1. La coagulazione
ed i test di
valutazione della
funzione coagulativa
2. Il processo emostatico
• Risposta dell’organismo ad una offesa → interruzione di
continuità dell’endotelio.
• Uno dei più efficaci meccanismi di autoregolazione che il
nostro organismo possieda
• Evita perdite di sangue pur mantenendo nello stesso
tempo la necessaria fluidità del sangue intravascolare →
l’estensione del coagulo viene limitata alla sede della
lesione
• Porta alla lisi successiva del coagulo
5. Fattori coinvolti nell’emostasi
• Vasi (cellule endoteliali e subendotelio) →
vasocostrizione dei vasi danneggiati
• Piastrine → formazione del tappo piastrinico
• Complemento
• Fattori della coagulazione → formazione del tappo di
fibrina
• Fattori della fibrinolisi → risoluzione del coagulo
• sistema macrofagico-monocitario, PMN → rimozione
dei residui del coagulo
• Inibitori della coagulazione
6. • 3 Fasi
• fase vascolare
Emostasi primaria
• fase piastrinica
• fase plasmatica Emostasi secondaria
• Si attivano pressoché
contemporaneamente
• Sono seguite dalla fase
di lisi del coagulo →
fibrinolisi
7. • Processo emostatico:
Inizia quando il sangue viene a contatto con sostanze
diverse da quelle presenti sulla superficie endoteliale
delle pareti dei vasi.
• descrizione
Emostasi primaria
• rapida formazione di un tappo piastrinico a livello
della lesione
• avviene in pochi secondi
• fondamentale per arrestare la fuoriuscita di sangue
dai vasi capillari e dalle venule
• Emostasi secondaria
• attivazione del sistema della coagulazione
formazione della fibrina rafforza il trombo
emostatico primario
• richiede alcuni minuti 7
14. enzima (il fattore attivato) → agisce su un
substrato (il fattore successivo nella forma
non attiva) in presenza di un cofattore che
accelera la reazione;
Queste tre componenti fondamentali sono
assemblate sul complesso fosfolipidico
(FP3) espresso sulla superficie delle
piastrine e tenute assieme dagli ioni calcio
La cascata coagulativa è costituita da un serie di reazioni enzimatiche.
Per essere efficiente è necessario che enzima e substrato vengano a
contatto ad una concentrazione ottimale.
15. Fattori plasmatici della coagulazione:
Factor MW Plasma Concentration Required for Hemostasis
(µg/ml) (% of normal concentration)
Fibrinogen 330,000 3000 30
Prothrombin 72,000 100 40
Factor V 300,000 10 10-15
Factor VII 50,000 0.5 5-10
Factor VIII 300,000 0.1 10-40
Factor IX 56,000 5 10-40
Factor X 56,000 10 10-15
Factor XI 160,000 5 20-30
Factor XIII 320,000 30 1-5
Factor XII 76,000 30 0
Prekallikrein 82,000 40 0
HMWK 108,000 100 0 15
16. I fattori vit K dipendenti
• II, VII, IX, X
Sintetizzati nel fegato
Vit K necessaria per l’attività
della carbossilasi epatica
Υ-carbossiglutamato
indispensabile per legare il Ca++
e ancorarsi ai fosfolipidi
piastrinici carichi negativamente
17. Anticoagulanti endogeni
Trombomodulina
Glicoproteina esposta sulla superficie delle cellule
• Antitrombina III endoteliali
• proteina prodotta dal fegato Lega la trombina alla proteina C
• inibisce l’attività di IXa, Xa, XIa, XIIa e
della trombina Proteina C
Serina proteasi contenente Gla
• attivata dall’eparina
Degrada i fattori Va e VIIIa
• Eparina
• Polisaccaride solforilato prodotto dai Stabilizzata dalla proteina S
mastociti Proteina S
Cofattore che stabilizza la proteina C attivata
• attiva l’antitrombina III mediante modifiche
conformazionali
• Usato in terapia ➔ inibitore della Inibitore del fattore tissutale
coagulazione rapido e potente Inibisce l’attivazione dei fattori IX e X da parte del
fattore VIIa
18. Sostanze ad azione anticoagulante
Al di fuori del circolo il sangue può essere mantenuto liquido
rimuovendo tutto il fibrinogeno oppure aggiungendo sostanze
anticoagulanti
Si distinguono due gruppi di sostanze ad azione anticoagulante:
1) sostanze chelanti il calcio ➔ sottraggono il calcio alla cascata
coagulativa:
-
citrato
ossalato
EDTA (acido etilendiaminico tetracetico)
2) inibitori della trombina:
eparina: esalta l’attività antitrombinica dell’antitrombina III (AT III)
19. Fase fibrinolitica
Il sistema fibrinolitico è fisiologicamente preposto alla
dissoluzione dei trombi e dei coaguli di fibrina
Tale compito è svolto dalla plasmina, un potente
plasmina
enzima (proteasi) che viene generata da un
precursore ematico inattivo, il plasminogeno,
attivato dal t-PA (attivatore tessutale del
plasminogeno), prodotto dalle cellule endoteliali
20. Test di laboratorio
• Attualmente è molto più
facile caratterizzare
laboratoristicamente i
difetti che causano
emorragia piuttosto che
quelle situazioni,
potenzialmente curabili,
che predispongono alla
trombosi
21. Anamnesi + Esame fi sico
Esami diagnostici di base
Esame obiettivo di laboratorio
Esami diagnostici di
Esami d'urgenza
approfondimento
Decisione clinica
Esami di monitoraggio
Follow-up terrapia
farmacologica
22. Significato della raccolta della storia
clinica
Il più importante test di screening è la raccolta della
storia familiare e personale accurata.
E’ noto infatti che i reagenti necessari ai test di
screening non sono così sensibili a tutti i difetti
dell’emostasi.
Per questo motivo possiamo trovare delle situazioni
nelle quali, pur essendo i test nella norma, esiste una
chiara storia emorragica, per lo più in seguito a
traumi e/o estrazioni dentarie
22
23. Significato della raccolta della storia
clinica
Un’altra situazione nella quale una adeguata raccolta
della storia clinica può impedire erronee valutazioni
basate sui test di screening è l’errata esecuzione del
prelievo sul quale si effettuano poi i test di
laboratorio.
Può infatti accadere che durante l’esecuzione, la
raccolta e la conservazione del prelievo, l’emostasi
venga attivata e questo produrrà degli artefatti nel
test di screening, capaci a volte di mascherare un
lieve difetto emostatico, o di dare una impressione di
ipercoagulabilità inesistente.
23
24. La raccolta della
storia clinica va
eseguita seguendo
lo schema
orientativo
riportato nella
tabella
25. Considerazioni sulla raccolta della storia clinica
E’ importante stabilire:
•L’eventuale insorgenza di sintomi emorragici e la loro
incidenza familiare: la presenza di sintomi dalla nascita o
dalla prima infanzia e la loro familiarità, orientano verso
alterazioni della coagulazione, mentre i difetti della fase
vasopiastrinica ( con esclusione della malattia di von
Willebrand) sono in genere acquisiti e sporadici.
•La molteplicità delle sedi delle emorragie: è difficile che
in presenza di alterazioni dell’emostasi la sede di
emorragia sia unica
25
26.
27. Anamnesi + Esame fi sico
Esami diagnostici di base
Esame obiettivo di laboratorio
Esami diagnostici di
Esami d'urgenza
approfondimento
Decisione clinica
Esami di monitoraggio
Follow-up terrapia
farmacologica
34. Processo diagnostico del paziente con
patologie di pertinenza ematologica
Esame obiettivo
1.Cute: pallore, cianosi, ittero, petecchie, ecchimosi,
noduli, teleangectasie, lesioni da grattamento
2.Occhi: pallore o ittero delle congiuntive, emorragie
retiniche, essudati retinici, ectasia dei vasi retinici
3.Cavo orale: stomatiti, ulcerazioni necrotiche,
porpora, bolle emorragiche
4.Stazioni linfonodali: adenomegalie e loro
caratteristiche
5.Torace: versamenti pleurici, focolai infettivi, dolore
alla pressione dello sterno o delle costole
34
35. Test di uso comune per valutare la coagulazione
• Valutazione fase piastrinica
Valutazione fase fibrinica
• Emocromo conta PT
piastrinica aPTT
dosaggio fibrinogeno
• tempo di stillicidio dosaggio At-III
dosggio D-dimero
• Tempo necessario per la
dosaggio fattori:
formazione del tappo
piastrinico in seguito a – Ratio attività:antigene
puntura standardizzata
• aggregazione piastrinica
• Ristocetina Antibiotico
che induce l’aggregazione
piastrinica in presenza di vWf
36. Test di screening dell’emostasi
Test di primo filtro: sono test che permettono con
buona probabilità di evidenziare la maggiore e più
importante parte dei difetti emostatici
Test di secondo filtro: vanno ad indagare dei
difetti più rari, ma non per questo meno importanti
36
37. Caratteristiche dei test di primo filtro
•Sono test di screening e per questo devono essere :
•Semplici, perché devono essere alla portata di ogni
laboratorio non specializzato
•Sensibili, così da rilevare non solo le più grossolane
anormalità dell’emostasi, ma anche difetti minori, che
peraltro aumentano notevolmente il rischio emorragico
in seguito ad un intervento chirurgico
•Limitati di numero, in quanto il loro scopo è quello di
mettere in evidenza il più velocemente possibile
alterazioni delle fasi della coagulazione
37
38. Test di screening dell’emostasi
Test di primo filtro: tempo di emorragia e conta
piastrinica (esplorano la fase vasopiastrinica), il tempo di
protrombina, il tempo di tromboplastina parziale attivato
(esplorano la fase della coagulazione)
Test di secondo filtro: dosaggio del fattore XIII, dell’α
2 antiplasmina, del tPA e del PAI, del fattore
piastrinico 3, del tempo di trombina, il tempo di
Reptilase e del wWF
38
40. Test di primo filtro: fase vasopiastrinica
• Tempo di emorragia: E’ il tempo necessario all’arresto del
sanguinamento da un piccolo taglio, di dimensioni standardizzate,
provocato sulla superficie cutanea (varia da 1 a 9 minuti)
Cosa valuta? L’interazione delle piastrine con la parete vascolare, e la
successiva formazione del tappo emostatico primario
Quando è prolungato? In tutti i casi di piastrinopenia e
piastrinopatie, in caso di carenza di alcuni fattori plasmatici (quali il
fibrinogeno e il vWF), essenziali per la normale funzione piastrinica
ed in soggetti con alterazione della parete vascolare (sindrome di
Ehelers-Danlos, telengectasia emorragica
Come si esegue? Esistono diversi metodi. Tutti sono modifiche di
due tecniche: quella di Duke, che prevede l’incisione del lobo di un
orecchio, e quella di Ivy, in cui si esegue un’incisione della cute
dell’avambraccio, mantenendo costante la pressione ematica (40 mm
Hg) mediante un manicotto 40
41. Condizioni che possono alterare il tempo di
sanguinamento
•Il tipo, la lunghezza la profondità dell’incisione
•L’assunzione di farmaci tra cui l’acido acetilsalicilico (è
stata descritta una sindrome di disfunzione piastrinica
caratterizzata da un tempo esageratamente allungato dopo
assunzione di acido acetilsalicilico ed un tempo di emorragia
basale normale) ed altri antinfiammatori
41
42. Test di primo filtro: fase vasopiastrinica
2.Conta delle piastrine. Il conteggio delle piastrine
Non è strettamente indispensabile per una prima valutazione
dell’emostasi purchè venga eseguito il tempo di emorragia.
Generalmente esiste una correlazione inversa fra il numero di piastrine
al di sotto di 100.000/υl e il tempo di emorragia
Il conteggio delle piastrine diventa obbligatorio quando il tempo di
emorragia è prolungato per stabilire se si tratta di piastrinopenia o
di piastrinopatia.
E’ importante ricordare che si possono avere piastrinopenie spurie (o
pseudopiastrinopenie) causate dall’EDTA, l’anticoagulante in cui
vengono generalmente raccolti i campioni di sangue per la conta
piastrinica. Ciò probabilmente è dovuto ad immunoglobuline che
agglutinano le piastrine quando il Ca è chelato.
42
43. indagini di laboratorio per la
valutazione della funzionalità piastrinica e
relativi valori di riferimento
- tempo di sanguinamento: ≤ 10 minuti (nei
soggetti normali tra 3-6 minuti)
- conteggio delle piastrine: 150.000 –
400.000 per μL
- test di adesività piastrinica: > 70%
- test di aggregazione piastrinica:
confronto dei tracciati di trasmittanza con
quelli ottenuti su piastrine normali
43
44. tempo di sanguinamento
Il tempo di sanguinamento (o di emorragia) viene determinato
effettuando una piccola incisione superficiale sulla rete capillare
della faccia volare dell’avambraccio, in una zona pulita, esente da
malattie della pelle e lontano dalle vene superficiali, mantenendo
una pressione venosa costante di 40 mmHg con uno
sfigmomanometro e cronometrando la durata della fuoriuscita del
sangue dalla ferita
Il test viene eseguito in maniera accuratamente standardizzata
provocando una incisione di profondità e lunghezza costante con
una lama calibrata o con un bisturi automatico: i pazienti con un
tempo di sanguinamento superiore ai 10 minuti presentano un
rischio emorragico aumentato
44
45. conteggio delle piastrine
150.000 - 400.000 / μL: valori normali
> 100.000 / μL: i pazienti sono asintomatici e il
tempo di sanguinamento rimane nella norma
50.000 - 100.000 / μL: il tempo di
sanguinamento è lievemente allungato, ma senza
alcuna sintomatologia emorragica
< 50.000 / μL: si osservano porpore cutanee dopo
traumi minimi e sanguinamenti a livello mucoso in
seguito a piccoli interventi chirurgici
< 20.000 / μL: notevole rischio di sanguinamenti
spontanei intracranici e in altri sede interne
45
46. Le piastrine
valori nel sangue: 150 - 450 x 10 /L.
circa 2/3 circolano, mentre 1/3 risiede nella milza o sedi extravascolari;
46
47. Megacariocita
• ciascun megacariocita durante la sua vita genera circa 4,000 piastrine
• le piastrine vivono mediamente da 9-12 giorni
• ogni giorno sono prodotte 30.000-40.000 piastrine per mmc;
• in caso di necessita’, la produzione di piastrine puo’ aumentare 8 volte;
47
48. test di adesività piatrinica
Il test di adesività piastrinica misura la
capacità delle piastrine di aderire ad una
superficie estranea
Viene effettuato facendo passare, in condizioni
controllate, il sangue attraverso un tubicino di plastica
contenente microsfere di vetro e determinando il numero
di piastrine trattenute rispetto a quelle presenti nel
sangue dello stesso paziente non trattato
Il risultato viene espresso in percentuale di
piastrine trattenute; i valori normali sono tra
70 e 98% 48
51. Test di primo filtro: Fase coagulativa
•Tutti i test di coagulazione dipendono in modo
fondamentale dalla quantità di campione di plasma
ottenuto
•Si richiede una puntura venosa
•Il citrato è l’anticoagulante utilizzato routinariamente
•Il plasma citrato essenzialmente privo di piastrine
viene preparato per centrifugazione standard
51
53. Tempo di protrombina
(PT)
• Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei
fattori VII, X, V, protrombina (II)
• e fibrinogeno (I).
• Monitoraggio della terapia anticoagulante orale
con dicumarolici (INR)
• inibiscono l’attivita’ dei fattori VII, IX, X e della
protrombina
• PT corto privo di significato patologico
• PT lungo
• epatopatia.
• deficit vitamina K
• CID
• sindrome nefrosica
• Farmaci dicumarolici
53
54. tempo di protrombina (PT)
o tempo di Quick
Questo test valuta l’efficacia della via estrinseca e
comune della coagulazione (fattori I, II, V, VII e X)
Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del paziente
tromboplastina tessutale e ioni calcio, e cronometrando il
calcio
tempo necessario alla formazione del coagulo
I valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. tra 11 e
13 secondi) o come rapporto (ratio) tra il tempo del plasma
in esame e quello di un campione di plasma normale di
controllo
54
55. INR = PT Standardisation
ISI
Patient’s PT in Seconds
INR = Mean Normal PT in Seconds
INR = International Normalized Ratio
ISI = International Sensitivity Index
55
56. How Different Thromboplastins
Influence the PT Ratio and INR
Thromboplastin Patient’s Mean
reagent PT Normal INR
(Seconds) (Seconds)
A 16 12 1.3 3.2 2.6
B 18 12 1.5 2.4 2.6
C 21 13 1.6 2.0 2.6
D 24 11 2.2 1.2 2.6
E 38 14.5 2.6 1.0 2.6
56
57. Tempo di
tromboplastina parziale
attivato (aPTT)
• Identifica i deficit acquisiti o
congeniti dei fattori IX, VIII, e XI
• Monitoraggio della terapia con
eparina
• Test di screening per LAC
• Identifica con minor sensibilita’ del
PT deficit dei fattori X, V,
protrombina (II)
• e fibrinogeno (I)
• aPTT corto privo di significato
patologico
•• aPTT lungo
deficit di fattori
• presenza di inibitori (anti-fattore VIII,
LAC)
• terapia con eparina
57
58. aPTT si allunga per livelli di fattore
• VIII < 50%
• XI < 50%
• IX < 30%
• XII < 30%
• Fibrinogeno < 100 mg/dL
• Livelli di eparina 0.15-0.2 U/mL
58
59. aPTT si allunga per livelli di fattore
Cause di errore
Policitemia
Prelievo difficile
Provetta non riempita correttamente
Contaminazione eparina
Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore
59
60. Terapia con eparina: esalta l’attività anticoagulante dell’AT III, inibisce II,
X e delle proteasi in genere
Malattie epatiche: quadro complesso spesso si osserva un aumento del fattore
VIII (è sintetizzato dal sistema reticoloendoteliale epatico) e del vWF
60
61. tempo di tromboplastina parziale
attivata (aPTT)
Questo test valuta l’efficacia della via intrinseca e comune della
coagulazione (fattori I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII)
Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del paziente agenti
attivanti (caolino), una emulsione di fosfolipidi (sostituti
piastrinici) e ioni calcio, e cronometrando il tempo necessario alla
calcio
formazione del coagulo
I valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. tra 28 e 40
secondi) o come rapporto (ratio) tra il tempo del plasma in
secondi
esame e quello di un campione di plasma normale di controllo
61
Hinweis der Redaktion
Inizia quando il sangue viene a contatto con sostanze diverse da quelle presenti sulla superficie endoteliale delle pareti dei vasi.Emostasi primariarapida formazione di un tappo piastrinico a livello della lesioneavviene in pochi secondi fondamentale per arrestare la fuoriuscita di sangue dai vasi capillari e dalle venuleEmostasi secondaria attivazione del sistema della coagulazione formazione della fibrina rafforza il trombo emostatico primariorichiede alcuni minuti importante soprattutto per bloccare la fuoriuscita del sangue dai vasi di calibro maggiore
Il termine emostasi indica l'insieme dei meccanismi utilizzati dall'organismo per proteggersi dalla perdita di sangue in caso di lesioni vascolari. I meccanismi emostatici sono organizzati in tre fasi che si attivano pressochè contemporaneamente: fase vascolare fase piastrinica fase plasmatica o cascata coagulativa La fase vascolare e quella piastrinica possono essere anche considerate insieme a costituire la cosiddetta emostasi primaria. La cascata coagulativa realizza invece il processo dell ’ emostasi secondaria. Successivamente si attiva poi il processo fibrinolitico che porta all ’ eliminazione del coagulo ed alla rimozione di ogni possibile ostacolo al passaggio del sangue.
Lesione vasale vasocostrizione reattiva (riduzione il flusso ematico) fenomeno transitorioriflesso nervoso;secrezione da parte delle cellule endoteliali di fattori endotelina;favorisce il contatto del sangue con la matrice sottoendoteliale esposta dalla perdita di cellule endotelialila matrice contiene proteine (in particolare collagene, proteoglicani e fibronectina) capaci di fare aderire le piastrine ed attivare la cascata della coagulazioneLa fase vascolare non viene valutata in laboratorio
Ruolo delle piastrine nell ’ emostasi Adesione Rilascio contenuto dei granuli (ADP, trombina, catecolamine) Aggregazione Formazione del coagulo (fibrina) Retrazione del coagulo
La Trombina legata al suo recettore ora converte il fibrinogeno in fibrina, che viene polimerizzata e stabilizzata dal fattore XIIIa
Danno vascolare → sintesi di fattori da parte delle cellule endoteliali + fattori prodotti dalle piastrine + fattori di sintesi epatica → cascata coagulativa; Consiste in una serie di conversioni di proenzimi inattivi in enzimi attivi Culmina con la trasformazione di una proteina plasmatica solubile, il fibrinogeno, in un polimero insolubile, la fibrina
In assenza di vitamina K, i fattori II, VII, IX e X vengono ugualmente sintetizzati dal fegato, ma risultano funzionalmente inattivi
- petecchie: piccole emorragie capillari con diametro di circa 1-2 mm di colorito rosso violaceo, frequenti nelle zone dove maggiore è la pressione idrostatica o dove c ’ è pressione o frizione esterna - porpore: emorragie con diametro ≥ 3 mm costituite da un insieme di petecchie ecchimosi: versamenti emorragici sottocutanei di diametro tra 1 e 2 cm, inizialmente di colore rosso-blu, poi verde-blu e quindi giallo-oro ematomi: versamenti emorragici profondi che spesso dissecano le fasce muscolari; possono avere esiti clinicamente insignificanti (lividi) così come gravissimi, finanche mortali (versamento retroperitoneale da dissecazione di un aneurisma dell ’ aorta) versamenti ematici in cavità dell ’ organismo: emotorace, emopericardio, emoperitoneo, emartro sanguinamenti da determinati distretti dell ’ organismo: gengivorragia, epistassi, ematemesi, melena, ematuria, menorragia e metrorragia
Per i test coagulativi occorre sempre lavorare con il plasma
The INR is calculated by the formula shown on this slide. The ISI is the International Sensitivity Index. Each thromboplastin is assigned an ISI which reflects the sensitivity of the thromboplastin to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. By convention, the ISI of the reference thromboplastin is 1.0. The higher the ISI, the less sensitive the thromboplastin is to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. The next two slides provide an example of how the ISI (sensitivity) of the thromboplastin influences the PT ratio (PTR) and how the resulting variability is corrected by expressing the results as an INR.
This slide is similar to the last one, but the results of the ISI values of the five thromboplastins and the corresponding INR values are added. It is clear that the marked variability of the PTR is normalized by expressing the results as an INR.