Vida útil leche procesada

Almacenamiento y vida útil de leche procesada

CAPITULO V

ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL DE LECHE

5.1 INTRODUCCION

Últimamente, ha habido un aumento en el interés,
principalmente en los países más desarrollados, en aumentar la vida
útil de leche pasteurizada, teniendo en cuenta que la leche ulta hight
temperature (UHT) disponible en el mercado presenta un fuerte sabor
cocido, preferido por el consumidor (SARKAR, 1999).

Se sabe que la leche UHT desarrolla un sabor cocido que es
considerado inaceptable por algunos consumidores (MAUBOIS, 2002).
CROMIE (1991) define vida útil como el periodo de tiempo entre el
procesamiento y el punto en el cual el producto se torna inaceptable
para el consumidor, siendo que, para leche pasteurizada, un conteo
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microbiano de aproximadamente de 10 células/mL es,
frecuentemente, asociada con este punto de no aceptación.

Vida útil expresado es el periodo de tiempo antes de que la
calidad de un producto puede tornarse un problema potencial de
salud publica, siendo que, dentro de las razones para esta perdida de
calidad del producto, se incluye el desarrollo microbiano y los
defectos sensoriales relativos al sabor y olor originales de la
degradación de vitaminas (ASIA PACIFIC FOOD INDUSTRY, 1997).

El termino extended shelf life (ESL) ha tenido, recientemente,
varios parámetros de definición, siendo claro que ello se refiere a un
aumento en la vida anaquel de un producto alimenticio, sin

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Alberto L. HUAMANI HUAMANI 13
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comprometer su calidad (EXTRAORDINARY DAIRY, 2001). La
tecnología ESL está bien establecida en América del norte y viene
creando una nueva categoría de leche fluida entre fresco y el UHT
(CLARKE, 1998). “tiempo que la leche permanece sin cambios
indeseables aparentes”

5.2 FACTORES QUE INFLUENCIAN LA VIDA EN ANAQUEL
DE LA LECHE FLUIDA

La leche de vida en anaquel extendida (VPE) es un producto que
tiene alta calidad y seguridad por, en el mínimo, 30 días después el
procesamiento, estando normalmente ligado a un procesamiento
térmico que elimina patógenos y reduzca significativamente la carga
bacteriana inicial, debiendo ser controlado la temperatura adecuada
de refrigeración (EXTRAORDINARY DAIRY, 2001).

Según SARKAR (1999), la mejora en la calidad microbiana de la
leche fresca natural para la producción de leche pasteurizado con vida
en anaquel larga, puede ser benéfico económicamente para
productores y consumidores debido a una reducción en los costos de
producción y distribución.

CROMIE (1991) cita cinco factores principales que afectan la
calidad microbiológica de la leche pasteurizada y, consecuentemente,
su vida en anaquel, siendo lo siguientes:

9 Calidad microbiológica de la leche fresca
9 Temperatura de pasteurización (TT)
9 Contaminación post- pasteurización
9 Microorganismos termorresistentes

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9 Temperatura de almacenamiento del producto después de
pasteurización
9 Envases

5.2.1 Calidad microbiológica de la leche fresca

La calidad de la mayoría de los productos lácteos está
relacionada directamente con la calidad microbiana de leche cruda
utilizada como materia prima. Dependiendo de la temperatura, de las
condiciones y la extensión de almacenamiento de la leche, varios
grupos de los microorganismos pueden pasar por un periodo de
crecimiento intensivo, produciendo altas concentraciones de enzimas,
particularmente lipasa y proteasas. Dentro de estos grupos destacan
los microorganismos psicrófilos, (BURTON, 1988) que, sin embargo
son destruidos por esterilización, estas producen enzimas
proteolíticas y lipolíticas resistentes al calor. Estas enzimas son
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producidas cuando la población de bacterias alcanza 10 UFC/mL o
más, y se desarrollan en residuos o depósitos de leche, equipos y
tuberías mal higienizadas (CELESTINO et al., 1996).

5.2.2 Tratamiento Térmico

Diversos pares de temperatura y tiempo de pasteurización son
aplicados legalmente en diversos países. La legislación establece que
la pasteurización de leche fluida para consumo debe cubrir la
aplicación de un binomio de temperatura y tiempo de 72-75ºC/15-20
s, capaz de eliminar 100% de las bacterias patógenas y 99,9 % de
los microorganismos banales. La pasteurización debe ser hecha en
intercambiador de calor de placas, dotados de panel de control con
termoregistrador y termorregulador automático y válvula automática

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de desvío de flujo, termómetros y tornerías de prueba, seguido de
enfriador automático en equipo de placas hasta la temperatura igual
o inferior a 4ºC y cerrado del envase en línea.

De acuerdo con BOOR (2001), la pasteurización rápida (72ºC /
15 segundos) es el tratamiento térmico mas utilizado en leche para
destruir microorganismos patógenos no formadores de esporas y
resistentes al calor, específicamente el Mycobacteirum tuberculosis y
la Coxiella burnetti.

Según MUIR (1996), la manera mas efectiva y simple de
reducir el numero de bacterias en la leche es aplicando un
tratamiento térmico. Entretanto, la eficacia de tratamientos térmicos,
el más ampliamente empleado es la pasteurización que, no obstante
elimina completamente las bacterias patogénicas de la leche, no
elimina esporos de bacterias psicrotroficas, principalmente bacilos,
dentro los cuales, B. cereus, B. circulans y B. mycoides que son
capaces de desarrollarse en productos refrigerados.

SCHMIDT et al. (1989) investigaron variaciones de la
temperatura de pasteurización de la leche entre 72-88ºC/15 s, en
embalajes asépticas y almacenados a las temperaturas de 3ºC y 7ºC
y concluyeron que la vida útil de la leche pasteurizado no aumentaron
con el aumento de la severidad de la temperatura de pasteurizado
encima de 72ºC/15 s, y el sabor de la leche fue perjudicado. Con
relación a la textura y apariencia, las mismas no fueron afectadas.

CROMIE (1991), verificó una disminución en la vida anaquel de
leches pasteurizadas a temperaturas más elevadas y almacenadas a
temperatura de 3ºC, y verificó que el conteo microbiano inicial de

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esas leches fue menor y que, al final de la vida en anaquel, esos
conteos fueron mayores. Para el autor, factores como la distribución
del sistema antimicrobiano natural de la leche, la activación de
esporas y la menor competición de otras bacterias, pueden ser
sugeridas para explicar que el tratamiento térmico más severo de la
leche puede aumentar el crecimiento de bacterias.

Según VATNE & CASTBERG (1991), la baja de temperatura de
pasteurización de 72-75ºC/15 s puede limitar el sabor cocido e
inactivar la microflora Gram negativa, entretanto, si la temperatura
de pasteurización fuera aumentado arriba de esto y las temperaturas
de distribución fueran elevadas, la calidad podría disminuir.

De acuerdo con MARTH (1998) el almacenamiento de alimentos
puede reducir la población microbiana, y el grado de reducción
depende de la magnitud del tratamiento térmico (tiempo X
temperatura), siendo la pasteurización el método mas comúnmente
usado para destruir células vegetativas de patógenos.

Durante el proceso de pasteurización de la leche a 72º-75ºC/15
s las células vegetativas son destruidas, con excepción de algunos
termoduricos y esporos estables al calor, que, encontrando
condiciones favorables de desarrollo, irán germinar y multiplicarse en
leches pasteurizadas (CARDOSO, 2000).

Para VATNE & CASTBERG (1991), la temperatura de
pasteurización en el rango de 80 a 90ºC puede estimular el
crecimiento de esporos, disminuir el efecto inhibitorio de compuestos
antimicrobianos y producir mas rápidamente factores de crecimiento
para las células.

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HILL (1988) recomienda para leche ultra-pasteurizada una
temperatura de 137,8º C o superior, durante 2 s, siendo que el
producto resultante no es comercialmente estéril, más bien
representa vida en anaquel superior a condiciones de temperatura
baja refrigeración. En contrapartida, la esterilización en ultra – alta
temperatura se refiere a una leche tratado a temperaturas que varían
entre 135 a 150ªC, durante 1 a 5 s, siendo el producto
comercialmente estéril, acondicionado asépticamente, pudiendo ser
almacenado sin refrigeración.

5.2.3 Contaminación pós-pasteurización

La contaminación pos-pasteurización es el principal factor
limitante para el mantenimiento de la calidad de la leche pasteurizada
(MOTTAR & WAES, 1986). De acuerdo con CROMIE (1991), el
crecimiento de bacterias psicrotroficas Gram negativas limita la vida
útil de la mayoría de las leches pasteurizadas comerciales, siendo las
Pseudomonas la más comúnmente encontradas, pudiendo ser
encontradas otros tipos como Enterobacter, Klebsiella e
Flavobacteium. También, según CROMIE
(1991), esos microorganismos son comunes en leches
fresca cruda, mas no sobreviven a la temperatura de
pasteurización, siendo la presencia de este resultado de una
contaminación despuésdel tratamiento térmico.

Según CROMIE (1991), los cinco principales factores que
influencian en el incremento de la vida en anaquel de leche
pasteurizada son la temperatura de almacenamiento del producto
después la pasteurización; la presencia y actividad de contaminantes
pos- pasteurización; los tipos y actividades de microorganismos

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resistentes a la pasteurización, particularmente aquellos capaces de
desarrollarse a la temperatura de refrigeración; la temperatura de
pasteurización y la calidad microbiana de la leche fresca cruda.

Para VATNE & CASTBERG (1991), la contaminación pos-
pasteurización consiste de higiene personal y contaminación del aire.
El principal factor relacionado a la higiene personal es la esterilización
de toda superficie de contacto del alimento que no debe ser tocada
por la mano. En relación a los microorganismos del aire, estos tienen
poca influencia en el mantenimiento de la calidad, desde que las
temperaturas de distribución estén entre 8-10ºC. Estudios de
contaminación del aire muestran que 85% de los microorganismos
presentes son bacterias Gram positivas (Micrococcus e
Corynebacterium 10% son hongos y 5% son levaduras (FREDSTED et
),
al., 1995). De acuerdo con BAKER (1983), a mayor fuente de
contaminación de la leche se da durante la colocación en maquinas
envasadoras, y si los cuidados no fueron observados, la vida en
anaquel de la leche puede ser perjudicada.

5.2.4 Microorganismos termo-resistentes

Para ANDERSSON et al. (1995) el B. cereus viene causando
grandes problemas en la industria de productos lácteos. Si la leche no
es contaminada después la pasteurización, el mantenimiento de la
calidad es determinada por el número de células/ esporos de B.
cereus en el producto, que puede causar separación de la capa de
grasa (lecitinase), bien como ser responsable de la formación de la
cuajada suave (sin reducción de pH) ambos en leche pasteurizado
homogenizado y no homogenizado y almacenado a baja temperatura
de refrigeración.

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Según CARDOSO (2000), el genero Bacillus representa
capacidad de formar esporos altamente resistentes al calor y capaz
de sobrevivir y se desarrolla en condiciones ambientales adversas.

De acuerdo con MOTTAR & WAES (1986), si la leche
pasteurizada fue producido sin contaminación pos-pasteurización,
puede ocurrir problemas a la temperatura normal de
almacenamiento, particularmente durante el verano, debido a la
presencia de un elevado número de B. cereus.

En estudio comparativo hecho por CROMIE (1991) con leches
contaminados con Pseudomonas y Bacillus, fue verificado que leches
contaminados con Pseudomonas se deterioran después de 120 h o 5
7
días (10 ufc/mL), en cuanto que leches contaminadas con B.
7
circulans (10 UFC/mL) pueden deteriorarse a 300 h o 12,5 días. Las
bacterias del género Pseudomonas producen enzimas
extracelulares que degradan la proteína y la grasa de la leche
causando sabor indeseable, ya el B. coagulans es acidificante
produciendo ácido láctico a partir de la lactosa y los B. cereus
producen enzimas que actúan en los glóbulos grasos de la grasa de la
leche causando sabor amargo y rancio.

5.2.5 Temperatura de almacenamiento y distribución

La temperatura del envase y almacenamiento de leche procesado
son extremadamente importantes en la determinación de vida en
anaquel del producto, habiendo sido comprobado que el aumento de
5ºC podrá disminuir a la mitad la vida útil de la leche (JANZEN et al.,
1981). GRIFFTHS & PHILLIPS (1986) afirman que temperaturas

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debajo de 7ºC son preponderantes para alargar la vida en anaquel de
la leche.

De acuerdo con SCHMIDT et al. (1989), la temperatura de
almacenamiento de la leche después la pasteurización y el embalaje
aséptico son los principales factores relacionados con el aumento de
la vida en anaquel del producto. A pesar según los autores, leches
almacenadas a 3ºC tuvieron una media de 21 días más de vida útil
que leches almacenadas a 7ºC.

Con relación a la seguridad y calidad de la leche fresca, el
tiempo y la temperatura de distribución son factores determinantes.
La tasa de deterioración es duplicada para cada aumento de 2ºC en la
temperatura (Cuadro 1) (VATNE & CASTBERG, 1991).

Tabla 5.1: Efecto da temperatura de almacenamiento en la vida útil
de leche pasteurizado.
Temperatura de Vida útil (días)
almacenamiento ºC
2 40
4 20
6 10
8 5
10 2,5
12 1,25
Fuente: VATNE y CASTBERG (1991).

Según SMITHWELL & KAILASAPATHY (1995) la temperatura
deberá ser mantenida a menos de 4ºC durante todo el tiempo en la
cadena de distribución para reducir el desarrollo de psicrotrofos. Los
autores consideran esencial la existencia de monitores precisos de
temperatura dentro del sistema de distribución, no solo para registrar

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la temperatura del proceso, como también para grabar alguna
fluctuación en la temperatura arriba de la temperatura patrón de 4ºC.

Para MARTH (1998) la fase log microbiana y el tiempo de
generación aumentan con la disminución de la temperatura de
almacenamiento, conforme es mostrado en la Cuadro 2.

Tabla 5.2: Fase log y tiempo de generación de Listeria
monocytogenes en productos lácteos fluidos a varias
temperaturas.
Tiempo de generación
Temperatura Fase lag (h) (h)
4 120 –144 33,3 – 36,3
8 24 –48 10,6 – 13,1
13 10 5,8 – 6,0
21 5 1,7 – 1,9
Fuente: MARTH (1998).

El enfriamiento rápido a 7ºC o menos y el no interrumpimiento de
la cadena de frio son importantes después de la pasteurización,
debiendo mantenerse una supervisión regular de las temperaturas en
la industria y durante la distribución (MOTTAR & WAES, 1986).

Para CROMIE (1991), cualquiera que sea la razón, el
almacenamiento de la leche a temperaturas elevadas, esto muestra
efecto negativo, cuando se desea una mayor vida útil del producto.

Una gran ventaja de los sistemas asépticos y permitir la
comercialización delproducto a la temperatura ambiente.
Caso contrario, sería antieconómico tener que utilizar
distribución y/o almacenamiento refrigerada para alimentos de este
tipo. Así mismo, es importante considerar el efecto exponencial de
la temperatura

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sobre las transformaciones en el alimento, bien como su influencia en
el incremento de la permeabilidad del envase.

A pesar de los alimentos obtenidos por los sistemas asépticos
serán microbiológicamente estables a la temperatura ambiente,
dejarlos en los ambientes frescos, fuera de la exposición solar, o
mismo refrigerados, se toma una buena opción para ampliar su vida
útil (FARIA, 1993).

La leche que posee una buena concentración elevada de
proteasas termorresistentes se deteriorará más rápidamente a
temperaturas superiores. Se sugiere, por tanto, que 18ºC sea
considerado como la temperatura máxima permitida durante el
almacenamiento de la leche UHT. Sin embargo, el producto
comercializado, especialmente en países de clima tropical, llega
fácilmente a temperaturas superiores al valor mencionado (SHEW,
1981).

La temperatura es el factor ambiental que más afecta la
conservación de los alimentos durante el almacenamiento y
comercialización. Todas las alteraciones de naturaleza biológica o
físico-química presentan tasas de transformaciones que varían con la
temperatura ambiente. La relación existente entre la temperatura y la
velocidad de transformación en un producto puede ser expuesta por
el valor Q10, definido como la razón entre la velocidad de la reacción a
la temperatura (T +10ºC) y la velocidad de reacción a la temperatura
T; o sea, Q10 representa el aumento de la velocidad de las reacciones
cuando la temperatura del sistema aumenta 10ºC. el efecto de la
temperatura sobre la estabilidad de los alimentos es basado en la
teoría de Arrhenius (FARIA, 1993).

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5.2.6 Barrera del envase al oxigeno y luz.

El tamaño y formato del embalaje también interfieren en la
estabilidad. A medida que el tamaño aumenta, la relación área
/volumen disminuye y, por tanto, se torna mas protectora en envase.
En base a este principio, la vida útil de un producto en un envase de
1000 mL será mayor del que de uno de 250 mL. Es importante
considerar que apenas la permeabilidad del material de envase no es
suficiente para si establecer su grado de protección. El proceso de
transformación, bien como el formato y cierre del envase afectan
intensamente la tasa de permeabilidad del envase final. El mayor
efecto de perdida de barrera esta relacionado con las regiones del
cierre, como en las termosellados y en los sistemas de verificación de
las tapas (FARIA, 1993).

A continuación del proceso oxidativo, después consumido el
oxigeno disponible, ira depender de su reposición por las paredes y
por el sistema del cierre del envase. Esa reposición será tanto mas
rápida cuando menor la barrera del material al paso del oxígeno del
ambiente externo para el interior del envase. Por esta razón los
materiales del envase deben presentar buena barrera al oxígeno.
Como alternativa, existen los laminados conteniendo lamina de
aluminio o los co-extruidos con etileno-vinil-alcohol (EVOH) o
policlorato de vinilideno (PVdC) (FARIA, 1993).

La principal perdida de calidad de alimentos asépticos es por vía
oxidativa, presentando como consecuencia la alteración del sabor y
aroma característicos. Generalmente, se forman compuestos volátiles
indeseables, provenientes del proceso autoxidativo. Sin embargo, la
oxidación solo ocurrirá si hubiera oxígeno disponible dentro del

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embalaje. La disponibilidad del oxígeno dependerá del sistema de
envase y del proceso de industrialización. Consecuentemente, el
oxígeno dentro del envase será la sumatoria del que se encuentra
disuelto en el alimento mas el existente en el espacio vacio
(headspace). Por tanto, los envases sin espacio vacío presentan
mayor protección, en relación a los demás (FARIA, 1993).

En respecto a las reacciones oxidativas, el oxigeno residual en el
producto (espacio vacio + disuelto) y la permeabilidad del envase son
los principales factores que determinan la vida útil. La remoción del
oxígeno disuelto en el producto es más difícil en los sistemas
asépticos del que en los termoprocesados en latas y vidrios. Esto
ocurre debido a la menor temperatura de proceso y a la dificultad de
hacer la desaereación mecánica en los sistemas asépticos (FARIA,
1993).

La leche, cuando es oxidado, es dotada de sabor y aroma
anormal. Tales aromas, en general desagradables, son originales de
compuestos volátiles, provenientes de la degradación de
hidroperóxidos. Dependiendo del componente oxidado, un olor típico
es en tanto formado, un ejemplo de la oxidación de proteínas y de
aminoácidos, que resultan en olor de quemado. Por otro lado, la
oxidación de componentes lipídicos resulta en olor rancio (FARIA,
1985).

Los compuestos volátiles, en general desagradables, son
originados de los hidroperóxidos formados por la oxidación de los
lípidos. Los hidroperóxidos por si no afectan las propiedades
sensoriales de la leche, pero sus productos de degradación son
volátiles y detectables, mismo en bajísimas concentraciones (del

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orden de ug/L). La luz no solo acelera la oxidación como también
afecta la degradación de los peróxidos, originando compuestos
volátiles tales como los aldehídos, las cetonas y los alcoholes. La
degradación de la proteína de la leche por acción fotoquímica de la
luz puede resultar en sabor desagradable, por ejemplo la metionina
que da origen al metional (FARIA, 1985).

Tanto la radiación solar como la artificial producen efectos
negativos en la calidad de la leche, produciendo olores y reduciendo
el contenido de vitaminas. Los nutrientes en la leche son mas
sensibles a la radiación en la región azul-violeta del espectro visible,
en la zona de comprimiento de onda de 400 – 500 nm, cuando la
radiación ultravioleta es visible encima de 500 nm tiene efecto
relativamente reducido sobre las vitaminas y otros nutrientes. La
intensidad de la fotoxidación depende de la intensidad de la energía
radiante que llega a la leche y el tiempo de exposición. La leche es
una de las mejores fuentes de vitamina B2 y una buena fuente de
vitamina A, ambas sensibles a la luz, que también reducen el
contenido de vitaminas, producen olores (FREDSTED et al., 1996).

5.3 MODIFICACIONES DE LOS COMPONENTES DURANTE EL
ALMACENAMIENTO

Existen situaciones en las cuales muchos compuestos volátiles
disminuyen durante el almacenamiento y comercialización del
producto. Este fenómeno es denominado de absorción del sabor por
el material de envase. El film de polietileno de la parte interna de los
envase cartonados absorbe parte de los compuestos volátiles de la
leche. Todavía, puede ocurrir también la interacción de los aldehídos
con los aminoácidos o péptidos de las proteínas de la leche. Otras

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transformaciones típicas en productos lácteos incluyen:
sedimentación, aumento de viscosidad, separación de grasa, etc.
Esas alteraciones son intensificadas cuando se aumentan la
temperatura y el tiempo de comercialización. Se sabe también que el
ajuste del pH, el balance de contenido de sales, la adición de
estabilizantes y la disminución de la agitación durante el transporte
pueden minimizar esas transformaciones (FARIA, 1993).

5.3.1 Alteraciones en el sabor

La aceptación de productos lácteos por los consumidores es
generalmente determinada por las características sensoriales del
producto. Esas características son influenciadas por varios factores
intrínsecos y extrínsecos al producto, por ejemplo, reacciones de
oxidación y/o incremento de flora microbiana natural. Muchos de los
factores se alteran durante el almacenamiento, cambiando las
características sensoriales. Esas alteraciones son importantes,
especialmente en la determinación de la vida útil del producto.
Frecuentemente las características sensoriales de un producto son
alteradas, tornando el mismo inalterables (WASTON y MCEWAN,
1995).

El sabor es la propiedad que mas limita la aceptabilidad de la
leche UHT. La característica dominante de la leche UHT recién-
procesada es el sabor cocido. Duranteel almacenamiento, la
intensidad de ese sabor es reducida, y otras características se tornan
evidentes. Después de un almacenamiento prolongado, el sabor de
“viejo” y “rancioso”, limita la aceptación del producto, que,
típicamente, aumenta durante las primeras semanas de
almacenamiento cuando la intensidad del sabor “cocido” es reducida;

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la aceptación decrece con el aumento del sabor de “viejo”. Las tasas
de alteración del sabor son influenciadas por muchas variables,
incluyendo las propiedades de la leche, intensidad del tratamiento
térmico, tipo de equipamiento utilizado en el procesamiento,
embalaje, concentración de oxigeno, tiempo y temperatura de
almacenamiento (DUNKLEY y STEVENSON, 1987).

Cuando la leche es calentada encima de 70ºC, las proteínas del
suero son desnaturalizadas produciendo grupos sulfidrilos, que en la
presencia de oxígeno son oxidados a sulfito de hidrogeno
(HOLDSWORTH, 1992). Según DUNKLEY y STEVENSON (1987), el
surgimiento de un sabor, descrito como calentamiento o cocido, es
mas intenso inmediatamente después el procesamiento y tiende a
desaparecer después de pocos días. A temperaturas de
procesamiento superiores, el sabor “cocido” se torna aparente,
causado particularmente por sulfito de hidrogeno, que es formado por
la degradación térmica de beta-lactoglobulina y proteínas de la
membrana de los globulos de grasa. El sabor que ocurre cuando la
leche es calentado encima de 90ºC es descrito como sabor
esterilizado, supuestamente debido a las reacciones de Maillard,
ocurriendo la formación de una coloración oscura (HOLDSWORTH,
1992).

El procesamiento UHT da un sabor típico causado por cetonas,
lactonas y compuestos sulfúricos. Los lípidos de la leche son la fuente
más importante del sabor UHT. La leche sometida a un tratamiento
térmico mas intenso presenta un sabor “caramelizado”, resultante de
las reacciones de caramelización y maillard (DUNKLEY y STEVENSON,
1987).

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Un interesante efecto colateral del calentamiento es la formación
de lactulosa, cuya cantidad es directamente proporcional a la
intensidad del tratamiento térmico. La aceptabilidad del sabor de la
leche procesado esta correlacionada inversamente con la cantidad de
lactulosa producida (HOLSWORTH, 1992).

El origen de los sabores de rancio y amargo durante el
almacenamiento de la leche UHT esta relacionada a la presencia de
enzimas termo-resistentes como proteasas y lipasas (DUNKLEY y
STEVENSON, 1987).

Algunos sabores indeseables (off-flavors) en la leche son
desarrollados a partir de la auto-oxidación de los lípidos insaturados y
por la oxidación, inducida por la radiación, de metionina formando el
aldehído metional. La oxidación de lípidos insaturados produce una
diversidad de aldehídos y cetonas que contribuyen para la producción
de off-flavors. Tanto los lípidos saturados cuando los insaturados
pueden ser oxidados en presencia de oxigeno. Bajo condiciones
normales de procesamiento en la industria lechera, los lípidos
saturados son considerados estables. La oxidación de lípidos
insaturados ocurre, no en tanto, fácilmente. Los lípidos pueden ser
oxidados como ácidos grasos libres o como triglicéridos. El primer
paso en ese proceso oxidativo es la formación de hidroperóxidos, que
son inodoros e insípidos, mas son mucho inestables,
descomponiéndose rápidamente para formar radicales libres y
compuestos carbonilicos y carboxílicos como aldehídos, cetonas y
ácidos, pudiendo también ser formados algunos alcoholes. Esos
compuestos tienen un umbral de detección mucho bajo dando origen
al sabor oxidado (RYSSTAD et al., 1998).

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Según el mismo autor, un mecanismo de fotoxidacion bien
conocido es la oxidación de metionina en metional, donde la
riboflavina actúa como un fotosintetizador, siendo activada por la luz
de longitudes de onda en la franja de 400 – 500 nm. El metional
tiene un umbral de detección de olor muy bajo, originando un fuerte
sabor desagradable. El efecto del off flavor inducido por la radiación
es mas pronunciado del que el efecto de oxidación de lípidos
insaturados no inducida por la radiación.

Las transformaciones físico-químicas en leche se inician en el
procesamiento térmico, debido al efecto de la temperatura de
esterilización. Las principales transformaciones ocurren en las
proteínas, cuyas consecuencias son las alteraciones en el sabor.
Cuando calentadas, las proteínas liberan el gusto característico de la
leche hervido o cocido. Paralelamente, reacciones de oxidación y
reacciones de Maillard también ocurren durante el proceso térmico.
La minimización del efecto de la temperatura viene siendo conseguida
por el uso de inyección del vapor, seguida del enfriamiento
instantáneo o flash. De este modo, el tiempo en que el producto
permanece a alta temperatura es menor, reduciendo la producción de
volátiles indeseables.

Durante el almacenamiento y comercialización de leche
procesado por el sistema UHT, las transformaciones en el sabor y
aroma continúan debido a las reacciones oxidativas, cuya intensidad
depende de la disponibilidad de oxígeno residual y de la barrera del
envase (FARIA, 1993).

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5.3.2 Alteraciones en las proteínas

Los constituyentes de la leche sufren la mayor alteración
durante el procesamiento UHT y en el almacenamiento son las
proteínas. Las alteraciones en las proteínas están relacionadas a
muchos problemas tecnológicos con productos UHT, tales como off-
flavors, gelatinización, formación de sedimento, incrustación de la
superficie de transferencia de calor, perdida del valor nutricional y
oscurecimiento. El principal efecto del tratamiento UHT en las
caseínas es un cambio en la distribución del tamaño de las miscelas,
que, en general, aumentan de tamaño. Cuando las proteínas del
suero son desnaturalizadas, forman complejos entre sí, con caseínas
y con globulos de grasa (DUNKLEY y STEVENSON, 1987).

La Proteólisis en la leche tiene dos orígenes: el primero
mediante los microorganismos que pueden secretar proteasas
exógenas resistentes al calor y muchas de ellas se desarrollan
durante el almacenamiento en frío de la leche; el segundo está
relacionado con el deterioro de la ubre enferma lo que incrementa la
cantidad de proteasas endógenas, especialmente aquellas del sistema
plasmina-plasminógeno (LE et al., 1995).

GEBRE-EGZIABHER et al. (1980) señalan que las proteasas de
la leche cruda (enzimas exógenas) son producidas por bacterias
psicrótrofas, en especial del género Pseudomonas. Estos
microorganismos pueden crecer con facilidad a temperatura de
refrigeración y son eliminados a temperatura de pasteurización, pero
muchas especies producen enzimas extracelulares termoresistentes
hacia el final del crecimiento exponencial o en fase de crecimiento
estacionaria. MARTIN-HERNÁDEZ (1991) señala que la influencia que

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tienen estas enzimas sobre las características organolépticas de la
leche y productos lácteos, es muy superior en muchos casos a la que
pueden ejercer las enzimas nativas de la leche. Las caseínas de la
leche están sometidas a la acción de estas enzimas proteolíticas, las
cuales causan desestabilización de las micelas de caseínas,
hidrolizando más rápidamente a la k-caseína (k-CN) en una acción
similar a la quimosina del cuajo de ternera. La b-caseína (b-CN) es
degradada en menor proporción que la k-CN y las as1-caseína (as1-
CN) y las as2-caseína (as2-CN) prácticamente no sufren alteración,
según lo refieren algunos autores (ADAMS et al., 1976).

Respecto a las enzimas endógenas, MARTIN-HERNÁDEZ (1991)
BARBANO (1993) y BALLOU et al. (1995) reportan que en la leche
cruda la más importante es la proteasa alcalina análoga a la plasmina
del suero sanguíneo. La plasmina presente en la leche está como
plasminógeno precursor inactivo y la presencia de las células
somáticas en una concentración 500.000 cel/mL resulta en la
conversión de cantidades significativas de plasminógeno en plasmina,
incrementándose la proteólisis de las caseínas. La plasmina actúa
fundamentalmente sobre la b-CN, las as2-CN y as1-CN siendo éste el
orden de susceptibilidad, mientras que la k-CN es resistente. La
acción sobre la b-CN conduce a la formación de las g1, g2 y g3
caseína.

La proteólisis puede causar en la leche principalmente dos
problemas: un decrecimiento en el rendimiento quesero (LE et al.,
1995) y un deterioro en la composición y calidad del queso, sabor
amargo en los productos lácteos procesados, tales como quesos,
leche procesada a ultra alta temperatura (UAT) y leche pasteurizada
(GRANDISON y FORD, 1986; LE et al., 1995).

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2


Una de las principales características de la leche UHT es su vida
larga en el almacenamiento (vida útil) sin refrigeración, periodo en el
cual el producto presenta características bacteriológicas, físicas y
químicas aceptables (NIEUWENHUIJSE, 1995). Un producto puede ser
considerado estable durante el almacenamiento por mucho tiempo
cuando permanece el fluido homogéneo.

El proceso de producción de leche UHT inicia con la recepción
de la materiaprima (leche cruda), pasteurizada, seguida por
calentamiento (esterilización), homogenización, refrigeración,
envasado en envases asépticos. Almacenamiento y distribución
(ICMSF, 1997). El calentamiento se realiza a temperaturas de 130 a
150 ºC por 2 a 4 seg., debido a ello pueden ser responsables de la
degradación de míscelas de caseína, resultando en un aumento de
índice proteolítico y alteración de las características reológicas de la
leche. En esta fase es el punto de mayor control del binomio tiempo -
temperatura, que garantice la esterilización comercial; a
temperaturas por debajo de las establecidas o por encima, pueden
causar problemas tecnológicos como alteraciones de las proteínas
interfiriendo en el sabor, melificando, formación de sedimentos,
pérdida de valor nutricional y oscurecimiento (BASTOS, 1995;
BURTON, 1988).

La eficiencia del proceso de esterilización de leche UHT depende
de la temperatura de nivel de abastecimiento y el método de
esterilización. El esterilizado de la leche por el proceso de
calentamiento directo (inyección directo de vapor en leche) forma un
gel inestable cuando es almacenado por alguna semanas en
temperatura ambiente, siendo que permanece estable por un largo
tiempo cuando está almacenado en refrigeración.

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3


El glicomacropeptido (GMP o ácido siálico) en la leche y
derivados ha asumido características de importante marcador de las
acciones proteolíticas sufridos, sea en la condición de materia prima
o en el mismo monitoreo de etapas importantes del proceso
tecnológico de leche UHT. La determinación de GMP por
espectrofotometría utilizando ninhidrina ácida posibilita también la
detección de posibles fraudes por adición de suero del queso a la
leche fluida (FUKUDA, 1996).

Así como el índice proteolítico, la evaluación de viscosidad de
leche UHT durante su vida en anaquel también es utilizada en la
evaluación de desagregación o de la despolimerización que puede
ocurrir en los periodos iníciales de hidrólisis de proteínas. La
viscosidad también sufre cambios por efectos físico-químicos, como
del pH, temperatura, contenido de sólidos, tamaño de partículas y
humedad (CAMPOS et al., 1989). Las características de viscosidad y
de consistencia de un producto pueden determinar su aceptación o no
por parte del consumidor.

Determinación del índice proteolítico (presencia del
glicomacropeptídeo libre GMP por espectrofotometrías 47O nm) de la
leche. Este método permite la cuantificación de liberación de la
fracción GMP (o del siálico ácido) de la k-caseína, por lo tanto permite
una estimación indirecta de las alteraciones del índice proteolítico
sufrida por las muestras de leche (FUKUDA et al., 1994).

Estas proteólisis se relaciona con la caseína y las proteasas
bacterianas, principalmente originaría de las bacterias psicrotróficas
en la leche cruda que, después del tratamiento UAT/UHT, son
eliminados, sin embargo las enzimas termorresistentes continúan

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4


actuando lentamente sobre las proteínas durante el almacenaje de la
leche cruda UAT/UHT.

Según SANTOS y LARANJA de FONSECA (2001), la actividad
enzimática de los psicrotróficos tiene gran importancia cuando los
6
contenidos exceden 10 UFC/mL. Las proteasas son capaces de
hidrolizar toda la caseína disponible en la leche en péptidos solubles.
Efecto directo de esta proteólisis es el gusto amargo de la leche
debido a la presencia de péptidos con esta característica sensorial
(MITCHEL y EWINGS, 1985). Las Proteasas de origen psicrotrófica
presentan capacidad de coagular la proteína de la leche y la actividad
hidrolítica en varias fracciones la caseína, presentando, sin embargo,
una actividad degradativa baja en las proteínas del suero. La fracción
proteínica representada por la caseína se degrada fácilmente debido a
su estructura helicoidal (SANTOS y LARANJA de FONSECA, 2001).

La κ-caseína situada en el superficie de la micela de la caseína
preferencial es hidrolizada, y esta hidrólisis causa el desarrollo del
sabor amargo e induce el aumento de la viscosidad, con la formación
eventual del gel de la leche UAT/UHT (DATTA y DEETH, 2003;
FAIRBAIRN, 1986).

La Proteólisis de la leche UAT/UHT durante el nivel de
almacenamiento a temperatura ambiente es uno de los factores más
importantes limitando su vida en anaquel con cambios en su sabor y
textura. La textura es caracterizada por el aumento en la viscosidad,
conduciendo, en algunos casos, la formación de gel. Las enzimas
responsables para la proteólisis son las: proteasas alcalino nativa de
la leche, plasmina extracelular y las bacterias, las proteasas, son
termoestables, producidos para las bacterias psicrotróficas de los

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5


contaminantes de la leche antes de procesamiento térmico. Estas
proteasas reaccionan diferentemente con los proteínas de la leche y
producen diversos péptidos en la leche UAT/UHT (DATTA y DEETH,
2003).

Proteínas participan de las reacciones de maillard durante el
almacenamiento ocasionando el subsecuente oscurecimiento de la
leche (HOLDSWORTH, 1992).

Diversos autores estudiaron el efecto de las enzimas microbianas
en la degradación de la leche. GUINOTTHOMAS et al. (1995)
evaluaron el efecto de las enzimas microbianas y de las enzimas
naturales de la leche sobre la proteólisis ocurrida durante el
almacenamiento de leche cruda mantenido a 4ºC. las muestras de un
mismo lote de leche fueron sometidas a 4 tratamientos : 1) muestra
control, no acondicionada de ninguna sustancia; 2) adicionada de
uroquinasa, inhibidor de activación de la plasmina; 3) adicionada de
bacteriocina, inhibidor del crecimiento bacteriano; 4) adicionada de
uroquinasa y bacteriocina. Los autores observaron que a partir del
cuarto día de almacenamiento hubo mayor tasa de proteólisis en las
muestras mantenidas sin adición de bacteriocinas, demostrando que
en estas condiciones ( leche cruda almacenada por mas de 4 días
bajo refrigeracionde 4ºC) a la acción de las enzimas microbianas por
su mayor importancia que la plasmina en la proteólisis.

DATTA y HILTON (2003) evaluaron el efecto de las enzimas
endógenas de la leche (proteinasa alcalina y plasmina) y de las
enzimas termoestables de microorganismos psicrotroficos, sobre
proteólisis de la leche UHT. Las leches fueron sometidas a 3
tratamientos: Leche UHT control; leche UHT con adición de

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6


bactericina y plasmina; leche UHT con la adición de bactericina y
proteinasa microbiana. Los autores reportaron que la proteólisis
ocurre de forma más severa en las muestras con adición de
proteinasas microbianas, sugiriendo que las enzimas microbianas
ejercen un papel más importante en la proteólisis de la leche UHT.

HARYANI et al. (2003) evaluaron el crecimiento de
psicrotroficos, la producción de proteasas y la proteólisis en la leche
almacenada por 10 días a diferentes temperaturas de refrigeración
(2, 4 y 7ºC). Los resultados demostraron una gran variación de los tres
parámetros. El tiempo necesario para que el conteo de
7
microorganismos psicrotroficos alcance 10 microorganismos por mL
fue de 9,7 y 4 días, para las temperaturas de almacenamiento de 2, 4
y 7ºC respectivamente. A 2ºC la proteólisis alcanzó niveles
significantes después 10 días de almacenamiento, entretanto, la
actividad de las proteasas ya era significativo a partir del 8º día.
Cuando la leche fue mantenida a 7ºC, la proteólisis significativa fue
detectada después de 4 días de almacenamiento y la detección de la
actividad de las proteasas después de 2 días. El tiempo mínimo para
detección de la proteólisis también varió, siendo de 6 días para las
muestras mantenidas a 2ºC, 4 días para las muestras a 4ºC y 2 días
para las muestras a 7ºC. De acuerdo con los datos obtenidos en este
trabajo, la leche cruda no debe ser almacenada por periodos mayores
que el mínimo necesario para la detección de la proteólisis para cada
temperatura.

DEETH et al. (2002) investigaron las causas de las diferentes
respuestas de la lipólisis y de la proteólisis causadas por psicrotrofos
en la leche entera y en la leche descremada pasteurizados. Leches
comerciales (entera y descremada) fueron mantenidas a 4ºC hasta la

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7


fecha de vencimiento. Las leches vencidas fueron en tanto
almacenadas a 58ºC y analizadas después de 0, 3, 6, 9, 12 y 15 días
de almacenamiento. Los productos no presentaron diferencia cuanto
a los tipos de microorganismos y sus tasas de crecimiento,
entretanto, cuando las muestras representativas de los
microorganismos contaminantes fueron inoculadas en la leche recién
pasteurizada de ambos de lostipos, las muestras con
microorganismos retirados de la leche entera presentaron sabor
picante, en cuanto aquellos incubadas con muestras de
microorganismos retirados de la leche descremadas presentaron
sabor ácido. Los autores sugieren que, debido a la mínima cantidad
de grasa en la leche descremada, los microorganismos que se
adaptan y crecen en este sustrato deben producir grandes cantidades
de proteinasas, produciendo un sabor picante, en cuanto que los
microorganismos que crecen en la leche integral deben producir altas
concentraciones de lipasas, produciendo compuestos diferentes y
resultando en sabores diferentes.

GUINOTTHOMAS et al. (1995) estudiaron el efecto de las
condiciones de almacenamiento sobre las características
fisicoquímicas de la leche cruda. Dos condiciones fueron evaluadas en
este trabajo: muestras con leche cruda con baja y alta carga inicial
3 4
(4x10 e 2,8x10 , respectivamente) almacenadas por 48 horas a 4ºC
3
y muestras de leche cruda con baja y alta carga inicial (4x10 e
4
2,8x10 , respectivamente) inoculadas con Lactococcus lactis subs.
Lactis almacenadas por 48 horas a 8ºC. Los autores reportaron que,
en el primer tratamiento, el aumento de microorganismos después
del periodo de almacenamiento fue mayor en la muestra con mayor
6 3
carga inicial (5,1x10 e 9,2x10 , respectivamente, para las muestras
de alta y baja cantidad bacteria inicial). Ambas muestras presentaron

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8


un leve decrecimiento en sus valores de pH, entretanto ninguno
presento niveles significantes de proteólisis. En el segundo
tratamiento fue observado un efecto bacteriostático de las bacterias
lácticas bajo los microorganismos y un aumento de microorganismos
en la leche con conteo inicial mas alta (conteo después el periodo de
3 5
almacenamiento inferior a 10 y de 9,1x10 para la leche de conteo
inicial baja y alta, respectivamente). Fue observada una reducción
significativa del pH, al cual fue atribuida es la fermentación de azúcar
por las bacterias lácticas en ambas muestras. Ninguna proteólisis fue
observada en cualquier de las muestras, no en tanto fue observada la
reducción de 50 y 75% de calcio, 36 y 22 % de fosforo, 30 y 53 % de
magnesio y 40 y 50 % de sodio, respectivamente, para las leches de
baja y alta conteo microbiano inicial, reducciones están atribuidas a
las alteraciones de pH que provoca la transferencia del calcio coloidal
a la forma soluble. Los autores concluyeron que el factor más
importante en el mantenimiento de la calidad de la leche bajo
refrigeración es la carga inicial de microorganismos psicrotroficos.

5.3.3 Alteraciones nutricionales

El procesamiento UHT de la leche causa poca reducción de su
calidad nutricional, mas durante el almacenamiento, después el
envasado aséptico, las perdidas de varios nutrientes pueden ser
significativas. La temperatura de almacenamiento, concentración
inicial de oxigeno en la leche y la barrera del material de embalaje
son de elevada importancia. La calidad nutricional es mejor
conservada por el embalaje hermético de leche desaereado en
materiales opacos, almacenado, preferencialmente, bajo refrigeración
(DUNKLEY y STEVENSON, 1987).

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9


Las vitaminas liposolubles son poco afectadas por el calor, siendo
las hidrosolubles las más sensibles. La pasteurización destruye en
torno de 5% de tiamina y 10 % de vitamina C al paso que el
procesamiento UHT destruye 10 % de las vitaminas B, 15% de ácido
fólico y 25 % de vitamina C. entretanto, el proceso UHT tiene poco
efecto en el valor nutricional de las proteínas, grasas y minerales
(HOLDSWORTH, 1992).

Las vitaminas hidrosolubles como la vitamina C, ácido fólico y
vitamina B12, son también perdidas durante el almacenamiento,
especialmente en la presencia de la luz y oxígeno. La desaereación
ayuda en la retención de vitaminas hidrosolubles; no en tanto, sin la
desaereación los ácidos fólico y ascórbico son perdidas dentro de dos
semanas de almacenamiento (HOLDSWORTH, 1992).

Según MEHTA (1980), el valor nutritivo de la leche UHT puede
ser reducido en dos estadios: el valor nutritivo es normalmente
reducido debido a las alteraciones en las estructuras químicas de los
nutrientes. El efecto del procesamiento UHT difiere para los
nutrientes de la leche. El valor nutritivo de algunos constituyentes
como la grasa, vitaminas liposolubles, carbohidratos y minerales
permanecen esencialmente inalterado, alpaso que otros
componentes como vitaminas hidrosolubles y proteínas,
especialmente las seroproteinas, son adversamente afectados.
Durante el almacenamiento, los principales factores que afectan los
nutrientes son la temperatura, luz y oxígeno. Las principales
alteraciones nutricionales que ocurren enla leche durante el
almacenamiento y comercialización están asociadas a las vitaminas,
siendo las proteínas afectadas en menor extensión.

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0


5.3.4 Apariencia

El color de la leche UHT es influenciado por muchos factores
tales como la composición de la leche, cambios en las distribuciones
de tamaños de partículas, resultantes de la homogenización y
tratamiento térmico y reacciones de Maillard. La apariencia más
blanca de la leche UHT en relación a la leche natural es debido a la
desnaturalización de las proteínas del suero y subsiguiente
agregación con la caseína. El color no es considerada un defecto que
limita la aceptabilidad de la leche, mas es de importancia para
productos que contienen azúcares reductores (HOLDSWORTH, 1992).

5.3.5 Gelificación y formación de sedimentos

De acuerdo con Murray y Stewart (1978), el problema de la
coagulación o gelificación de la leche UHT durante el almacenamiento
ocurre debido a las siguientes hipótesis: puramente un proceso físico-
químico o el efecto es derivado de enzimas.

La viscosidad aumenta gradualmente hasta que el producto
gelifica y se torna impropio para el consumo. La gelificación puede
también ser considerada como resultado de la acción de
microorganismos psicrotrofos, como pseudomonas
que producen enzimas estables al calor durante el
almacenamiento refrigerado de la leche natural (HOLDSWORTH,
1992).

La formación de sedimento en el procesamiento térmico es
bastante dependiente del pH, aumentando considerablemente cuando
el pH esta bajo de 6,6 con la severidad del proceso. En general, mas

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1


sedimentos son formados en procesos de calentamiento directo del
que indirecto (HOLDSWORTH, 1992).

FOX y MCSWEENEY (1998) afirman que la estabilidad de la leche
UHT es limitada por la gelificación de las proteínas o por desarrollo de
sabor amargo, ambos debido a la proteólisis causada por proteasas
producidas por los psicrotrofos durante el almacenamiento
refrigerado de la leche natural.

Uno de los mecanismos de la gelificación de la leche UHT es la
degradación proteolítica de la caseína, que toma las micelas sensibles
a la agregación. El almacenamiento refrigerado de la leche cruda
agrava el problema, por el desarrollo de psicrotrofos (BIZARI et al.,
2003).

5.4 DETERIORO Y VIDA EN ANAQUEL DE LECHE PASTEURIZADA

La leche es un medio ideal para el desarrollo de bacterias, siendo
2 4
su flora natural, constituida por cerca de 10 a 10 UFC/mL,
proveniente de los canales de leche de la vaca, de la ubre, de los
equipos de ordeño utilizados durante la producción, etc. esa flora
incluye Pseudomonas spp., microccoccus spp., streptococcus spp.,
Corynebacterium spp., lactobacillus spp y coliformes. El deterioro de
la leche es consecuencia, sobretodo, del desarrollo de
microorganismos psicrotroficos, que producen lipasas y proteasas
termoestables que no son inactivadas durante el tratamiento térmico.
Las Pseudomonas, flavonobacterios y Alcaligenes spp. Son
productoras de lipasas, las cuales producen cadenas medias y cortas
de ácidos grasos a partir de los triglicéridos de la leche. Esos ácidos
grasos confieren a la leche sabor y aroma rancio. Las proteasas son

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2


producidas por las pseudomonas Aeromonas Serratia y Bacillus spp.
, ,
Esas enzimas hidrolizan las proteínas de la leche, produciendo
péptidos que lo deterioran.

Estos microorganismos son capaces de crecer a temperaturas
de 7°C o inferiores, aunque su temperatura óptima de multiplicación
sea superior. La enumeración de bacterias psicrotrofas en alimentos
que deben ser almacenados en refrigeración (0 a 7°C), es importante
porque su presencia (particularmente en un gran número) indica una
probabilidad elevada de deterioro durante un almacenamiento
prolongado. Los alimentos crudos mantenidos bajo refrigeración,
previos a su procesamiento, están sujetos a la pérdida de calidad y
posible deterioro por las bacterias psicrotrofas. Cuando estos
gérmenes se desarrollan en gran número antes del tratamiento de la
7
leche, alcanzando recuentos superiores a 10 UFC/mL, secretan
enzimas termorresistentes (proteasas y lipasas) que originan defectos
de sabor-olor (flavour) (sabores amargos, enranciamiento, etc.) o
problemas de estabilidad física durante el almacenamiento de los
productos pasteurizados, aunque los microorganismos hayan sido
destruidos durante el tratamiento térmico (NEAVES y LANGRIDGE
,2000).

Dentro de este grupo microbiano, el género Pseudomonas es el
más frecuentemente reportado en leche cruda aunque también se
encuentran Flavobacterium spp. y Alcaligenes spp. (NEAVES y
LANGRIDGE ,2000). La óptima actividad de las proteasas y lipasas
generadas se encuentra a una temperatura de 20-30°C, pero una
considerable síntesis también se observa a bajas temperaturas. Un
alto recuento de estos microorganismos en la leche cruda puede ser
considerado como indicador de una vida útil limitada de la leche

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3


pasteurizada, en especial si están presentes los psicrotrofos
termodúricos (GARCÍA-ARMESTO y SUTHERLAND, 1997). Bajo
condiciones de higiene, menos del 10% de los microorganismos
totales son psicrotrofos, comparado con el 75% de participación en la
carga microbiana total de la leche cuando no se contemplan medidas
higiénicas (CHAMPAGNE et al., 1994).

Con la mejora de los sistemas de refrigeración y la posibilidad
de la leche cruda de mantener a bajas temperaturas por periodos
más largos, posibilita el acopio de leche en las propiedades rurales en
intervalos mayores, los microorganismos psicrotroficos pasaran a
tener mayor importancia para la industria de lácteos. Las bacterias
psicrotroficas son capaces de multiplicarse a temperaturas menores
de 7ºC, independientemente de su condición óptima de
multiplicación. Durante su multiplicación, producen enzimas
proteolíticas y lipoliticas que resisten la pasteurización, cuya acción
resulta en la degradación de proteínas y grasas de la leche, y en la
generación de problemas de calidad, reducción de la vida en anaquel
de los productos, alteración del sabor y olor, reducción del
rendimiento industrial en la fabricación de quesos y gelificacion de
leche larga vida (SØRHAUG, STEPANIAK, 1997).

Las principales fuentes de este grupo de microorganismos son
las superficies de los tetos, el equipamiento de ordeño y la
contaminación por ordeño. También pisos, variaciones razonables
ejercen papel relevante en la frecuencia y en las especies de
microorganismos psicrotroficos encontrados en la leche produciendo
en el verano en relación a la producción en el invierno (COUSIN,
1982). El mismo autor relata mayor conteo de psicrotroficos en la
leche de vacas estabuladas comparado con la leche producido por

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4


animales mantenidos en pastoreo durante la primavera. La
microbiota psicrotrofica de la leche cruda por vacas estabuladas
consiste principalmente de pseudomonas, Arthrobacter y Micrococcus
, entretanto el Flavobacterium es dominante en la leche de vacas
mantenidas en sistema a pastoreo (COUSIN, BRAMLEY, 1981).

Según COUSIN (1982), un gran número de los géneros de
bacterias psicrotroficas aislados en la leche se tienen: Pseudomonas,
Enterobacter, Flavobacterium, Kleibsiella, Aeromonas, Acinetobacter,
Alcaligenes y Achromobacter. Algunos géneros de psicrotrofos
encontrados en la leche también son termoduricas, entre ellos
destacan el Bacillus, Clostridium, Microbacter
ium , Micrococcus y el
Corynebacterium(SUHREN, 1989).

La refrigeración es la principal forma de conservación de la
leche después el ordeño. La refrigeración impide la multiplicación
exagerada de la mayoría de los microorganismos de la leche,
entretanto no impide la multiplicación de los microorganismos
psicrotroficos (ZALL, 1990). A pesar de la mayoría de estos
microorganismos son sensibles a la pasteurización, sus enzimas son
termorresistentes y pueden causar grandes daños a los derivados
lácteos (SØRHAUG y STEPANIAK, 1997; CHAMPAGNE et al ., 1994).

5.5 METODOS DE MEDICION DE VIDA ÚTIL

5.5.1 MÉTODOS DE ESTIMACIÓN

Según LABUZA (1999), la vida útil de un alimento puede ser
estimada mediante:

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5


5.5.1.1 Valores de literatura

La estimación de la vida útil se realiza recomendado a datos
publicados. El problema principal de este método radica en la
reducida disponibilidad de datos.

5.5.1.2 Tiempo de distribución de un alimento similar

Este método aproxima la vida útil del producto, considerando el
tiempo de distribución de un producto similar.

5.5.1.3 Pruebas extremas de distribución

Este método recolecta el alimento del supermercado y lo
almacena en el laboratorio bajo condiciones similares a las de uso en
casa. Es empleado cuando se requiere implementar una nueva
legislación. Permite estimar la vida útil en condiciones de casa y
distribución.

5.5.1.4 Quejas del consumidor

Identifica el problema de estabilidad haciendo uso de la
información proporcionada por el consumidor. Muchas compañías,
colocan un número sobre el empaque y almacenan en una base de
datos la información de quejas, localización etc. Esto permite a los
investigadores tener idea del modo de deterioro del alimento, e
implementan modificaciones en la formulación, proceso, empacado y
distribución. Este método puede ser empleado en conjunción con
cualquiera de los anteriores.

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6


5.5.1.5 Pruebas aceleradas

Requiere del modelaje matemático de la cinética de pérdida de
calidad. Emplea condiciones de prueba extremas, examinando el
producto periódicamente hasta el final de la vida útil. Los resultados
permiten proyectar la vida útil bajo condiciones verdaderas de
distribución. Algunas compañías cuentan con un factor histórico,
basado en la experiencia, para estimar la vida útil a partir de
resultados obtenidos en condiciones extremas (LABUZA y SCHMIDL,
1985).

Las pruebas aceleradas isotérmicas han sido usadas
extensivamente en la industria. Los alimentos son almacenados a 37
y 51 °C, y se establecen correlaciones basadas en la ecuación de
Arrhenius (Q10) que permiten extrapolar losresultados a otra
temperatura de almacenamiento (SAGUY Y KAREL, 1980). La
precisión de las estimaciones de Q10 o de la energía de activación, es
mayor si se emplean 5 a 6 temperaturas, dado que se reduce al
mínimo el límite del intervalo de confianza (LABUZA, 1999 y SAGUY Y
KAREL, 1980). Para alimentos secos y de humedad intermedia, puede
emplearse 0 (control), 23, 30, 35, 40 y 45°C; los térmicamente
procesados 5 (control), 23, 30, 35 y 40°C y los congelados -40
(control), -15, -10 y –5°C (LABUZA Y SCHMIDL, 1985).

En pruebas aceleradas de alimentos sensibles a la humedad, se
ha empleado condiciones de temperatura y humedad relativa como
factores de aceleración (LABUZA, 1999).

LABUZA Y SCHMIDL (1985), mencionan que algunos problemas
del uso de las pruebas aceleradas, por el rango de aplicabilidad de la

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7


ecuación de Arrhenius que genera extrapolaciones erróneas por
empleo del factor Q10, involucran: a) Cambio de fase, que modifica la
movilidad de los reactantes orgánicos y la vida útil puede ser
sobreestimada a bajas temperaturas, b) Los carbohidratos, en fase
amorfa, pueden cristalizarse a altas temperaturas, produciendo agua
libre para otras reacciones, c) Dos reacciones de pérdida de calidad
con energías de activación diferentes pueden producirse en un
alimento a altas temperaturas, d) La fijación de agua en alimentos
secos varía con la temperatura. La actividad de agua se incrementa
con La temperatura, y con ello la velocidad de reacción, e) Muchas
reacciones son dependientes del pH. Para muchos solutos, el pH del
sistema es función de la temperatura y f) A altas temperaturas,
dependiendo de la naturaleza tridimensional, las proteínas
desnaturalizadas pueden ser más o menos susceptibles a reacciones
químicas.

5.5.1.6 Paneles sensoriales

La medición de los cambios en la calidad sensorial de un
alimento requiere el uso de técnicas sensoriales. Estas son
usualmente mediciones cualitativas y cuantitativas de un panel
entrenado, aunque también pueden provenir de consumidores finales.
Existen dificultades para asegurar una buena calidad en los datos
para los períodos de prueba extensos, por ello las mediciones físicas
constituyen un buen respaldo para los métodos sensoriales. El uso de
las pruebas sensoriales requiere de un conjunto apropiado de
procedimientos diseñados para proteger la salud de los panelistas. Es
particularmente importante llevar a cabo las pruebas de vida en
anaquel, teniendo especial cuidado en tomar las medidas necesarias
para asegurar que los riesgos microbiológicos sean minimizados. Las

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8


pruebas de alimentos congelados, de los cuales se dispone de poca
información acerca del final de la vida en anaquel, y que son llevados
a cabo mediante pruebasaceleradas a temperaturas elevadas,
requieren de precauciones específicas. Es necesario que
paralelamente al análisis sensorial se lleve a cabo un análisis
microbiológico.

5.5.1.7 Métodos Instrumentales

Se han diseñado muchas pruebas que permiten el uso de
técnicas instrumentales para la medición de factores de calidad
sensoriales, pero éstos sólo serán válidos si pueden correlacionarse
con las mediciones sensoriales respectivas. Los métodos
instrumentales pueden ser, un complemento importante para los
métodos sensoriales.

Se han desarrollado nuevas técnicas instrumentales para asistir la
determinación de las características organolépticas en la predicción
de la vida en anaquel de los alimentos. Algunos ejemplos son:

a) Narices electrónicas

Aunque aún no se ha establecido si constituye un instrumento
viable, éstas emplean un interesante paradigma de sensores que
responden a compuestos presentes en el espacio de cabeza
(compuestos aromáticos) utilizando un proceso en red de lectura
neurologica puede ser muy útil en los casos en los que la, del
alimento es baja, ya que debe tenerse en cuenta que la aw, afecta
significativamente la respuesta.

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9


b) Analizadores de textura

Uno de los instrumentos que se ha usado mucho en los últimos 5
años es el analizador de textura en miniatura.

c) Colorímetros

Estos instrumentos son útiles, ya que operan en la escala LAB,
es decir, realizan mediciones en tres dimensiones. Actualmente
existen dos tipos: aquellos que pueden realizar mediciones de una
gran cantidad de muestras y colorímetros portátiles para realizar
mediciones en un rango pequeño.

d) Instrumentos reológicos

El reómetro es útil para las pruebas aceleradas de vida en
anaquel. Puede ser usado para caracterizar alimentos, aditivos,
ingredientes y materiales de empaque.

e) Difracción de los rayos X

Aunque no se usa mucho todavía, los rayos X son útiles para la
determinación del nivel de horneo de las harinas midiendo el grado
de cristalinidad (LABUZA, 2000b).

Uno de los ejemplos de la medición instrumental ampliamente
usado para el control de la vida en anaquel, es la medida de la
actividad de agua; el cual ya ha sido identificado como un factor
intrínseco para la determinación de la vida en anaquel. Para la
medición y monitoreo de la actividad de agua, que permite el control

===================================================================================
0


de bacterias patógenas y esporuladas se puede usar conductímetros
de humedad ó girómetros.

Un punto de vista más acertado es el del llamado concepto de
"mercado". Este concepto depende de la identificación de las
propiedades químicas y físicas que se encuentran cercanamente
unidas al proceso de deterioro, y del diseño de un censor capaz de
medir algún aspecto de estas propiedades y por lo tanto medir el
deterioro (KILCAST Y SUBRAMANIAN, 2000).

5.5.2 MEDICIÓN DE LA VIDA EN ANAQUEL DE ALIMENTOS

Según KILCAST Y SUBRAMANIAN (2000), la determinación de la
vida en anaquel se puede realizar mediante:

5.5.2.1 Mediciones físicas

La medición física más común es la del cambio de textura de un
producto. Estos cambios pueden ser el resultado de reacciones
químicas que ocurren dentro del producto, como aquellos causados
por la interacción entre los ingredientes, ó por influencia medio
ambiental como la migración de la humedad a través del empaque.
Los métodos para medir la textura deben ser escogidos
cuidadosamente para que los resultados puedan ser correlacionados
con los cambios de textura que percibe un panel sensorial. Algunos
atributos, tales como la dureza, pueden ser fácilmente medidos, a
través de la fuerza requerida para penetrar una distancia particular
dentro del producto, Sin embargo, aún en los casos simples, los
detalles de las pruebas, tales como el tipo de examen, posición y
alineamiento de la muestra, distancia de penetración deben ser

===================================================================================
1


cuidadosamente elegidos para obtener la mejor correlación posible
con las medidas sensoriales.

5.5.2.2 Mediciones químicas

Los análisis químicos juegan un rol vital en la determinación de
la vida en anaquel, dado que pueden ser usados para medir las
reacciones químicas que ocurren en un alimento durante su
almacenamiento, ó para confirmar los resultados obtenidos por un
panel sensorial.

Para cualquier producto, las reacciones químicas ocurren
simultáneamente durante el almacenamiento. Sin embargo, sólo es
necesario medir aquellas reacciones claves en la calidad del producto.
Las pruebas químicas que determinan cambios en una característica
particular de calidad pueden ser aplicables a diferentes tipos de
productos. Un ejemplo de esto, es la medida del valor de peróxido
como indicador del nivel de rancidez de los productos (KILCAST y
SUBRAMANIAN, 2000).

El modelo de degradación cinética utilizado para predecir la
pérdida de lisina disponible en la fórmula dietética fue descrito en
LABUZA Y RIBOH (1982) por la siguiente reacción general:

dD n
=k D (5.1)
dt

Donde: D es el valor cuantitativo del factor de calidad o de la
reacción de deterioro, k es la reacción a tasa constante y n el orden
de la reacción.

===================================================================================
2

Integrando la ecuación (1), se tiene que para n=1:

⎛ D ⎞
Ln⎜ 0 ⎟⎟ = kt
⎜ D (5.2)
⎝ t⎠

Donde: Do es el valor del factor de calidad al tiempo cero y Dt es el
valor después de la reacción de deterioro al tiempo (t).

La interrelación entre la tasa de reacción y la temperatura fue
cuantificada por la reacción de Arrhenius:

⎛E ⎞
k = k 0 exp⎜ a ⎟ (5.3)
⎝ RT ⎠

Donde Ea es la energía de activación de la reacción (kcal/ mol),
R es la constante universal de los gases (1,987cal), T es la
temperatura absoluta (°K) y ko (1/min) es la constante
preexponencial o factor de frecuencia.

a) Ejemplo: Proteolisis en leche UHT

La calidad de los productos lácteos esta directamente
relacionados con la calidad microbiológica de la leche cruda utilizada
como materia prima. Dependiendo de la temperatura, las condiciones
y el alcance de almacenamiento de la leche, varios grupos de
microorganismos pueden pasar por un período de crecimiento
intensivo, produciendo altas concentraciones de enzimas,
especialmente las lipasas y proteasas. Entre estos grupos destacan
psicrotrofos (BURTON, 1988), que, a pesar de que son destruidos por
la esterilización, producen enzimas proteolíticas y lipolíticas

resistentes al calor. Estas enzimas se producen cuando el recuento de
6
bacterias llega a 10 ufc / mL o más, y se desarrollan en los residuos
o depósitos en la leche de equipo de lechería y las tuberías mal
limpiado (CELESTINO et al, 1996).

En proceso de evolución del índice proteolítico durante la vida en
anaquel de leche UAT/UHT

El contenido de glicomacropeptídeo (GMP o ácido siálico) en
leche y productos lácteos ha asumido un importante marcador de las
características de proteolíticas sufrido, ya sea como materias primas
o en las etapas importantes del proceso tecnológico de la leche. La
determinación de GMP por espectrofotometría utilizando el método de
ninhidrina ácida también permite la detección de posibles fraudes
mediante la adición de suero a la leche de líquidos (FUKUDA, 1996).
Cuando la presencia de los psicrotrofos es elevada ó suficiente para
producir enzimas proteolíticas hasta alcanzar una tasa cercana de 20
mg de ácido siálico/mL (FAIRBAIRN, 1986),

Este método permite la cuantificación de la fracción de liberación
de prácticas correctas de fabricación (o ácido siálico) de κ-caseína, lo
que permite una estimación indirecta de los cambios en el índice de
proteolisis sufrido por las muestras (FUKUDA, 1994).

Tabla 5.3: Índice proteolítico de leche UAT/UHT durante 120 días de
almacenamiento

Indice proteolitio
Tiempo (días) μg de acido sialico/mL
0 5.12
30 11.66
60 15.59
90 19.45
120 24.7

Figura 5.1: Indice proteolítico en leche en función del tiempo de
almacenamiento

Cuando la presencia de los psicrotrofos es elevada ó suficiente
para producir enzimas proteolíticas hasta alcanzar una tasa cercana
de 20 mg de ácido siálico/mL (FAIRBAIRN, 1986), este hecho se pudo
observar con claridad después de 120 días de almacenamiento,
donde el índice de proteolisis ha llegado a 24,70 mg de ácido siálico /
mL. (ROBINSON y PHIL, 1987) manifiestan que se producen cambios
en las características sensoriales y nutricionales durante el
almacenamiento de la leche UHT a temperatura ambiente. También
se produce cambios en la viscosidad que a veces conducen a

gelificaciones. Estos cambios se deben a la actividad enzimática,
principalmente enzimas extracelulares resistentes al calor,
especialmente las lipasas y proteasas producidas por bacterias
psicrotróficas de leche antes del tratamiento térmico. Por lo tanto, la
vida del producto está directamente relacionada con la calidad del
material de higiene de materia prima, que pueden considerarse como
datos comprometidos.

Teniéndose la función matemática de producción del ácido siálico
en función del tiempo como:

y = 0,156x + 5.914

Reemplazamos el valor máximo de 20 mg de ácido siálico en la
función matemática y se tiene:

20 = 0,156x + 5.914

x = 90.3 días

El tiempo de vida útil de la leche UHT es de 90 días.

5.5.2.3 Mediciones microbiológicas

Para la determinación de vida útil únicamente se consideran las
dos primeras fases, ya que con estas dos fases se alcanza el límite
máximo de población de acuerdo a las normas de DIGESA.

• Durante la fase de latencia :

===================================================================================
6

t ≤ tlat N = No (5.4)

• Posteriormente en la fase exponencial el proceso sigue una cinética
de primer orden (BUCHAGAN y PHILIPS, 1990) :
•

dN
= kN (5.5)
dt
Donde :
k = tasa de crecimiento (1/h)
N= numero de unidades formadoras de colonias (CFU/g)
t = tiempo (h)
No Nº máx. K0 Ea t0 Eal
(CFU/g) (CFU/g) (cal/mol)
L.Monocytogenes 0,1 1000 5,62E19 27549 5,32E-15 20791

Durante el almacenamiento de un producto, la población
permanece constante hasta que no se supera el tiempo de latencia,
pudiendo transcurrir varios períodos de almacenamiento (a diferentes
temperaturas) sin que la población difiera substancialmente de la
inicial.

⎡ E ⎤
⎢ a⎥
⎢ − RT ⎥
⎢⎣ ⎥⎦
k = k oe (5.6)

⎡ Eat ⎤
⎢ ⎥
= t ⎣ RT ⎦
t oe (5.7)
lat
Donde :
ko= factor pre-exponencial de k

to = factor pre-exponencial de tlat
Ea = energía de activación (cal/mol)
Eal = energía de activación para el tiempo de latencia (cal/mol)
R = constante de los gases (1.98717cal/mol ºk)
No = número inicial de CFU/g
to = tiempo inicial (h)
tlat = tiempo de latencia (h)

Para MARTH (1998) la fase log microbiana y el tiempo de
generación aumentan con la disminución de la temperatura de
almacenamiento, conforme es mostrado en la Cuadro 2.

Con los datos cinéticos determine el tiempo de vida cuando es
almacenado en las siguientes condiciones:

1. Productor, 1 día a 5ºC
2. Distribuidor, 3 días a 8,4 ºC
3. Trayecto hogar, equivalente a 0.03 días a 12,2 ºC
4. Consumidor 3 días a 6 ºC

R = 1,98717 Cal/mol ºK

Solución

Tiempo de latencia: Reemplazamos los valores de las constantes para
determinar el tiempo de latencia.

⎛− E ⎞ ⎛ 20791 ⎞⎟
t = exp⎜ at ⎟ t = 5,32x10− * exp⎜
15
t lat
lat 0 ⎜ RT ⎟ ⎜ ⎟
⎝ ⎠ ⎝ 1,98717 * 278⎠

tlat = = 4,9dias
117.65h

Se tiene la función de la cinética de desarrollo microbiano, en ella
reemplazamos los valores de las constantes

dN = exp⎛⎜ − Ea⎞ ⎟ N
k
dt 0 ⎝ RT ⎠

Para 5ºC

dN 19 ⎛ − 27549 Cal / mol ⎞⎟
= 5,62x10 exp⎜ =

N
dt ⎜⎝ (1,98717Cal / molº K )(T ) ⎟
⎠

dN
= 5,62x1019 exp(− 49,87 )N
dt

dy
= 5.62*10^19*exp(-49.87)*y
dx

Para 8.4ºC

dy
= 5.62*10^19*exp(-49.27)*y
dx

Para 12,2ºC

dy
= 5.62*10^19*exp(-48.61)*y
dx

Para 6ºC
dy
= 5.62*10^19*exp(-49.69)*y
dx

Desarrollando cada función matemática a través del método numérico
de ecuaciones diferenciales ordinarias del método de Runge-Kutta de
4 orden en el lenguaje Matlab se tiene:

function f
clear all
clc
fprintf('EFP INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIASn')
fprintf('ING. ALBERTO HUAMANI HUAMANIn')
fprintf('RESOLUCION DE ECUACIONES DIFERENCIALES POR MEDIO
RUNGE-KUTTA DE ORDEN 4n')
f=input('n Ingrese la ecuacion diferencial dY/dx:n','s');
x0=input('n Ingrese el primer punto x0:n');
x1=input('n Ingrese el valor maximo de x1:n');
y=input('n Ingrese valor inicial de y(x0):n'); h=input('n
Ingrese dx:n');
n=(x1-x0)/h;
t=x0;
X(1,1)=t;
X(2,1)=y;
fprintf('n i x y(x)');

for i =1:n;
x=t;
y=y;
k1=h*eval(f);

x=t+h/2;
y=y+k1/2;
k2=h*eval(f);

x=t+h/2;
y=y+k2/2;
k3=h*eval(f);

x=t+h;
y=y+k3;
k4=h*eval(f);

y = y +(k1+2*k2+2*k3+k4)/6;
t=x0+i*h;
X(1,i+1)=t;
X(2,i+1)=y;
fprintf('n%2.0f%10.3f%15.6fn',i,t,y);
end

n=length(X(1,:));
for i=1:n-1
m(i)=(X(2,i+1)-X(2,i))/(X(1,i+1)-X(1,i));

b(i)=X(2,i);
x=X(1,i):0.01:X(1,i+1);
y=m(i)*(x-X(1,i))+b(i);
hold on;
plot(x,y, 'b');
end

for i=1:n;
hold on;
plot(X(1,i),X(2,i), '*', 'MarkerEdgeColor', 'r', 'LineWidth',1);
title('Interpolacion de los puntos por “splines” de orden 1.');
xlabel('Valores de tiempo (h)') % Etiqueta el eje horizontal
ylabel('Valores de N') % Etiqueta el eje vertical
end

Solución

EFP INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
ING. ALBERTO HUAMANI HUAMANI
RESOLUCION DE ECUACIONES DIFERENCIALES POR MEDIO RUNGE-
KUTTA DE ORDEN 4

Ingrese la ecuacion diferencial dY/dx:
5.62*10^19*exp(-49.87)*y

Ingrese el primer punto x0:
0

Ingrese el valor maximo de x1:
24

Ingrese valor inicial de y(x0):
0.1

Ingrese dx:
1

i x y(x)
1 1.000 0.103735
2 2.000 0.107610
3 3.000 0.111629

4 4.000 0.115799
5 5.000 0.120124
6 6.000 0.124611
7 7.000 0.129265
8 8.000 0.134094
9 9.000 0.139102
10 10.000 0.144298
11 11.000 0.149688
12 12.000 0.155279
13 13.000 0.161079
14 14.000 0.167095
15 15.000 0.173337
16 16.000 0.179811
17 17.000 0.186527
18 18.000 0.193495
19 19.000 0.200722
20 20.000 0.208219
21 21.000 0.215997
22 22.000 0.224064
23 23.000 0.232434
24 24.000 0.241115

Interpolacion de los puntos por “splines” de orden 1.
0.25

0.2
Valores de N

0.15

0.1
0 5 10 15 20 25
Valores de tiempo (h)

Figura 5.2: variación de N en función del tiempo

Tabla 5.4: Resumen de cálculos
T Tiempo N0(cfu/g) Nf(cfu/g) Nº máx.
(h) (CFU/g)
1000
5ºC 4,9 0,1
5ºC 24 0,1 0,241
8,4ºC 72 0,241 28,505
12,2ºC 0,72 28,505 31,31
6ºC 72 31,31 734,31

5.6 BIBLIOGRAFÍA

1. BURTON, H. Ultra-High Temperature Processing of Milk and Milk
Products. London: Elsevier Applied Science Publishers, 1988.
2. CELESTINO, E.L.; IYER, M.; ROGINSKI, H. Reconstituted UHT-
treated milk: effects of raw milk, powder quality and storage
conditions of UHT milk on its physico-chemical attributes and
flavour. Int. Dairy J., v. 7, n. 2-3, p. 129-140, 1996.
3. FAIRBAIRN, D.J.; LAW, B.A. Proteinases of psychrotrophic
bacteria: their production, properties, effects and control. J.
Dairy Res., v. 53, p. 139-177, 1986.
4. FUKUDA, P.S.; RÖIG, M.S.; PRATA, F.L. Metodologia quantitativa
para determinação espectrofotométrica de ácido siálico em leite.
In: CONGRESSO NACIONAL DE LATICÍNIOS, 12, 1994, Juiz de Fora,
Anais do XII Congresso Nacional de Laticínios, p.114-119.
5. FUKUDA, S.P. Aplicação do método de ninidrina ácida como teste
de “screening” de plataforma para a detecção de adição de soro
ao leite. Cienc. Tecnol. Aliment., v. 16, n. 1, p. 52-56, 1996.
6. ROBINSON, R.K.; PHILL, M.A.D. Microbiologia Lactológica.
Zaragoza: Acribia, 1987.

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