Biotecnologías Reproductivas aplicables a Producción Animal

1. Biotecnologías ReproductivasBiotecnologías Reproductivas
en el ganado bovino.en el ganado bovino.
Dr. Reinaldo de Armas PhD.Dr. Reinaldo de Armas PhD.
Prof. Reproducción y Biotecnología Animal.
Escuela de Ciencias Pecuarias.
Centro de Investigaciones en Biotecnologías Agropecuarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias - UP

2. BIOTECNOLOGÍASBIOTECNOLOGÍAS

3. Biotecnologías Reproductivas:
• Sincronización e inducción de la ovulación
• Inseminación artificial y congelación de semen
• Producción de embriones por superovulación
• Producción in vitro de embriones
• Congelación de ovocitos y embriones
• Micromanipulación de embriones para producir
gemelos idénticos y quimeras
• Determinación y selección del sexo de embriones y
espermatozoides
• Clonado de animales por medio de transferencia
nuclear
• Transgénesis.

4. Sincronización e inducción de laSincronización e inducción de la
ovulación:ovulación:
La necesidad de los sistemas de explotación
intensivos de implementar la IA, han sido el motor
impulsor de las investigaciones desarrolladas en
cuanto al desarrollo de técnicas de sincronización e
inducción del celo.

5. Entre los sistemas de sincronización del celoEntre los sistemas de sincronización del celo
los más conocidos son:los más conocidos son:
• Empleo de las Prostaglandinas: Para que este medicamento
ejerza su acción resulta necesario la presencia de un cuerpo lúteo
(CL) activo en uno de los ovarios de la hembra. Una de las
desventajas de este tratamiento es la dispersión de la presentación
de los celos, pero sus resultados de gestación son altos (~60%).

6. Empleo de Progestágenos y Estradiol: Los sistemas
más conocidos que emplean estos principios hormonales
son los implantes subcutáneos (Crestar y Sinchromate B),
espirales y las Y intravaginales (CIDR). Hay otros
tratamientos que solo emplean progestágenos, como las
inyecciones seriadas de progesterona (P4) o suministro en
la dieta. Los resultados de gestación está alrededor del
50%.

7. Ovsynch (GnRH, PGF2α, GnRH): Se pueden lograr resultados
de preñez que oscilan entre 33 y 55%.

8. IATF: En muchos fincas se ha estado ensayando la IATF
(inseminación artificial a tiempo fijo) como práctica rutinaria,
por la disminución de costos de personal, al eliminar la de
detección del celo, no obstante los resultados son ligeramente
más bajos que los que son logrados sobre celos detectados.
Co-Synch+CIDR: Aquí se citan resultados de
preñez alrededor de 45%.
5-d Co-Synch+CIDR: Se han alcanzado resultados de hasta
50%.

9. A pesar de disponerse en la actualidad de un gran
número de esquemas de sincronización siguen
existiendo limitantes que no podemos gobernar,
tales como: la respuesta individual, el efecto raza,
estado reproductivo, nutricional y productivo.
Por otra parte hay regulaciones en diferentes países
sobre el empleo de determinadas hormonas, lo que
puede limitar el uso de los diferentes tratamientos
descritos.

10. Esta técnica que no es más que la introducción del semen (material fecundante
del macho o semilla), por medio de instrumentos, desarrollados en
dependencia de las características del tracto reproductivo de las hembras cada
especie. Las primeras investigaciones se deben al monje italiano Lázaro
Spallanzani (1780), posteriormentye fueron los Rusos quienes llevaron esta
técnica a objetivos productivos (Elias Ivanov 1890) y en 1942, Salisbury, de la
escuela americana, idea un diluyente a base de citrato de sodio y yema de
huevo, al que se debe la extensión de la IA. El gran paso de la inseminación
artificial lo logran los norteamericanos Polge y Smith (1952) con el
descubrimiento de que el semen de toros, podía conservarse congelado por
largo tiempo En la actualidad el procedimiento de IA en bovinos ha cambiado
muy poco desde que Cassou (1964), diseñó su sistema de IA con pajuelas.
Inseminación artificial y congelación de semenInseminación artificial y congelación de semen

11. CERTIFICADO DE EXAMEN ANDROLÓGICO
Datos de la Finca: Datos del Animal:
Finca: Identificación:
Propietario: Especie:
Localidad: Raza:
Provincia: Edad:
Peso:
Fecha: Color:
Resultados del Examen General y Especial:
Aplomos:
Visión:
Condición Corporal: (en escala de 1 a 5).
Temperamento:
Escroto:
Testículos: Circunferencia escrotal:
Adherencias:
Epidídímos:
Prepucio:
Pene:
Vesículas Seminales:
Próstata:
Respuesta al Electroeyaculador:
Resultado del Espermiograma:
Cantidad del eyaculado:
Color:
Vigor de los Espermatozoides:
Motilidad por campo bajo microscopio: % V/M: %
Concentración de Espermatozoides: x 106
espermios / ml
Anormalidades Espermáticas: % Patologías:
Células de Descamación:
Calificación Final del Semen Según Morfología:
Observaciones y Recomendaciones:
Requisitos para la selecciónRequisitos para la selección
de un Reproductorde un Reproductor:
• Salud General
• Valor Genético
• Examen Reproductivo
• Capacidad de Servicio

13. Congelación de Semen:Congelación de Semen:
Diluentes crioprotectores:
 Citrato yema
 Glicerina leche
 Biladyl
 Triladyl
 Andromed
Métodos de congelación:
 Ámpulas
 Pastillas
 Pajuelas

17. Producción de embriones por superovulaciónProducción de embriones por superovulación
A pesar de que la técnica de transferencia de embriones data de los
trabajos realizados por Walter Heape a finales del siglo XIX y de la
creciente popularidad de esta técnica, en la mejora genética. En Panamá
se han desarrollado numerosos trabajos, pero sin seguir programas
estratégicos de mejoramiento genético y hasta el momento hay muy
pocos resultados publicados de los mismos.
En sentido general la técnica se basa seleccionar vacas altamente
valiosas genéticamente, como donadoras de embriones para la inducción
hormonal de ovulaciones múltiples y así obtener un número considerable
de embriones. Una vez realizada la estimulación, se procede a la
fecundación de los óvulos liberados. Luego de 7 días se realizará un
lavado del útero, para colectar los embriones y clasificarlos
morfológicamente. Los embriones aptos pueden ser transferidos a otras
vacas previamente sincronizadas o conservados por congelación para su
posterior transferencia. Generalmente los resultados son entre 4 y 6
embriones por donante superovulada y resultados de preñez de 50 y 70%
para embriones congelados o transferidos en fresco, respectivamente.

18. SUPEROVULACIÓN y TESUPEROVULACIÓN y TE

19. Existen numerosos esquemas de superovulación entreExisten numerosos esquemas de superovulación entre
los cuales podemos citar:los cuales podemos citar:
Inicio en fase media luteal o tratamiento convencional :
Sobre la base del diagnóstico transrectal de un CL, ya sea
con una sola dosis de PMSG o dosis múltiples de FSH (4 días
a intervalos de 12h), con la aplicación de PGF2α, 48h después
de la aplicación de PMSG o en la 6ta y 7ma aplicación en el
tratamiento con FSH.

20. Manipulación de la onda folicular (sin laManipulación de la onda folicular (sin la
necesidad de detección del celo):necesidad de detección del celo):
Con estradiol y progesterona
Por punción folicular
Aplicación de GnRH o LH
Estimulación de la 1ra
onda folicular
Estimulación de los folículos subordinados

21. Superovulaciones repetidas
Utilización de PMSG al final del tratamiento
superovulatorio
Una o dos aplicaciones de FSH
Formula de FSH de liberación lenta
Dos inyecciones de FSH en concentraciones
reducidas de hialuronato

22. No obstante a todo el desarrollo alcanzado en las
investigación es sobre superovulación, los resultados de la
misma son impredecibles y poco repetibles. De forma tal
que la misma es afectada por múltiples factores dentro de
los que podemos citar: nutrición, edad, raza, categoría,
estado lactacional, manejo, tipo de hormona empleada,
entre otros.
Estos factores son difíciles de controlar por el técnico,
frente al interés genético que pueda presentar el productor
por reproducir un animal en particular.

23. Producción de embriones in vitro.Producción de embriones in vitro.
Para poder producir embriones in vitro, primero tenemos que
conseguir la maduración de los ovocitos, la capacitación del
semen que vamos a utilizar para fecundar y después el
cultivo de los embriones obtenidos hasta estadios
preimplantatorios.
•Medio de maduración (TCM 199 + FSH)
•TALP hepes o gradientes de Percol (medios
para procesamiento del semen)
•Medio de fertilización (TCM 199 + heparina)
•Medio de desarrollo (TCM 199 + IGF1 y otros aditivos o
OSF)
Medios empleados en la FIV

24. La metodología para conseguir la fecundación in vitro es
la siguiente:
-Obtención de los ovocitos post mortem (ovarios de animales
sacrificados) o in vivo (aspiración folicular guiada por
ecografía).

25. Maduración de los ovocitos in vitro

26. Separación de fracción espermática
motil (swim up o gradientes de
percol) y capacitación in vitro de los
espermatozoides, bien procedentes
de semen fresco o de semen
congelado.

27. Inseminación in vitro de los ovocitos madurados en el
laboratorio con el semen capacitado. El tiempo de
inseminación varía dependiendo de la especie animal de que
se trate.

28. Cultivo in vitro, con una duración variable y dependiendo
de dónde se realice la transferencia de embriones: en el
oviducto (hasta el estadio de mórula), y en cuerno uterino
(mórula o blastocisto).

29. Dependiendo de la especie animal, los resultados son muy
variables, si bien en ovejas y vacas la fecundación in vitro
funciona bien, en la cerda, durante muchos años ha
presentado un gran problema como ha sido la polispermia en
la fecundación.
En contraste con la FIV de ovocitos colectados post mortem,
la FIV de ovocitos colectados in vivo por aspiración folicular
permite realizar colectas hasta tres veces por semana (cuatro
embriones por colecta 16 mensuales) y los costos de
producción son bajos y estables (solo la inversión inicial es
relativamente alta).
En general los resultados de maduración, fecundación y
cultivo in vitro de embriones, dejan mucho que desear, porque
no se superan unas cifras de nacimientos de animales
superiores al 40%

30. Congelación de ovocitos y embriones.Congelación de ovocitos y embriones.
En el caso de los bovinos, constituye una herramienta útil para la
industria de la transferencia de embriones, ya que el número de
embriones puede ser fácilmente correlacionado con el número
de receptoras disponibles en un momento apropiado del ciclo
estral. También posibilita la transferencia de algunos embriones
y la conservación del resto en bancos de germoplasma, hasta
poder analizar los registros de producción de la descendencia.
Por otra parte permite el intercambio comercial a largas
distancias con un material libre de enfermedades contagiosas si
estos son tratados adecuadamente. En la actualidad ya se han
logrado estabilizar protocolos que emplean congeladores
programables que ejecutan todo el procedimiento de congelación
lenta y permiten obtener resultados alrededor del 50% de
preñez después de la descongelación y transferencia directa sin
remoción del crioprotector., empleando como crioprotector
etilenglicol al 20% en PBS.

31. - 7 0
C
- 32 0
C
- 196 0
C
t 0
C
min.
3 6
seeding
0. 3 0
C / min.
5 min.
Equipo de congelación programable
- 7 0
C
- 32 0
C
- 196 0
C
t 0
C
min.
3 6
seeding
0. 3 0
C / min.
5 min.

32. La vitrificación:La vitrificación: Es otro procedimiento de criopreservación, en el
cual el embrión es sometido a una solución crioprotectora
altamente concentrada, que provoca una deshidratación drástica y
extrema. Esta solución con el embrión pasa de un estado líquido a
otro casi sólido, sin llegar a congelarse al ser introducida en N2
líquido. La descongelación se realiza de igual forma pero si es
imprescindible retirar el crioprotector del embrión, antes de su
transferencia, lo cual ha determinado el poco uso práctico de la
misma.

33. Es necesario acotar que los resultados de
gestación logrados con embriones producidos in
vitro son menores que los obtenidos por
superovulación (25 a 30%. vs 40 a 50%), por
tales razones se ensayan actualmente nuevos
protocolos que salven esta dificultad dado el
vertiginoso auge que está alcanzando la
producción de embriones por FIV.

34. Determinación y selección del sexo de embriones yDeterminación y selección del sexo de embriones y
espermatozoidesespermatozoides
Con las modernas técnicas de biología molecular y la identificación
de secuencias de ADN específicas del cromosoma Y en varias
especies de animales, se han logrado grandes avances para el
diagnóstico del sexo en embriones, logrando así, mantener la
viabilidad y un alto grado de precisión en embriones
preimplantatorios. Uno de los requisitos para el diagnóstico, es
obtener una pequeña biopsia del embrión, sin que este afecte su
desarrollo posterior. No obstante en su aplicación práctica, nos
enfrenta a un proceso ya consumado y que no podemos gobernar.

35. Sexado de espermatozoidesSexado de espermatozoides
Varios son los métodos de separación de espermatozoides y
podríamos resumirlos en dos: aquellos que intentan separar
espermatozoides sobre la base de sus características físicas o
cinéticas y aquellos que actúan sobre las diferencias nucleares de los
espermatozoides que transportan el cromosoma X o el Y. Para
separar espermatozoides es necesario conocer que el núcleo del
espermatozoide que transporta el cromosoma X es más grande y
contiene por tanto una mayor cantidad de ADN que el que transporta
el cromosoma Y.
Para el proceso en cuestión (citometría), el semen tiene que ser
teñido con un colorante fluorescente, el cual se unirá a cada
espermatozoide individual según su contenido de ADN. Se hacen
pasar luego a manera de una corriente o flujo muy delgado a través
de la máquina separadora, la misma utiliza un rayo láser, que ilumina
el colorante. Como el espermatozoide "X" contiene 3.8 % más de
ADN, éste atrapa más colorante y hace que resplandezca más
brillantemente.

36. Posteriormente una computadora clasifica los
espermatozoides en tres grupos:
1) los que llevan cromosoma "X",
2) los que portan "Y", y
3) una población mixta de portadores de "x" e "y"
que no pudieron ser clasificados con absoluta
claridad.
Aquél flujo fino de espermatozoides se fracciona
entonces en gotitas conteniendo un
espermatozoide cada una, pasando por un
dispositivo que les asigna una carga eléctrica + o
- , según la clasificación efectuada por la
computadora - . Se les hace pasar luego por un
campo magnético donde aquéllas con carga +
son atraídas hacia el lado - , y las que poseen
carga - lo son hacia el lado + . Una vez que han
sido separadas las fracciones, el semen puede
usarse en fresco (24 horas) o ser congelado.

37. La citometría, desarrollada por el Dr. Lawrence Johnson en
el año de 1992, consigna un 90 % de seguridad en el
sexado del semen.
Pero aún los resultados alcanzados en la IA, con semen
sexado son más bajos que los que se logran semen
convencional (se disminuye la tasa de preñez a la IA, entre
un 15 y 20%) y no se recomienda su uso para inseminación
de donadoras para la transferencia de embriones, pero ha
sido empleado con éxito en la FIV.

38. Micromanipulación de embriones para producir gemelosMicromanipulación de embriones para producir gemelos
idénticos y quimerasidénticos y quimeras
Esta 1ra técnica permite duplicar el número de embriones
disponibles y posibilita la inducción de partos dobles de igual
sexo, eliminando el riesgo del freemartinismo y le brinda al
productor una posibilidad de incremento en la tasa de
natalidad.
Estos animales genéticamente idénticos, tienen a su vez gran
importancia para el desarrollo de investigaciones sobre
comportamiento fisiológico, ya que los mismos son un material
difícil de obtener en la naturaleza

39. Existen diferentes formas en las cuales los embriones pueden ser
divididos satisfactoriamente y hay gran variación en las técnicas,
producto fundamentalmente de hábitos y experiencias individuales.
Estas técnicas pueden ser divididas en tres grupos, en relación con
el estadio de desarrollo con que se trabaje: Separación de
blastómeros, división de mórulas antes de la compactación y división
de mórulas compactas o blastocitos. Las principales diferencias
entre cada procedimiento se basan fundamentalmente en:
Instrumentos empleados y medios de cultivo (tanto para realizar la
manipulación, como para la conservación o cultivo).

40. Producción de quimeras:Producción de quimeras: Es otro ejemplo práctico del uso de
la micromanipulación en la obtención de individuos por
combinación o agregación de células de 2 ó más embriones,
es decir de 2 ó más pares parentales. Esta técnica resulta ser
el procedimiento inverso al realizado en la producción de
individuos idénticos u homocigóticos.

41. Las quimeras como hemos planteado tienen tejidos de cada
embrión que la originó, por lo cual poseen cuatro ó más padres.
A su vez si uno de los embriones originales era hembra y el otro
macho, el sexo de la quimera resultará indudablemente macho.
Desgraciadamente los tejidos que se desarrollan de cada
embrión, no pueden ser hasta ahora controlados, de aquí que la
contribución de cada embrión original es usualmente desigual y
no es raro obtener un 5% proveniente de un animal y un 95% del
otro. Por esta razón son empleados en la actualidad solo para
lograr transgénicos quiméricos.

42. Clonación:
Clonar significa crear un ser vivo idéntico a otro, a partir de una
célula del individuo original. Hasta hace poco tiempo, los únicos
clones que se podían obtener en el laboratorio eran los de células
embrionarias. Todas las células o blastómeros que componen un
embrión son totipotentes, capaces de regenerar todo el embrión y
todas contienen la misma información genética. Cuando llegan al
estadio de blastocisto, es cuando comienza la diferenciación celular,
ya que las células del trofoblasto darán lugar a la formación de la
placenta y las otras, las llamadas del nódulo embrionario o de la
masa celular interna, son las que originaran el ectodermo,
mesodermo, y el endodermo. Éstas son células diferenciadas y
darán lugar a la formación del órgano o tejido para el cual están
programadas. Para poder formar clones los requisitos mínimos son:
núcleo de una célula donante y ovocitos previamente enucleados.

43. La clonación de células somáticas por transferencia nuclear (TN), ha
permitido la propagación de animales élites y la generación de
animales transgénicos para fines agrícolas y biomédicos. La TN
implica la enucleación de un ovocito receptor, seguido de la fusión
con una célula donante del núcleo. Luego su activación para
continuar su desarrollo hasta estadios transferibles. Esto ha sido
logrado por múltiples autores en ovejas, cabras y vacas, entre otras
especies. Factores como métodos de enucleación, fusión,
activación, tipo de célula donante, sincronía del ciclo celular donante/
receptora influyen en los resultados de la TN, los cuales a un
resultan en una baja supervivencia de los embriones y los fetos
clonados.

44. Las principales técnicas de clonación son:
- Por separación de blastómeros en los
embriones
-Por transferencia nuclear, que fue
el método utilizado para clonar a la
oveja Dolly.
-Agregación de embriones clonados
para incrementar los resultados de
preñez.
La clonación por TN es hoy una realidad pero aún hay mucho por
investigar en cuanto a incrementar la eficiencia de las técnicas,
resultados de preñez y sobrevida de los fetos producido, así como
trastornos en su desarrollo hasta adultos.

45. Empresas dedicadas a la
clonación comercial de
animales:
•Genetic Savings & Clone
• RNL Bio
• Cyagra
•AdvancedCell
Technology.
• Viagen, entre otras.
CRONOLOGÍA DEL DESAROLLO DE LA
CLONACIÓN ANIMAL
Rana: 1952
Carpa: 1963
Ratón: 1986, 1991 y 2007
Oveja: 1986, de células secundarias, 1995, de
células diferenciadas de un embrión, 1996, Oveja
Dolly.1997, clones trangénicos, Polly y Molly.
Macaco Rhesus: 2000
Cerdo: 2000, 5 cerdos escoceses
G bovino aur: 2001, Noah.
Bovino : 2001, 2002,
Gato 2001, 2004, 2007, 2008
Conejo: 2003, Francia y Corea del Norte.
Mula: 2003,
Venado: 2003
Yegua: 2003
Rata: 2003
Mosca de fruta: 2007
Perro: 2005
Camello: 2009
Toro de lidia: 2010

46. Bisección y selección del
citoplasma receptor * *
Pareo celular
1st
and 2nd
Fusión
Eliminación del cumulus y zona
pelúcida * **
Activación, cultivo
y transferencia

47. Transgénesis
La transgénesis que significa la introducción de ADN exógeno
en el genotipo de un animal, es una herramienta importante
tanto para la agricultura, como para la farmacología, la
biomedicina y la biotecnología. Una gran variedad de métodos
han sido desarrollados para introducir ADN, entre ellos la
inyección de ADN en embriones y la transfección de células
somáticas seguidas del transplante nuclear o clonación.
Las técnicas de trangénesis permitirán la creación de fenotipos
totalmente novedosos, que confieren a las especies de interés
zootécnico características beneficiosas para la producción,
tales como la resistencia a enfermedades, una mayor eficiencia
en la obtención de energía, o la producción de proteínas de
interés industrial o biomédico entre otras.

48. Bisección y selección del
citoplasma receptor * *
Pareo celular
1st
and 2nd
Fusión
Eliminación del cumulus y zona
pelúcida * **
Activación, cultivo
y transferencia

49. Microinyección de ADN exógeno en los pronúcleos:
Ha demostrado ser útil en especies de importancia
zootécnica, pero presenta dificultades en el bovino por
la baja visualización de los pronúcleos
Transgénesis por clonación (TN): Esta tecnología ha
ido reemplazando a la anterior y se han aprovechado
las células somáticas de los animales transgénicos
para ser estos clonados por TN.
Inyección intracitoplasmática de células o
espermatozoides transfectados con ADN foráneo
seguido de inseminación: Esta técnica posee un alto
índice de mosaisismo y puede que el transgen quede
extracromosómico y no integrarse al ADN del embrión.
Inyección intracitoplasmática de espermatozoides:
Se microinyecta un espermatozoide o una célula trans-
fectados con ADN foráneo, pero es indispensable la
posterior activación para el inicio de las divisiones ya
sea por estímulos físicos o químicos.

50. Transferencia de genes por microinyección
citoplasmática de células o fragmentos:
La inyección intracitoplasmáticamente en ovocitos
en metafase II, de células somáticas o frag-
mentos de ellas previa coincubación con ADN
externo y luego al someter los ovocitos a FIV
se pueden lograr embriones que expresen el
transgen. La eficiencia es aceptable pero hay gran
cantidad de mosaisismo.
En la actualidad se están desarrollando trabajos que han logrado
clonar incluso células gaméticas (ovocitos y embriones), lo cual sin
dudas permitirá elevar la eficiencia de la transgénesis disminuyendo el
frecuente mosaisismo encontrado, de forma tal que ambos gametos
puedan portar el transgen deseado.
Las aplicaciones de estas tecnologías están solo limitadas por
nuestras capacidades de imaginación e innovación. Por tales razones
podemos decir que están abiertos nuevos caminos hacia el futuro.

51. Vaca clonada con genes humanos produce leche similar a la materna
“Rosita” provee de leche compuesta con dos proteínas de alta
importancia para la nutrición de los lactantes

52. ConclusionesConclusiones
• El empleo de todas estas biotecnologías reproductivas, va
estar condicionado a la posibilidad de constar con la
infraestructura necesaria y el personal capacitado para
ejecutarlos.
• Resulta indispensable que nos preocupemos realmente por
buscar los fondos requeridos para poder implementar aquellas,
que nuestro sector pecuario necesita en la brevedad posible
para poder enfrentar los retos del presente siglo y finalmente
salir airosos con una ganadería altamente productiva.
• A pesar de disponerse en la actualidad de un gran parque de
biotecnologías reproductivas listas para su empleo en la
producción pecuaria, nos queda mucho por investigar para
elevar sus resultados, hacerlas sostenibles y evitar los
problemas éticos que su aplicación pueden provocar.