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1. Mg.Sc. Blgo. LUIS GUZMÁN MASIAS INSTITUO PERUANO DE BIOLOGÍA MOLECULAR [email_address] PCR en Tiempo Real

2. Uso de PCR en tiempo real en publicaciones indexadas (Medline)

6. POR QUÉ PCR EN TIEMPO REAL ESTÁ DESPLAZANDO AL PCR ESTANDAR? QUE VENTAJAS PRESENTA EL PCR EN TIEMPO REAL?

7. PCR Standard vs. PCR Tiempo Real Análisis de punto final Detección del producto por Electroforesis en gel Análisis de la cinética de la reacción Detección del producto en cada ciclo de la reacción

10. Beacons moleculares El Fluoróforo emite señal cuando el agente bloqueador (Quencher) se encuentra alejado por efecto de la hibridación a la secuencia target

11. TaqMan PCR : generación de señal por hidrólisis de sonda. FAM : maxima emisión a 535 nm TAMRA : máxima absorción a 560nm

12. FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer

13. HARDWARE & SOFTWARE SOFTWARE

16. “ FASE PLATEAU” Sin embargo, reacciones con diferentes numero de copias iniciales llegan al mismo nivel de “plateau”

18. EFECTO DE LA EFICIENCIA EN LA CANTIDAD DE PRODUCTO OBTENIDO

20. CANTIDAD DE DNA (escala aritmética) vs. NUMERO DE CICLOS Los productos de amplificación no se detectan en los primeros ciclos porque están por debajo de la escala utilizada. Recién se observa la curva en los últimos ciclos hasta llegar a la fase de plateau.

21. CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS Se observa diferencias ya desde los ciclos iniciales. Relación como línea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción logarítmica.

22. Escala aritmética

23. La misma reacción de PCR en escala logaritmica - se aproxima a la gráfica teórica. Según las curvas teóricas, se debe obtener una línea recta en la parte lineal de la reacción de PCR. En este caso entre ~20 a ~1500 unidades de fluorescencia arbitraria.

24. Analizando la misma región en una escala regular (aritmética), veremos que la parte lineal es la primera parte de la curva. IMPORTANTE: se debe examinar la reacción de PCR mientras se encuentra en la fase lineal.

25. Para cada muestra, el software determina en qué ciclo, el valor de la fluorescencia emitida cruza la linea arbitraria (Threshold). Este punto se denomina C T (Ciclo crítico / Threshold cycle). Este v alor es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas específicas en la muestra original. Valores de Threshold & C T

26. NTC: tubo control sin DNA templado RUIDO CONTROLES DE REACCION : ELIMINACION DE RUIDO

27. Es importante que el threshold este en la parte lineal de la reacción. Esto se ve mas facilmente en la grafica logaritmica. Aún cuando el threshold estará cerca al fondo de la curva regular, deberá ser lo suficientemente alto para que los valores de fluorescencia sean debido a la amplificación y no al ruido. Grafica regular Grafica semi-logaritmica

28. Cuantificación de DNA o cDNA (colocando diluciones de la misma muestra) A menor concentración de la secuencia target en la muestra inicial, se necesitará mas ciclos para ser detectada, por lo tanto se obtienen valores de C T mayores para muestras mas diluidas .

29. El Plot de valores Ct de las diluciones vs. concentración resulta en una gráfica lineal, y debe presentar un alto coeficiente de correlación (>0.990).

31. CURVA DE DENATURACION Muesta el perfil de denaturación de los productos amplificados. (no se observan productos inespecíficos)

32. Una temperatura de denaturación diferente significa un producto diferente. Dímeros: menor temperatura de fusión. dímeros

35. APLICACIONES EN INVESTIGACION DNA : - Identificación de genes de virulencia o de resistencia a drogas - Genotipificación de cepas o subespecies - Detección de mutaciones puntuales - Estudio de de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) - Cuantificación del número de copias por célula, o determinación de células iniciales en una muestra. RNA : - Detección de la expresión de genes - Efecto de mutaciones sobre la expresión - Análisis de mRNAs variantes producidos por procesamiento diferencial - Cuantificación de la expresión

38. DETECCION DE SNPs o DE MUTACIONES PUNTUALES

39. Células Madre y su diferenciación a Linaje Neuronal: Ejemplo de Cuantificación Relativa

41. La herencia epigenética es regula procesos como proliferación y diferenciación celular manteniendo estados transcripcionales (Modificada de Mohrmann y Verrijzer 2005) (Turner 2002) Modificación de la cromatina por complejos multi-ptoteícos que hidrolizan ATP Modificaciones covalentes de las histonas nucleosómicas ATP ADP NUCLEOSOMA

43. RNA interferencia 30 min en hielo y cultivo

44. Análisis de Melt

45. ACTINA OSA1 End-Point

47. Curva patrón BCR-ABL CUANTIFICACION ABSOLUTA Translocación (9,22) Segunda Derivada

49. Real Time PCR ejemplo de detección en embarazadas a partir de la sexta semana