Bilobalide protege melanocitos contra daño oxidativo
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Bilobalide protege a los melanocitos humanos del daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno al promover la expresión de la enzima antioxidante catalasa y glutation peroxidasa-1, lo que reduce el estrés oxidativo. También inhibe la liberación de proteínas de estrés del retículo endoplásmico inducida por peróxido de hidrógeno, previniendo la apoptosis de los melanocitos.
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- 1. Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales del daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno a través de la promoción de la expresión de la oxidasa y la inhibición del estrés del retículo endoplásmico
- 2. Introducción Vitiligo enfermedad adquirida caracterizada por Ø progresiva de melanocitos. Etiología y patogénesis Estrés oxidativo Autodestrucción de melanocitos Factores genéticos Inicio y progresión de la enfermedad Desequilibrio REDOX Peróxido de hidrógeno (H2O2) se acumula en la epidermis y el estrés oxidativo que induce: Ø del péptido pro-opiomelanocortina Regulación de la señalización colinérgica Apoptosis directamente en los melanocitos • Estrés en el RE • Promotor de apoptosis en células del epitelio pigmentario de la retina y células HeLa Autoinmunidad
- 3. Introducción niveles de H2O2 recambio de sustratos sustitutos de la tirosinasa AutoAg Nuevo Ag Autoinmunidad del melanocito Fenoles inductores de vitiligo células dendríticas producción de IL-6 y IL-8 El extracto de ginkgo biloba Antioxidante Detiene la aparición y progresión de vitiligo Neuroprotector uno de los principales componentes nonflavone. Trilactone sesquiterpeno con PM 326,3Da Bilobalide Propiedad de secuestrar radicales libres Liberación de Hsp 70 de los melanocitos
- 4. Investigar si Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales contra el daño oxidativo inducido por H2O2 y explorar los mecanismos moleculares subyacentes implicados en esta respuesta. Objetivo
- 5. Métodos Aislamiento y cultivo de melanocitos •Se incubaron durante la noche •Bilobalide se preparó como una Sol de reserva a 100 mmol/L en DMSO •DMSO sin bilobalide se utilizó para las muestras de control negativo •H2O2 preparado a partir de una Sol madre de 30% antes de c/experimento 20ng/ml de bFGF 20µg/ml de IBMX 10ng/ml de TC Suero bovino fetal al 10%
- 6. Métodos Viabilidad celular se incubaron las células con diversas concentraciones de bilobalide (0-800µmol /L) 72 horas Citotoxicidad ¿Bilobalide protege a los melanocitos del daño celular inducido por H2O2? pretratados con bilobalide (0-400µmol/L) 1 hora se exponen a 1mmol/L de H2O2 durante 16h solución de MTS a cada pocillo de cultivo y se incubó durante 1h a 37°C. La absorbancia se midió a 490nm con un espectrofotómetro de microplacas y la morfología de las células examinadas bajo un microscopio de luz invertida
- 7. Métodos Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa evaluar integridad de la MC basada en la cantidad de LDH citoplásmica liberada en el medio El sobrenadante de cada pocillo de la placa se transfirió al correspondiente pocillo de una placa de ensayo enzimático de 9-6 pocillos y se incubaron con la mezcla de sustrato reconstituida durante 30 min Tinción de Anexina V- yoduro de propidio Detectó apoptosis de melanocitos utilizando un kit comercial Citómetro de flujo (20.000 eventos) La medición de liberación de Hsp 70 Se controló usando un kit de inmunoensayo enzimático comercial (EIA). Medición de ROS intracelulares Citometría de flujo
- 8. Métodos • Extraído de los melanocitos • Mide niveles de expresión de la CAT y GPx1 • β-actina como control interno para la normalización Aislamiento de ARN y el análisis de PCR-TR en tiempo real •Postto cel se lavaron una vez con PBS y se lisaron mediante la adición de tampón •La membrana se incubó con Ac 1° contra CHOP, p-eIF2a, eIF2a y β- actina y con Ac 2° fluorescente marcado con colorante Inmunotransferencia
- 9. Resultados Bilobalide ejerce un efecto protector contra la citotoxicidad inducida por H2O2 a los melanocitos (a) (b) (d) (e) Análisis estadístico Prueba de Kolmogorov-Smirnov ANOVA Prueba Dunnett post hoc usando SPSS 17.0 Comparación de grupos múltiples. Cada experimento se realizó por triplicado y repetido 3 veces Viabilidad celular Pre- tto x 24h 3,5 veces
- 10. Resultados Bilobalide atenúa apoptosis inducida por H2O2 en los melanocitos ensayo de anexina V-PI Bilobalide inhibe la secreción de Hsp 70 inducido por H2O2 en los melanocitos ELISA 12% 62% 36% 25% 2,5 veces
- 11. Resultados Bilobalide atenúa la elevación de ROS intracelular inducido por H2O2 mediante la promoción de la expresión de la catalasa y la glutation peroxidasa-1 (b)(a) PCR-TR cuantitativa en tiempo real 2 veces 3 veces 1,2 v 2,7 v
- 12. Discusión Bilobalide protege a los melanocitos contra la apoptosis inducida por H2O2 y la liberación de Hsp70. CAT GPx1 Ø H2O2 Co-cultivo de bilobalide + H2O2 fue incapaz de aliviar la citotoxicidad en los melanocitos Reducen daño oxidativoExpresión de 2 antioxidantes Hsp Desencadena respuesta autoinmune presentación de Ag previamente oculto Refuerza respuesta inmune mediante + CD ≠ concentraciones de H2O2 liberación Hsp70 de los melanocitos Ø tolerancia de cel T hacia Ag propios y mejora reacción citotóxica de infiltración de LyT Prevención de la potencial respuesta autoinmune Inhibición de Ø directa de melanocitos
- 13. Conclusión Bilobalide puede mejorar el estrés RE y apoptosis en los melanocitos humanos inducida por H2O2 Mediante la promoción de la CAT y la síntesis GPx1 Mediante el bloqueo de la inducción CHOP relacionada con la apoptosis Posiblemente a través de la modulación de la señalización de la UPR.
Hinweis der Redaktion
- Hospital de terceros Popular de Hangzhou, China La acumulación del H2O2 en la epidermis contribuye al daño de los melanocitos característico del vitiligo. La eliminación de H2O2 por los antioxidantes ha sido considerado como beneficioso para los pacientes con vitiligo.
- El vitíligo es una enfermedad adquirida que se caracteriza por la pérdida progresiva de los melanocitos. Su etiología y patogénesis aún no están claros, lo que dificulta los esfuerzos para desarrollar una terapia exitosa. Han sido propuestos Una serie de mecanismos, incluyendo el estrés oxidativo (que juega un importante papel en el inicio y la progresión de la enfermedad), la autodestrucción de melanocitos (autoinmune) y factores genéticos y neurales El H2O2 es una de las principales fuentes de especies reactivas de oxígeno (ROS), se ha encontrado que se acumula en la epidermis de pacientes con vitiligo agudo. El estrés oxidativo inducido por H2O2 puede afectar la pigmentación epidérmica mediante la destrucción de péptido pro-opiomelanocortina, juega un papel importante en la regulación de la señalización colinérgica, además se sugiere que induce la apoptosis directamente en los melanocitos. que puede tener una fuerte conexión con el stress en el ER.8 H2O2 está reportado como promotor de la apoptosis de las células del epitelio pigmentario de la retina y células HeLa mediante la estimulación de diferentes y complejas vías de señalización
- Se cree que altos niveles de H2O2 desencadenan el aumento de recambio de sustratos sustitutos de la tirosinasa, convirtiendo la tirosinasa (que normalmente funciona como un autoantígeno) en un nuevo antígeno, lo que lleva a la autoimmunidad específica del melanocito.10 Además, fenoles inductores de vitiligo han demostrado que estimulan la liberación de proteína de choque térmico (Hsp) 70 de los melanocitos para mediar la activación de células dendríticas (DC) y estimular la producción de citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-6 e IL-8 en los melanocitos. Ante esta evidencia, se considera por lo tanto que la eliminación de H2O2 por los antioxidantes es beneficioso para el tratamiento del vitiligo. El extracto de ginkgo biloba, particularmente Bilobalide que es uno de los principales componentes nonflavone, tiene propiedades neuroprotectoras y antioxidantes definidas, puede detener la aparición y progresión de vitiligo antioxidantes
- Los Efectos del bilobalide en melanocitos fueron investigados mediante la medición de la viabilidad celular, la liberación de proteína de choque térmico (HSP) 70 y los niveles de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ERO). consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada donante Melanocitos normales aislados de muestras de prepucio humanos obtenidos a través de cirugía de circuncisión se cultivaron en medio Hu16 (suplementado con 20ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF), 20µg/ml de isobutilmetilxantina (IBMX), 10ng/ml de la toxina del cólera (CT), y suero bovino fetal al 10%) 3) Antes del tratamiento con bilobalide o H2O2, los melanocitos se sembraron inicialmente a una D=1x104 cel/pocillo en placas de 9-6 pocillos ó D=3x105 cel/pocillo en placas de 6 pocillos 4) Se incubaron durante la noche 5) Bilobalide se preparó como una Sol de reserva a 100 mmol/L en DMSO 6) DMSO sin bilobalide se utilizó para las muestras de control negativo 7) H2O2 preparado a partir de una Sol madre de 30% antes de c/experimento
- 1) A continuación, se incubaron las células con diversas concentraciones de bilobalide (0-800µmol /L) durante 72 h para examinar su citotoxicidad. 2) Para investigar si bilobalida protege a los melanocitos del daño celular inducido por H2O2, los melanocitos fueron pretratados con bilobalide (0-400µmol/L) durante 1h y a continuación, se expone a 1mmol/L de H2O2 durante 16h. Para medir la viabilidad celular, se añadió solución de MTS a cada pocillo de cultivo y se incubó durante 1h a 37°C. La absorbancia se midió a 490 nm con un espectrofotómetro de microplacas y la morfología de las células examinadas bajo un microscopio de luz invertida
- Tinción de Anexina V-yoduro de propidio Las células se analizaron inmediatamente con un citómetro de flujo. En total, se evaluaron 20 000 eventos de cada muestra.
- ARN total y la transcripción inversa (RT) fue extraído de los melanocitos. Los niveles de expresión de la CAT y GPx1 se midieron utilizando un análisis en tiempo real de RT-PCR, y se utilizó b-actina como control interno para la normalización. Después del tratamiento, las células se lavaron una vez con PBS y después se lisaron mediante la adición de 1 9 tampón de muestra SDS. Después de eso, la membrana se incubó con anticuerpos primarios correspondiente contra CHOP, p-eIF2a, eIF2a y b-actina durante la noche a 4 ° C con agitación suave. La membrana se lavó tres veces con tampón de lavado y se incubaron con anticuerpo secundario fluorescente marcado con colorante durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. PCR puede amplificar una simple copia de una región de ADN entre miles de millones de otras, obtenida de ADN de tejidos. Secuencia target es una región específica que queremos amplificar. Desnaturalización de cadenas, unión de primer específicos, para que TAG polimerasa sintetice molde de sólo esa región, y va aumentando exponencialmente el número de moléculas replicadas
- Data de la normalidad se comprobó con la prueba de Kolmogorov-Smirnov y un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) se realizó por comparación de grupos múltiples, seguido de Dunnett la prueba post hoc con el programa SPSS 17.0. P <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Cada experimento se realizó por triplicado y repetido al menos tres veces. Fig 1 Usando el ensayo de viabilidad celular, se encontró que no hubo cambios notables en la viabilidad de los melanocitos tratados con 0-400 µmol / L bilobálidos durante 72 h. Cuando los melanocitos fueron pretratados con bilobálido (0-400µmol / L) durante 1 h y luego se exponen a 1 mmol / L de H2O2 durante 16 h, H2O2 causado severa inhibición de la viabilidad celular, y se observó un efecto protector no tan marcado de la bilobalida en melanocitos (Fig. 1a). Sin embargo, los efectos protectores estables y significativos de la bilobalida en melanocitos surgieron cuando la duración del tratamiento previo bilobalida se extendió a 24 h en el ensayo de MTS (Fig. 1b). El ensayo mostró que el nivel de LDH extracelular aumenta junto con el aumento en el número de células muertas. La fuga de LDH de los melanocitos expuestos a H2O2 aumentó aproximadamente 3,5 veces en comparación con las células no tratadas, sugiriendo que 1 mmol / L de H2O2 es tóxico para los melanocitos. Por el contrario, el tratamiento previo de los melanocitos con bilobalida suprimió la fuga de LDH inducida por H2O2 de una manera dependiente de la concentración (Fig. 1e). Este hallazgo estaba de acuerdo con los resultados del ensayo de viabilidad celular (Fig. 1d).
- Fig 2 Después de la exposición a 1 mmol / L de H2O2 durante 16 h, la tasa media de la apoptosis de células aumentó de 12% a 62% (p <0,001). Después del pretratamiento con 25 o 100 lmol / L bilobalida, reduce la tasa de apoptosis de las células inducida por H2O2 a 36% y el 25%, respectivamente (P <0,001), lo que sugiere que la bilobalida lo logra de una manera dependiente de la dosis. Fig 3 La concentración de Hsp70 secretada en el medio de cultivo se midió mediante ELISA. La secreción de Hsp70 por los melanocitos en el medio aumentó hasta 2,5 veces en presencia de H2O2 (Fig. 3) El tratamiento previo bilobalida inhibió marcadamente 1 mmol/L de H2O2 inducida por Hsp70 la secreción de una manera dependiente de la dosis.
- Fig 4 Fig. 4a. Bilobalide solo no afectó significativamente el nivel de ROS basal en los melanocitos. Sin embargo, el pretratamiento con 25 o 100µmol/L bilobalida suprimió marcadamente el aumento ROS2 intracelular inducida por H2O2. La expresión de CAT y GPx1 mRNA fue detectado por PCR-RT cuantitativa. Como el CAT y GPx1 (son los principales antioxidases intracelulares que eliminan H2O2, se analizó el efecto de bilobálidos en la expresión CAT y GPx1). Hemos demostrado que bilobalide aumentó notablemente la expresión de ARNm de CAT (doble en 25 lmol/L y 3veces en 100 lmol/L) y GPx1 (1,2 veces a 25 lmol/L; 2,7 veces a 100 lmol/L) en comparación con las células no tratadas, de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4b). Los melanocitos se incubaron en presencia o ausencia de 25 o 100 mmol / L bilobalida durante 24 h, y luego se marcaron con 2 lmol / L dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA) durante 30 min, seguido de incubación en presencia o ausencia de 1 mmol / L de H2O2 durante 30 minutos. Después de la incubación, los niveles de ROS se controlaron mediante citometría de flujo. (B) Después del pretratamiento con o sin bilobálido (25 o 100 lmol / L) durante 24 h,
- De acuerdo con nuestros resultados, bilobalida no actúa simplemente como un eliminador de H2O2, como co-cultivo de bilobálido con H2O2 fue incapaz de aliviar la citotoxicidad H2O2 a melanocitos. Bilobalide promueve la expresión de dos antioxidantes, CAT y GPx1, en los melanocitos. Estas son las principales enzimas celulares que participan en la eliminación de H2O2, por lo tanto, ayudan a reducir el daño oxidativo Por lo tanto, el mecanismo de protección de melanocitos por bilobalida es complejo y puede involucrar señalización múltiple vías. Hsp en condiciones de estrés podría desencadenar una enfermedad autoinmune respuesta mediante la presentación de un antígeno previamente ocultas para el sistema inmunológico. Hsp también puede reforzar la respuesta inmune mediante la activación de las DC. Hsp70 mediada por la activación de DC interrumpe tolerancia de las células T hacia antígenos propios, y mejora citotóxica de reacción espontánea de los linfocitos T infiltration. Además, una variante de Hsp70 con una mutación en su región de DC-activación es capaz de invertir la despigmentación autoinmune en vitiligo. Por lo tanto, bilobálidos juega un doble papel en la protección de los melanocitos en condiciones de estrés oxidativo a través de la prevención de la potencial respuesta autoinmune y la inhibición de la eliminación directa de los melanocitos.
- Este estudio indica por primera vez que la bilobalida protege melanocitos humanos del daño oxidativo mediante la inhibición de la apoptosis inducida por H2O2 y suprimir la respuesta autoinmune a través de la reducción de los melanocitos liberación Hsp70. En lugar de trabajar como un eliminador de ROS, bilobálidos promueve la expresión de CAT y antioxidases incluyendo GPx1, e inhibe el estrés del retículo endoplásmico inducida por H2O2 para proteger los melanocitos.