thu sinh khối và sau đó tiến hành quá trình
ly trích và thu nhận DNA bộ gen.
Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn
DNA bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gen và so
sánh đoạn trình tự với trình tự gen của các loài cơ sở dữ liệu ngân hàng gen NCBI.
b
a

45
Sau khi ly trích và thu nhận DNA bộ gen, chúng tôi tiếp tục sử dụng sản
phẩm đã ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen dựa vào vùng
trình tự ITS. Đoạn gen được nhân bản dựa vào vùng trình tự ITS của các chủng nấm
CG1, BL1, VL1 với cặp mồi ITS1 – F và ITS4 bằng kĩ thuật PCR. Sản phẩm đã
PCR dựa vào vùng trình tự ITS được điện di trên gel agarose 1,5% để kiểm tra sự
hiện diện của DNA (Hình 3.12).
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm ly trích và PCR
a, Kết quả ly trích; b, Kết quả PCR
1: CG1; 2: BL1; 3: VL1; 4: Thang 1kb
Từ hình 3.12 cho thấy kết quả điện di của sản phẩm PCR đều có các vạch
nằm tương đương ở vị trí khoảng 600 – 700 bp. Sản phẩm sau khi PCR đã được
khuếch đại thành công vùng gen ITS. Sau đó, sản phẩm này được gửi đến công ty
CNSH Nam Khoa để giải trình tự.
3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS
Sau khi gửi sản phẩm đã PCR để giải trình tự DNA tại công ty CNSH Nam
Khoa thì kết quả được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như
phần mềm DNAStar Lasergene 14.0 và Ngân hàng gen
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
1 2 3 4
1 2 3 4
a b
700bp
600bp

46
Kết quả trình tự của các chủng nấm CG1, BL1 và VL1 sau khi gửi đi giải
trình tự.
>CG1
CTGCGGAGGGATCATTACACAATAAAATATGAAGGCTGTACGCGGCTGTGCTCTCGGGCCAGTT
TTGCGGAGGCTGAATTATTTATTACCCTTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCGGGTTCGC
CCGCCACCAGGACCACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAAT
GTAAATCATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
AATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG
CCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTG
TTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCGGCCTACTGG
TTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCAATCCATCAAGACT
CCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG
GAGGAA.
>BL1
GGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAATAAAATATGAAGGCTGTACGCGGCTGTGCTCTCGG
GCCAGTTTTGCGGAGGCTGAATTATTTATTACCCTTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCG
GGTTCGCCCGCCACCAGGACCACATCATAAACCTTTTTTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTAT
AACAAATGTAAATCATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAAC
GCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA
CATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTG
CTTGGTGTTGGGCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCGGC
CTACTGGTTTCGCAGCGCAGCACATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCAATCCAT
CAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATC.
>VL1
CTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATAC
CTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCA
TGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCT
CTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA
GTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCG
AGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGG
CCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGA
CTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAG
GTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT.
Tiến hành so sánh vùng gen của các mẫu phân lập được với vùng gen bảo
tồn ITS của các chủng nấm sợi trên ngân hàng gen NCBI, các đặc điểm hình thái
học của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau:

47
Chủng nấm CG1 có mối quan hệ gần nhất với loài Curvularia lunata strain
QRF374, Cochliobolus lunatus strain xsd08005 có độ tương đồng là 100%;
Curvularia sp. isolate XI33 và Cochliobolus lunatus sp. wcy01 có mức tương đồng
là 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái
thì chủng nấm CG1 là loài Curvularia lunata. Curvularia lunata có khuẩn lạc màu
xám mọc lan ra trên môi trường CMX và màu đen trên đĩa đối chứng. Tốc độ tăng
trưởng của C. lunata là 3,61 ± 0,3 cm/ngày. Bào tử có dạng hình thoi, hơi cong và
có ba vách ngăn. Cả hai đầu tế bào có dạng trong suốt. Kích thước của bào tử dao
động trong khoảng từ 17,75 – 23,29 µm x 6,25 – 8,75 µm. Curvularia lunata là nấm
gây bệnh trên lúa và gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp Châu Á và Châu Phi
[20].
Chủng nấm BL1 có mối quan hệ gần nhất với loài Curvularia lunata strain
AN 2, Curvularia sp. isolate XI41, Curvularia hominis, Cochliobolus lunatus strain
xsd08005 có độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so
sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng nấm BL1 thuộc chi Curvularia sp.
Curvularia sp. phát triển rất nhanh, tơ nấm mịn, có khuẩn lạc màu trắng sau chuyển
sang màu nâu xanh ở mặt trước và mặt sau. Tơ nấm phân nhánh, thường có màu
nâu. Cuống bào tử đính có màu nâu, thẳng, đơn lẻ hoặc thành phân nhánh, cong gập.
Bào tử có dạng hình thoi hoặc hình elip, cong, màu nâu, thường có 3 – 4 vách ngăn
ngang [31].
Chủng nấm VL1 có mối quan hệ gần nhất với loài Aspergillus versicolor,
Aspergillus sydowii strain OUCMBI110121, Aspergillus sp. BAB-2568, Aspergillus
carneus strain xsd08017 có độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình
tự gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng nấm VL1 là loài Aspergillus
versicolor. Khuẩn lạc chủng Aspergillus versicolor mọc khá chậm từ 3 – 5 ngày,
phát triển tối ưu ở 35o
C. Khuẩn lạc đa dạng màu sắc như: xanh nhạt, xanh xám,
xanh hồng hoặc xanh đậm (tùy thuộc từng loại môi trường). Cuống bào tử đính trơn
mịn (200 – 500 µm x 4 – 7 µm), phân nhánh. Bào tử hình cầu (tròn), kích thước 2 –
3,5 µm, vách tế bào có hình dáng gồ ghề. Hầu hết các chủng Aspergillus versicolor

Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (oryza sativa)

Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (oryza sativa)

Empfohlen

Empfohlen

Weitere ähnliche Inhalte

Was ist angesagt?

Was ist angesagt? (20)

Ähnlich wie Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (oryza sativa)

Ähnlich wie Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (oryza sativa) (20)

Mehr von TÀI LIỆU NGÀNH MAY

Mehr von TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Kürzlich hochgeladen

Kürzlich hochgeladen (20)

Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa (oryza sativa)