Presentación biomol 2

Relevancia
del La extracción de ADN es el primer
Aislamiento paso en la tecnología del ADN.
del ADN
• Determinación del perfil de ADN

• Clonación

• Diagnóstico de enfermedades

• Determinación de secuencias de ADN

• Transferencia génica: Organismos Modificados
Genéticamente (OMG), agricultura, farmacéutica

• Pruebas ambientales, bioterrorismo

• AISLAMIENTO DE ADN DE
CELULAS BUCALES

Resumen • • Utilización de agua como enjuague para la
recogida de las células bucales
del
• • Añadir el búfer de lisis para romper las
Protocolo: membranas nucleares y celulares y liberar el
contenido nuclear
Extracción • • Utilización de la proteasa para digerir las
de ADN proteínas celulares

• • Precipitación del ADN con alcohol frío y alta
Genómico concentración de sal.

Extracció
n de ADN
: Paso-a-
Paso

• Puesto común (Puesto del Maestro)
• Baño a 500C
• Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo
Extracción y
• Puesto de trabajo de los alumnos Número
Precipitación • (4 Estudiantes/Puesto de trabajo )
• Tubos de15 ml con 3 ml de agua 4
de ADN • Microtubo rosa marcado “prot”,
• con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal
1
• Tubo de 15 ml tubo marcado “lisis” con 10 ml de búfer de 1
Listado de
• Pipetas de plástico 6
Materiales • Gradilla de hule espuma para los tubos 1
• Marcador de tinta indeleble 1
• Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los 1
• tubos de 15 ml y la subsiguiente colección de basura
4 Estudiantes/Puesto de • Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml 1
trabajo para un total de • Guía rápida 1
36 Estudiantes

•Para mejores resultados, asegúrese
Es de vital que los alumnos empleen la suficiente
cantidad de tiempo recogiendo las
importancia células de la mucosa bucal.
realizar una
abundante •Pueda que la colección de muestra en el
recogida de tubo de 15 mL sea difícil. Puede utilizar
un vaso pequeño para dispensar y
células. coleccionar la muestra.

1. Obtenga del instructor un tubo de 15
mL que contenga 3 ml de agua.
Marque el tubo con sus iniciales.

Protocolo 4
Pasos 1 −
de • 2. Cuidadosamente mordisquee el
interior de los cachetes por 30
Práctica de segundos. ¡No sirve de nada sacar
Laboratorio sangre!

• 3. Tome el agua del tubo de15 mL, y
con el agua enjuague por 30 segundos.

• 4. Cuidadosamente escupa el liquido
de regreso al tubo de 15 mL.

5. Obtenga el tubo de búfer de lisis del puesto de
trabajo y añade 2 mL de búfer de lisis a su tubo
que contiene el extracto celular.

Protocolo 6
Pasos 5 −
de
Práctica de 6. Cierre el tubo e inviértalo suavemente para
mezclar los componentes. (¡No lo mezcle muy
Laboratorio duro!). Observe su tubo — ¿Ve algunos
cambios? Anótelos.

• 7. Obtenga el tubo de
proteasa (marcado “prot”)
de su puesto de trabajo.
Añade 5 gotas de proteasa a
su tubo.
Protocolo 9
Pasos 7 − de
Práctica de
• 8. Cierre el tubo y voltéelo
Laboratorio suavemente varias veces.

• 9. Coloque su tubo en la
gradilla o en un beaker en el
baño de agua y déjelo
incubar por 10 minutos a
50°C.

Extracció
ny • ¿Por qué se lleva a cabo cada
precipita paso?
ción de
ADN

1. Colección
de células

El mordisqueo del
interior de la boca, en
combinación con el
enjuague de agua
funciona para separar
las células del epitelio
alineando la boca.

Es crítico recoger la
cantidad suficiente de
células.

2. Búfer de Lisis
CH3
¿Qué es el Búfer de Lisis? CH2

• 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 CH2
• 1% SDS CH2
Búfer deTris para CH2
mantener el pH de la CH2
solución en el cual ADN se CH2
mantiene estable CH2

1% SDS para romper y abrir CH2
las membranas celulares y CH2
nucleares permitiendo que CH2
el ADN quede libre en la CH2
solución. O
O O
S
El detergente SDS O-
desnaturaliza y desdobla Na+
las proteínas dejándolas SDS
accesibles para las
proteasas.

•• La proteasa se utiliza para destruir
las proteínas nucleares que crean un
enlace con el ADN y para destruir
enzimas citoplasmáticas que degradan y
destruyen el ADN.
3. ¿Por qué
utilizamos la
proteasa? •• El tratamiento con proteasa
incrementa la cantidad de ADN intacto
que es extraído.

• • La solución de proteasa ya contiene sal.

•• Los iones de Na+ del NaCI forman
enlaces con los grupos de fosfato de las
4. Adición de la moléculas de ADN, neutralizando las
cargas eléctricas del ADN.
solución salina
•• La adición de NaCI permite que las
moléculas de ADN se junten en lugar de
repelerse una a la otra. De esta manera
se facilita la precipitación del ADN de la
solución al añadir el alcohol.

•• El ADN no se disuelve en alcohol.

•• El añadir alcohol hace que el ADN se
agregue y se precipite de la solución.

• Las moléculas del ADN precipitadas parecen
5. Precipitación un material fibroso, como los hilos blancos
de una telaraña.
del ADN con
• Las burbujas microscópicas de oxígeno, que
alcohol frío se generan al mezclar, se “agregan” al
precipitarse el ADN.

• Las burbujas visibles más grandes, levantan
el ADN fuera de la solución y lo llevan de la
fase acuosa a la fase orgánica (fase del
alcohol).

Pasos 10 − 12
Protocolo de
Práctica de
• 10. Lentamente añade 10 ml de alcohol frió
Laboratorio manteniendo el tubo a un ángulo de 45°. Este paso
va a requerir de varias adiciones utilizando la
pipeta de transferencia desechable.

• 11. Deje el tubo en posición vertical en la gradilla,
a temperatura ambiente y en reposo, durante 5
minutos ¿Que ve?

• 12. Cierre el tubo y voltéelo de lado y de regreso
en posición vertical, con mucho cuidado, unas 10
veces, hasta que las fases de agua y alcohol
queden mezcladas y el ADN salga de solución.

EXTRACCIÓN DE ADN
BIOMOL 2012
FMVZ
FRUTAS

• Extraer el material genético
(ADN) de células de guineo y/o
fresas.

• Establecer la relación entre el
proceso de extracción y
propiedades quίmico-fίsicas del
ADN

Solución amortiguadora o “buffer”

• 6 mL de detergente líquido de
fregar
• 5 g de sal de mesa
• 44 mL de agua destilada
• Una pizca de ablandador de
carne

Preparación de la solución

 Mida 6 mL del detergente en una probeta
de 10 mL. Vierta en un beaker de 100 mL.

Mida 44 mL de agua destilada. Vierta en
el “beaker” de 100 mL que ya contiene el
detergente. Evite la formación de burbujas.

Finalmente, aňada 5g de sal de mesa y el
ablandador de carne. Mezcle bien.

•Remueva la cáscara de un pedazo de guineo de una pulgada.

•Eche el guineo en una bolsa plástica con cierre de seguridad.
Cierre la bolsa.

•Macere el guineo (puede ser con la mano) hasta obtener una
consistencia bien blanda.

Continuación: Procedimiento
 Añada los 50 mL de la solución amortiguadora.
Cierre bien. Evite la formación de burbujas. ¿Por
qué?

 Con cuidado, coloque la bolsa en posición
horizontal sobre papel toalla. Asegúrese que el
macerado de guineo esté cubierto con la
solución amortiguadora. Espere 5 minutos.

¿Por qué el macerado debe estar cubierto por la
solución amortiguadora?

¿Por qué debe esperarse 5 minutos?

 Mientras esperan que
transcurran los cinco
minutos, presenten posibles
contestaciones a las
siguientes preguntas:

¿Cuál es la función del
detergente?

¿Cuál es la función de la sal?

¿Cuál es la función del
ablandador de carne?

 Coloque el paño sobre el vaso plástico y
filtre el macerado de guineo. Luego,
descarte el paño con el macerado. ¿Por
qué hay que filtrar?

 Utilice la regla para marcar dos tubos de
ensayo a una distancia de 1” y de 2” desde
abajo hacia arriba.

 Aňada a cada tubo de ensayo un volumen
del filtrado hasta que llegue a la marca de
1”.


 Añada al tubo de ensayo un volumen
de alcohol etílico 70%-90% frío hasta
llegar a la marca de 2”.

 Sin mezclar, coloque el tubo de ensayo
en una gradilla o en un vaso plástico.
Espere por 5 minutos.

Inserte en el tubo de ensayo una varilla de
cristal o removedor de café para remover el
ADN de la capa superior del alcohol. Coloque
el ADN en otro tubo de ensayo.
Continuación
:
Procedimient
o

Preguntas de análisis y discusión

¿Cuál, piensas tú, es
la función del
detergente en la
solución
amortiguadora?

Cuando el detergente entra en contacto con la célula, captura los lípidos y las proteínas.

¿Cuál es la función de la sal en la solución amortiguadora?

¿Cuál es la función del alcohol etílico?

Fundamentos, variantes
y
aplicaciones

REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

1985 - Mullis & Falloona
Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

DNA
PCR
Muchas
moleculas
(molecule sencilla) amplificación

Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades

• La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección
5’ 3’

• Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una
cadena nueva utilizando una hebra molde

• Las DNA polimerasas además de la hebra molde,
necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión)

• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-
dependiente.

ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN
LA SINTESIS DEL DNA POR PCR

Hebra Templado
Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de
nucleótidos complementaria a la hebra templado.
La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis
de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
DNA Polimerasa

PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC

50

0
Tiempo

3’ 5’
DNA de cadena 5’ 3’
doble

PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC

50

0
Tiempo
3’ 5’

DNA de
cadena simple
Calor

5’ 3’

PCR
Temperatura
100
Melting Melting
94 oC Extension 94 C
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

Hibridación
de primers

5’
5’ 3’

PCR
Temperatura
100
Melting Melting 30 ciclos
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’

Calor
5’

5’

Calor
5’
5’ 3’

PCR

Temperatura
100
Melting Melting 30ciclos
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’

PCR

Temperatura
100
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’
5’ 3’

Calor
5’

5’

Calor
5’

PCR
Temperatura
100
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’

PCR

Temperatura
100
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ Tiempo
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’

5’
5’

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se
duplica en cada ciclo de PCR.

Numero de copias
1 2 4 8 16 32 64

0 1 2 3 4 5 6
# ciclos

VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS

 ALTA SENSIBILIDAD
 ALTA ESPECIFICIDAD
 RAPIDEZ

DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)


• Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
• -T A C G
• -A T G C A T G C A T G C * *
Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser
copiada



5’ 3’
• -T A C G T



5’ 3’
• -T A C G T A



5’ 3’
• -T A C G T A C



5’ 3’
• -T A C G T A C G


5’ 3’
• -T A C G T A C G T



5’ 3’
• -T A C G T A C G T A


Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos
copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?


Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)


Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)

Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa

2

1

Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay
un rexceso de Primer 1

Ahora tenemos dos copias de la molécula original


Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusión Hibridización Extensión de 2do Ciclo
95 C 50-60ºC La cadena 95ºC
75ºC 50 - 60ºC
75ºC
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de
copias

Hay 7 componentes esenciales en el
proceso standard de PCR

• ADN polimerasa termoestable
• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)
• Buffer (para mantener el pH)
• Cationes divalentes
• ADN molde (Templado)

ADN polimerasas termoestables
• Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del
templado.
• Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C
• Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta
• Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3´, ej. Taq agrega una A al exremo 3´,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)
• La mas comunmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus
furiosus, Tli Thermococcus littoralis

Oligonucleótidos iniciadores (primers)
• Se conoce su secuencia
• Es el factor mas importante para la eficiencia y la
especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1
kb)
• Requieren de un cuidadoso diseño
• Reglas de diseño:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%


• Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del
proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
(c) Evitar las secuencias repetidas

5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’

3´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

Dímero de primer

Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

no hay extensión

5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-CGT

Formación de horquillas
5´ PCR
3´

5´
3´ 5´
3´

Productos de PCR no deseados


• Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del
proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 cycles, 1 kb)
(d) Valores de Tm de no mas de 5°C uno del otro

ADN molde (templado)
• Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble
cadena)
• ADN circular y cerrado es levemente menos
efectivo que el ADN lineal
• Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej:
1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de
bacteriano o 1 pg of plasmídico
• Se puede amplificar a partir de una sola molécula
de ADN molde, pero las condiciones deben estar
muy optimizadas

El ciclo de PCR
• Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%
• Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o
determinada empiricamente para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no específico = productos
incorrectos
• Extensión -
a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq
1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min
solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud
deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal

El ciclo de PCR
• Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%
• Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada
empiricamente para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos
• Extensión -
a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq

1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a
partir de allí se tornan en el producto principal
• Número de ciclos -
- algunos componentes se tornan limitantes despues de
30 ciclos (si el número inicial = 105 moléculas)
- se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia
única a partir de ADN genómico de mamífero DNA

TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR

 RT-PCR : detección de mRNA
 PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
 PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
 In situ PCR : detección en tejido mismo, ubicación del fragmento
 IC-PCR : inmunocaptura previa a PCR
 PCR-RFLP : polimorfismo genético (usado más que RAPDs)
 Real Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en tiempo real

PCR Multiplex

- Varias secuencias target en forma simultánea.
- La eficiencia de amplificación de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets
(%GC)
- Temperatura de hibridación de los diferentes
primers
- Tamaño de las diferentes secuencias target
- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.

Multiplex PCR

• Describe una PCR enla cual hay presentes
multiples pares de primers (hasta 8) lo que
da una serie de productos. Los mismos
pueden verse como múltiples bandas en un
gel de agarosa
• Multiplex PCR es frecuentemente usada en
diagnóstico médico
• Ahorra templado, tiempo y gastos
• Requiere una cuidadosa optimización

Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
RT-PCR • PCR
mRNA

OBJETIVO:
Detección de la expresión de un cDNA (simple cadena)
gen – por presencia de mRNA

cDNA (doble cadena)

PCR

Transcripción Reversa
1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)

Nested PCR
• A veces 1 ronda de PCR no da un producto único
producto a partir de un templado complejo,
apareciendo un “chorreado”
• Se puede resolver utilizando un segundo par de
primers que hibriden un poco mas internamente
que los primeros
• Realizar una segunda ronda de PCR usando el
producto de la primera (chorreado)
• Rinde un producto único porque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de
hibridización para el segundo par de primers

Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA

Nested PCR
1era PCR

Chorreado de ADN

2da PCR

ADN específico

Clonado con PCR: clonado T-A
A-3’ T-3'
3’-A 3'-T

Producto de PCR
a partir de Taq Vector con cola-T

ligamiento

T-3'
3'-T
A
A

Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor
que ligamiento con extremos romos

Mutagénesis por PCR
• Introduce cambios de secuencia dentro de
fragmentos (clonados) de ADN
• El método de extensión solapada requiere
2 primers mutagénicos y otros 2
• Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento
3´ que se solapan. Ambos portan la
mutación
• Usa los productos en otra reacción para
producir el ADN mutado de longitud
completa

Mutagenesis con PCR- extension solapada
Primer SP6 Primer mutagénico directo (forward)

Dos 1ras Primer T7
primer mutagénico inverso (reverse)
PCRs
separadas
X

x

remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar

x

2da PCR

x

RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa
• Para amplificar copias de cDNA de RNA
• Es especialmente útil cuando solose dispone de
pequeñas cantidades de RNA
• Frecuentemente usada para amplificar genes específicos
(como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida
• Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa
dependendinte de RNA
• Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA
• Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN
• Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el
duplex de cDNA por PCR

RT-PCR
mRNA AAAAAAAAAA-3’ Primer Antisense:
(sense) TTTTTTTTTT-5’ oligo(dT)o

Transcripción reversa

GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3’
TTTTTTTTTT-5’
1ra cadena cDNA
GSP (antisense)

PCR usando
GSP+GSP1
GSP1

GSP

Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

Immuno-PCR

- DETECCION DE ANTÍGENO ESPECÍFICO POR EL
ANTICUERPO ESPECIFICO

- ALTA SENSIBILIDAD - POR PCR

Immuno-PCR vs ELISA

S P

B
antibody with B
St antibody with E
linked enzyme
linked DNA

protein protein

Immuno-PCR ELISA

El Producto de PCR puede ser detectado por electroforesis o
por ELISA

APLICACIONES DE PCR EN MEDICINA

• Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano en
pacientes asintomáticos)
• Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)
• Evaluación de terapia - pronostico de recaída
• Detección de cepas resistentes a antibióticos
• Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en
pacientes con transplante de órganos (por inmunosupresión
y mayor riesgo a infecciones latentes)

MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER
SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR

•Sangre - Bacterias
•Mucosa - Hongos
•Tejido - Parásitos
•Orina - Virus
•Heces - Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de
genes

USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR
EN LA SOCIEDAD

• Medicina : Diagóstico Molecular:
Enfermedades geneticas
Enfermedades infecciosas
• Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad,
medicina forense, pedigree de animales, etc...)
• Mejoramiento genético en animales y plantas
• Productos biomédicos
• Terapia génica

REAL TIME PCR

INTRODUCCION
- PCR (estandar)
- RT-PCR
- PCR Cuantitativo (end point analysis)
- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de reacción)
- ventajas
- desventajas
- aplicaciones

Cuantificación de copias de mRNA

1. Diferencias en la expresión de genes (por efecto de drogas por
ejemplo)

2. La poca cantidad de mRNA disponible en ciertos procedimientos:
•células obtenidas por LCM (laser capture microdissection)
•cantidades pequeñas de tejidos
•células primarias

REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL

•Cuantificación del número de copias de DNA presentes en
la muestra (diagnóstico, monitoreo de carga viral,
comparación entre número de copias en diferentes
subespecies, etc.)
•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real
(análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos o en
diferentes condiciones normales vs patológicas, efecto de
drogas, etc)
•Análisis de la cinética de la reacción

PCR en tiempo real

• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.

• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de
producto formado en cada ciclo de PCR.

• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares,
SYBR Green

3. intensifier
5. ccd
detector
1. halogen
350,000
tungsten lamp 2b. emission pixels
filters

2a. excitation
filters
4. sample plate

Amplification Plot of real-time PCR

Log phase Level off/ plateau
DNA copy number (log)

2
4

8

16

32

PCR cycle (Ct)

PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.

ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeños

CURVA DE DENATURACION

Muesta el perfil de denaturación de los productos
amplificados.
Si un producto presenta un perfil de denaturación diferente
(valores de Tm diferentes), significa que es otro producto (no
específico) de amplificación, pueden ser dímeros.

Ventajas del PCR en tiempo real

• Simple y rápida (semi-automatizada).
• No hay manipulación post-PCR.
• Eliminación de contaminación por amplicones.
• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.
• Muy sensible.
• Detección de productos inespecíficos con la opción “curva
de desnaturalización” (Melt-Curve).
• Detección de más de un producto específico en una
misma reacción.
• Extraordinariamente específico.

Journal of Virological Methods 102:119-128, 2002

Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003

ELECTROFORESIS EN POLIACRILAMIDA

ElectroforesisGiovanniclase 10 febelectroforesisMaking an Agarose Gel.flv 2

Pulse Field Gel
Electrophoresis (PFGE)

E.coli O157:H7

Target
region
for
PFGE

Principle: Strain diversity

Insertion event

Foreign DNA

Host DNA

New Host DNA


Deletion event

Host DNA

Excised fragment

New Host DNA


Rearrangement event

Host DNA

New Host DNA

Practice

Cell suspension
abs ~1.8

24 hour culture

Lyse cells and wash
plugs
Make agarose plugs

Practice
Slice 2mm piece of
Restrict DNA in plugs plug

Load slices onto comb

Pour gel and remove comb

Electric current 18-20 hours
electrodes buffer 14 C

The Analysis Process: Normalization

• Blue Loading Buffer: 33 mM NaCl,
70 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2%
(w/v) SDS, 0.01 % (w/v)
bromophenol blue, 10% glycerol, pH
6.8 A 25 °C.

CR CR CR CR CR PTY PTY CR

1Kb plus DNA ladder( Invitrogen)

Bandas del fragmento mitocondrial ND2-WANCY
gel de agarosa al 1.5% (Sea Kem de Cambrex)
Tinción de Bromuro de Etidio y solución tampón de
1X TBE
Foto Analyst Investigator (Fotodyne)

• Verificación del producto de PCR.

• Para evidenciar la presencia y calidad de las bandas, se utilizaron 5
µl del producto amplificado y se realizó una corrida electroforética
en un gel de agarosa al 1.5% (Sea Kem de Cambrex) en tinción de
Bromuro de Etidio y solución tampón de 1X TBE, las bandas se
visualizaron y revelaron por exposición a la luz ultravioleta.
Posteriormente se procedió a tomar la foto del gel de corrida
mediante la revelación por exposición a luz ultravioleta, con una
cámara fotográfica Foto Analyst Investigator (Fotodyne) con filtro
para Bromuro de Etidio, la foto revelada del gel se imprimió en una
Digital Graphic Printer marca Sony. El tamaño del amplicón se
verificó mediante la comparación con un marcador de peso
molecular de 1Kb (Invitrogen).

• Autoradiografía (autoradiography) Técnica
que detecta moléculas marcadas con
radioactividad mediante la creación de una
imagen sobre una película fotográfica.

Autoradiografía de hibridización
Southern realizada con ADN de
plantas de maíz obtenidas por
cultivo de teji

BIOMOL

APLICADA

AL DIAGNÓSTICO
MÉDICO

Mutaciones

Alteración en la secuencia del ADN de un individuo que se transmite por
herencia.

Tipo de célula Germinal
Somática

Genoma nuclear Secuencia no codificante
Mutaciones

Genoma mitocondrial Secuencia codificante
Región estructural
Región reguladora

Anomalías cromosómicas
Magnitud Mutaciones medianas: secuencias repetidas
Mutaciones pequeñas o puntuales

Espontáneas
Mecanismo
Inducidas por mutágenos externos

Secuencia de acontecimientos de la enfermedad genética
Ej: mutación en un único gen, que afecta a una sola proteína

Gen normal
Herencia Expresión ARNm alterado
Mutación
Gen mutante

Función incorrecta Proteína anómala
Alteración de: enzima
receptor
- estructura
transportador
- capacidad de unión
Enfermedad hormona
- localización celular
colágeno
- estabilidad
factor de transcripción
- concentración
factor de coagulación
Síntomas - etc.
etc.
Clínicos

Estrategia de Diagnóstico Genético

La patología:

1) ¿Está asociada a una alteración cromosómica?

Si No 2) ¿Presenta herencia mendeliana?

Diagnóstico
Citogenético No
3) ¿Locus localizado? Si
Estudios de
asociación y factores
4) ¿Gen identificado? Si de riesgo
No Diagnóstico
por patrón de
No Diagnóstico indirecto con segregación
Si marcadores

Diagnóstico indirecto con
5) ¿Muchos alelos mutados?
marcadores

5) ¿Un alelo prevalente? Diagnóstico Directo

Estrategia de Diagnóstico Genético

La patología:

1) ¿Está asociada a una alteración cromosómica?

No 2) ¿Presenta herencia mendeliana?

3) ¿Locus localizado? Si

4) ¿Gen identificado? Si

Si

5) ¿Un alelo prevalente? Diagnóstico Directo

Diagnóstico Directo

• Máximo nivel de precisión en el diagnóstico:
Secuenciación del locus mutado (inviable su generalización)

• Generalmente el diagnóstico directo de una mutación se realiza mediante el estudio
de:
Cambios en la estructura primaria del ADN (secuencia).
Variaciones de tamaño; pérdida o ganancia de sitios de restricción.

Variaciones en sus propiedades físico-químicas.
Alteración de su movilidad electroforética o sus propiedades de
apareamiento.

Cambios en los productos génicos.
ARNm inestables o de tamaño distinto. Proteínas truncadas.

Herramientas para la detección de mutaciones

 Enzimas de Restricción

 Técnicas de separación electroforética de ác. nucleicos

 Hibridación de ácidos nucleicos

 Amplificación enzimática del ADN (PCR)

Enzimas de Restricción

 ALTA ESPECIFICIDAD: reconocen secuencias cortas de ADN
doble hebra y cortan ambas cadenas.
 Sitio de restricción: secuencia de reconocimiento.
 Clasificación:
Tipo I 3 subunidades que reconoce, metila y restringe (corta). El corte ocurre al azar
lejos del sitio de reconocimiento.
Tipo II 1 subunidad que reconoce y corta. El corte ocurre en el sitio de restricción o
adyacente. Interés en ingeniería genética y análisis de ADN.

Tipo III 2 subunidades y cortan el ADN a 25 pb
del sitio de reconocimiento.

1ª enzima
Eco RI descubierta
Escherichia coli
Cepa RY13

Papel biológico de las ER en bacterias

Acción de las ER Tipo II

Lugar de reconocimiento e hidrólisis del ADN
 Sitio de restricción
Secuencia palindrómica de 4-8 pb

Dos tipos de cortes:
romos y cohesivos

RFLP: Polimorfismo del largo de los fragmentos de restricción

RFLP en Análisis Genético Familiar

Mutaciones puntuales asociadas a Trombofilia

• La enfermedad tromboembólica venosa es un problema médico mayor
por su alta frecuencia, importante mortalidad y gran morbilidad.
• El abordaje clínico-terapeútico más racional para disminuir la
morbimortalidad es la prevención.
• Es esencial la identificación de pacientes con riesgo aumentado de
desarrollar trombosis.

Principales condiciones protrombóticas hereditarias

Grupo 1: Deficiencias hereditarias de factores inhibidores de la coag.
Pobl. gral. Pacientes Tipo de mutación
Def. Proteína C 0,2-0,5% 2-5% Heterogénea (>160)
Def. Proteína S 0,1% 2-5% Heterogénea (>69)
Def. Antitrombina <0,1% 1-2% Heterogénea (>79)

Grupo 2: Desórdenes hereditarios asociados a un aumento del nivel de factores de la
coagulación
Pobl. gral. Pacientes Tipo de mutación
FV Leiden 1-5% 20-60% Puntual
FII 20210A 1-3% 10-15% Puntual
niveles FVIII, IX y XI
niveles Lipoproteína A

Otros:
Hiperhomocisteinemia - MTHFR C677T
Deficiencia plasminógeno

Mutación de Leiden en Factor V

• RPCA: respuesta anticoagulante pobre del plasma a la proteína C.
• Causa de más del 90% de los casos de resistencia a PCA.

Diagnóstico Molecular de mutación de Leiden

Extracción de ADN a partir de sangre periférica

Exón 10 Intrón 10
Amplificación por PCR de la región codificante
del sitio de clivaje para PCA

Producto PCR: 147 pb

• La transición de G a A en la
Digestión del producto de PCR con enzima posición 1691 está asociada a la
de restricción Mnl I pérdida de uno de los sitios Mnl I.

Electroforesis en gel de agarosa

Diagnóstico Molecular de mutación de Leiden

25 37 85
Alelo normal • La transición de G a A en la
posición 1691 está asociada a
la pérdida de uno de los sitios
25 122 Mnl I.
Alelo mutado

Gel:

N/N M/M N/M
PM 1 2 3 4 5 6 7 M C- C+

122 pb
85 pb

37 pb
25 pb

Mutación 20210A en Factor II

• Mutación puntual: G por A en la posición 20210 de la 3´-UTR

Niveles incrementados
de protrombina
plasmática funcional

Mutación 20210A en Factor II

• Mutación puntual: G por A en la posición 20210 de la 3´-UTR

Niveles incrementados
de protrombina
plasmática funcional

• Prevalencia en población gral.: 1-3%
• Se detecta en el 10-15% de los pacientes con trombofilia
• Heterocigotas: riesgo incrementado 3-4 veces de sufrir TV.

Diagnóstico Molecular de mutación de 20210A

Extracción de ADN a partir de sangre periférica

Exón 14 3´-UT
Amplificación por PCR de la región 3´-UT
con primer mutado

Producto PCR: 506 pb ---------TTCGAA----
Mutado
---------AAGCTT----
Digestión del producto de PCR con enzima
de restricción Hind III ---------CTCGAA---
Normal
---------GAGCTT---

Electroforesis en gel de agarosa

Diagnóstico Molecular de mutación de 20210A

100 406
Alelo normal • La transición de G a A en la
posición 20210 está asociada
a la aparición de un sitio Hind
100 383 23 III.
Alelo mutado

Gel:

N/N M/M N/M

406 pb
383 pb

23 pb

Deficiencias hereditarias de inhibidores de la coagulación

• Deficiencia de proteína C, proteína S y antitrombina III.
• Prevalencia: <1% de la población general.

• Juntos representan el 5-10% de las alteraciones genéticas
encontradas en pacientes con trombosis venosa.

• Asociadas a un mayor riesgo de sufrir trombosis, manifestándose
como púrpura fulminante en neonatales homocigotas con deficiencia
completa.

Antitrombina: > 79 mutaciones

Proteína C: > 160 mutaciones

Proteína S: > 69 mutaciones

• Deficiencias difíciles de diagnosticar a nivel molecular

Trombosis venosa como enfermedad multifactorial

• En muchos pacientes se identifican más de un factor de riesgo genético y/o
adquirido.
• La combinación de factores genéticos con ambientales ejerce un efecto
aditivo sobre el riesgo a desarrollar trombosis.
• Condiciones trombofílicas ambientales o adquiridas:
- inmovilidad - estado post operatorio
- cáncer - uso de anticonceptivos orales
- tabaquismo - embarazo
- obesidad - terapia estrogénica
- síndrome antifosfolipídico

Importancia del diagnóstico de mutaciones asociadas a trombofilia

• Determinar causa del evento trombótico en el paciente.
• Detectar población de riesgo: medicina preventiva.
• ¿A quién se debe realizar el estudio?:
- Trombosis venosa en jóvenes < de 45 años
- Eventos trombóticos reiterados
- Pérdida de embarazo recurrente
- Previo a cirugía mayor, embarazo, anticonceptivos orales o
terapia estrogénica con historia familiar o personal de trombosis
- Familiar portador.

La trombosis venosa debe ser encarada como una
enfermedad crónica, poligénica, donde la ocurrencia
de eventos trombóticos es el resultado de la
interacción de causas genéticas y adquiridas.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN EL
FUTURO

MAPAS DE RESTRICCIÓN
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

•son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del
material genético a partir de una secuencia que
reconocen.

Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble,
donde reconocen secuencias palindrómicas

Tipos de enzimas de
restricción

Sistemas tipo I

Una sola enzima (multimérica que posee 3
subunidades) reconoce la secuencia específica de
ADN, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre
en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en
sitios distantes al de reconocimiento.

Sistemas tipo II

Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación.
La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó
adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en
genética molecular puesto que permiten romper el ADN
en sitios específicos, y así, recuperar secuencias
conocidas

Sistemas tipo III

Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima
oligomérica que realiza todas las actividades
enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más
allá del sitio de reconocimiento.

Ejemplos de enzimas de
restricción tipo II

Presentación biomol 2

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