Teks tersebut membahas tentang kloning, prinsip dasar kloning pada tanaman dan hewan, serta teknik kloning seperti transfer inti sel, amplifikasi DNA menggunakan PCR, dan introduksi DNA rekombinan ke dalam sel inang.

2. Kloning: usaha/upaya untuk
memproduksi sejumlah individu
yang secara genetic sama persis
(identik).
Prinsip: bahwa setiap makhluk
hidup mempunyai kemampuan
totipotensi yang artinya setiap sel
mempunyai kemampuan untuk
menjadi individu.
klon : sekelompok organisme hewan
maupun tumbuh-tumbuhan yang
dihasilkan melalui reproduksi
aseksual dan berasal dari satu induk
yang sama.

3. Kloning pada tanaman melalui kultur sel mula-
mula dilakukan pada tanaman wortel. Sel akar
wortel dikultur, dan tiap selnya dapat tumbuh
menjadi tanaman lengkap.
Kloning pada hewan dilakukan mula-
mula pada amfibi (kodok), dengan
mengadakan transplantasi nukleus ke
dalam telur kodok yang dienukleasi.
Sejak Wilmut et al. berhasil membuat klon anak domba yang donor
nukleusnya diambil dari sel kelenjar susu domba dewasa, terbukti bahwa
pada mammalia pun klon dapat dibuat. Karena itu, kesimpulan mereka
manusia pun secara teknis klon dapat dibuat.

4. Transfer Nukleus
membutuhkan dua sel :
1. suatu sel donor.
2. suatu oosit atau sel telur. Telur matur
sebelum dibuahi dibuang intinya atau
nukleusnya.
sel telur akan berfungsi terbaik
bila hanya dalam anfertilisasi.
inti sel donor bertindak sebagai inti sel
zigot dan membelah serta berkembang
menjadi blastosit.
Blastosit selanjutnya ditransfer ke dalam uterus
induk pengganti (surrogate mother).

5. Suatu nukleus dewasa ternyata
mampu memproduksi suatu
hewan yang komplit
Kasus kloning
domba dolly
Tanpa sinkronosasi siklus sel,
maka inti tidak akan berada
pada suatu keadaan yang
optimum untuk dapat diterima
oleh embrio.
Sel donor harus
berjuang untuk
dapat masuk ke Gap
Zero, atau stadium
sel GO, atau stadium
sel dorman.
Teknik Honolulu
Juli 1998, tim ilmuwan dari Universitas Hawai
mengumumkan bahwa mereka telah
menghasilkan tiga generasi tikus kloning yang
secara genetik identik.
Tikus susah untuk dikloning,
karena segera setelah suatu
sel telur tikus mengalami
fertilisasi ia akan segera
membelah.
Awalnya menggunakan tiga tipe sel yakni,
sel Sertoli, sel otak dan sel kumulus. Sel
Sertoli dan sel otak keduanya tinggal dalam
stadia GO secara alamiah dan sel kumulus
hampir selalu hadir pada stadia G0 ataupun
G1.

6. Enzim yang dapat memotong ikatan fosfodiester untai
DNA asing pada sekuen pengenalan yang spesifik.
Isolasi dari bakteri
Enzim endonuklease
restriksi
Berupa DNA kromosom yang diisolasi dari inti sel ataupun DNA
komplementer yang diperoleh dari penyalinan mRNA dengan
bantuan enzim reverse transcriptase, disebut complementary DNA
(cDNA) .
Sumber DNA
Wahana pembawa fragmen gen target ke dalam suatu sel inang.
Persyaratan: harus mampu disisipi DNA asing, dapat diintroduksi ke
dalam sel inang, dapat bereplikasi secara independen di dalam sel
inang, dan memiliki penanda seleksi
Vektor
mudah dimanipulasi, mampu tumbuh dengan cepat
dan stabil pada medium kultur biasa, non-patogen,
serta dapat ditransformasi DNA asing.
Contoh : Escherichia coli, Bacillus subtilis
Enzim yang mengkatalisis reaksi pembentukan kembali ikatan
fosfodiester antara potongan fragmen DNA atau RNA berujung
kohesif yang saling berkomplemen hasil pemotongan dengan
enzim restriksi .
Sel inang
Enzim ligase

7. 1. Amplifikasi
fragmen gen target
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan teknik amplifikasi sekuen DNA
spesifik secara in vitro dengan proses pemanjangan primer pada untai DNA
komplementer .
Reaksinya terdiri atas sejumlah komponen essensial
(enzim DNA polimerase yang termostabil, sepasang oligonukleotida spesifik yang
berperan sebagai primer, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), kation divalen, kation
monovalen, buffer, serta DNA cetakan).
Sekuen primer membatasi daerah fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi
Enzim DNA polimerase akan menginisiasi sintesis salinannya

8. Syarat untuk desain primer yang baik antara lain
panjang primer sekitar 17--28 basa, memiliki
kandungan basa GC 40--60%, pada ujung 3’
terdapat basa G atau C, temperature of melting
sekitar 55--80° C, dan tidak terjadi self-
complementarity.
Reaksi PCR ditempatkan pada mesin thermal cycler yang dapat
mengatur suhu sesuai dengan tiga tahapan dalam siklus PCR.
Tahap awal reaksi PCR merupakan pemisahan untai ganda DNA
(denaturasi) yang dilakukan pada suhu 95° C, dilanjutkan dengan
pemasangan basa primer dengan untai tunggal DNA cetakan
(annealing) pada suhu sekitar 50--65° C, kemudian pada suhu 72°
C, berlangsung sintesis untai DNA baru oleh enzim DNA
polimerase (Fairbanks & Andersen 1999: 278). Setiap siklus pada
PCR menghasilkan 2 salinan untai ganda fragmen target
Kedua hasil salinan DNA target dari setiap siklus akan
menjadi cetakan bagi siklus berikutnya sehingga reaksi
PCR dengan 30 siklus dapat menghasilkan jutaan
fragmen DNA target

9. Penyisipan fragmen DNA ke
dalam vektor
Penyisipan fragmen DNA atau gen
target ke dalam DNA vektor untuk
membentuk molekul DNA
rekombinan melibatkan tahap
digesti dan ligasi.
Vektor dan sisipan didigesti dengan
enzim restriksi yang sama sehingga
keduanya memiliki potongan kohesif
(sticky ends) serupa yang akan saling
berlekatan.
Enzim ligase mengkatalisis proses
perlekatan basa-basa nukleotida yang
saling berkomplemen.

10. Introduksi vektor
rekombinan ke
dalam sel inang
Introduksi vektor rekombinan ke dalam sel inang
Introduksi DNA vektor plasmid yang mengandung gen
sisipan ke dalam sel inang bakteri disebut transformasi,
sedangkan introduksi vektor virus dinamakan
transfeksi). Sel inang terlebih dahulu dibuat menjadi
kompeten sebelum dilakukan proses transformasi
sehingga menjadi permeabel terhadap DNA asing.
Sel kompeten dibuat dengan
memberikan perlakuan fisik atau
kimia yang akan meningkatkan
kemampuan sel untuk mengikat
dan mengambil DNA.
Proses introduksi DNA ke dalam sel terjadi
pada saat pemberian kejutan panas
terhadap sel kompeten dan DNA dengan
menaikkan suhu inkubasi secara drastis dari
0° C menjadi 42° C selama sekitar 1--2
menit.Parameter keberhasilan proses transformasi
ditentukan dengan nilai efisiensi transformasi yang
tinggi. Jumlah koloni transforman yang tumbuh
pada permukaan medium seleksi dihitung,
kemudian dimasukkan dalam perhitungan efisiensi
transformasi. Nilai efisiensi transformasi optimal
metode CaCl2 adalah 106 cfu/µg.

11. Seleksi hasil kloning
Melalui proses seleksi, koloni transforman
yang membawa DNA rekombinan target
(berhasil dikloning) dapat dibedakan dari
koloni transforman yang tidak membawa
DNA target.
Dilakukan dengan sejumlah metode, seperti
hibridisasi DNA probe, hibridisasi antibodi
monoklonal, dan seleksi nutrien

12. Menghasilkan
bibit unggul
Bertujuan untuk
terapi penyakit
Menolong
pasangan infertil
agar mempunyai
keturunan
Mencegah
kepunahan spesies
Modifikasi
Pangan
Tidak dibenarkan untuk
-- Kloning untuk reproduksi
manusia
-- Membuat manusia duplikat
-- Implantasi sel manusia
-- Kecuali untuk terapi kloning