1. Proteolitik Bakteriler Genel Bilgiler (Kaynak 1)1
01. Genel Bilgiler
02. Proteolitik Mikroorganizma Aranması
02.01. Kazein Hidrolizi Yöntemi
02.02. Jelatin Hidrolizi Yöntemi
03. Örneklerin Hazırlanması ve Ekim
04. Hızlı Yöntemler
04.01. İnce Tabaka Enzim Testi (Thin-Layer Enzyme Assay)
04.02. Hide Powder Azure (HPA) Testi
01. Genel Bilgiler
Gıdalar üzerinde gelişen bazı mikroorganizmalar proteinleri hidrolize ederek tat ve koku
bileşenleri üzerinde olumsuz etkiye neden olabilmektedir. Psikrotrofik mikroorganizmalardan
bazıları kuvvetli proteolitik özellikleri nedeniyle süt, et ve deniz ürünlerinde istenmeyen
değişikliklere neden olmaktadırlar. Özellikle depolama süresi boyunca bu mikroorganizmalar
çoğalmakta ve bazen gıdayı tüketilemeyecek hale getirmektedir.
Diğer yandan peynir gibi bazı gıdaların olgunlaşması ve yapılarının istenen düzeyde gelişmesi
mikrobiyel proteolitik aktivitenin bir sonucudur. Ancak süt, et, kanatlı etleri ve deniz
ürünlerinde proteolitik bakteri sayımı kalite kayıplarının değerlendirilmesinde önemli bir
mikrobiyel kriterdir.
Süt ve süt ürünlerinde bozulmaya neden olan psikrotrofik bakterideki, özellikle Pseudomonas
türleri tarafından üretilen proteaz enzimi, UHT işleminden sonra mikroorganizma canlılığını
yitirmesine rağmen enzim aktivitesini koruyabilmektedir. Isıya dayanıklı mikrobiyel
proteazlar sadece süt ürünlerinde değil protein yapısındaki diğer gıdalarda da aroma kaybına
neden olabilmektedir.
Proteolitik mikroorganizma türleri Bacillus, Clostridium, Pseudomonas ve Proteus cinsleri
içinde yer almaktadır. Bu bakterilerden başka bazı maya ve küf türleri de proteolitik aktivite
gösterebilmektedir. Enterococcus faecalis var. liquefaciens ve Micrococcus caseolyticus gibi
proteolitik aktivitenin yanında asit fermentasyonu da yapabilenlere asit-proteolitik
mikroorganizmalar denilmektedir.
1
Kaynak : Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları ; Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda
Mühendisliği Bölümü

2. 02. Proteolitik Mikroorganizma Aranması
02.01. Kazein Hidrolizi Yöntemi
Proteolitik mikroorganizmaların izolasyonunda genellikle kazein hidrolizinden
yararlanılmakta ve bu amaç için Skim Milk Agar (SMA) besiyeri kullanılmaktadır. SMA
besiyerinde gelişen koloniler etrafında kazeinin hidrolizi nedeniyle opak zonlar oluşmaktadır.
Ancak bazen kazein hidrolizinin erken aşamalarında opak zon tespit edilememekte, bazen de
SMA besiyerinde karbohidratları fermente edebilen diğer mikroorganizmaların oluşturduğu
zonlar hatalı değerlendirmelere neden olabilmektedir. Bu durumu ortadan kaldırmak amacıyla
Standart Method Agar besiyerine sodyum kazeinat, trisodyum sitrat ve kalsiyum klorür
katılarak modifiye bir besiyeri hazırlanmıştır. Bu besiyerinde kazein hidrolizi daha erken
aşamalarda tespit edilebilmektedir. Saydam bir yapıya sahip besiyeri üzerinde gelişen
koloniler etrafında oluşan presitasyon zonları kolayca tespit edilebilmektedir. Ayrıca besiyeri
çok iyi tampon özelliğine sahip olduğu için asit üretiminden kaynaklanan yanlış negatif
sonuçların alınmasını büyük ölçüde önlemektedir. Yapılan bir çalışmada çiğ sütte toplam
bakteri sayımlarında Standart Method Agar ve Standart Method Caseinate Agar (SMCA)
besiyerleri karşılaştırılmış ve bu iki besiyerinden elde edilen sonuçlar arasında önemli bir fark
olmadığı ortaya konulmuştur. Bu nedenle SMCA besiyerinin aynı anda hem toplam bakteri
hem de proteolitik mikroorganizma sayımında kullanılabileceği tespit edilmiştir.
02.02. Jelatin Hidrolizi Yöntemi
Besiyeri bileşimine protein kaynağı olarak jelatin katıldığında proteolitik aktivite sonucu
jelatin hidrolize olmakta ve katı besiyeri sıvılaşmaktadır. Bu amaç için Jelatin Agar (JA)
besiyeri ve çift tabaka ekim yöntemi önerilmektedir. Bunun nedenleri; yumuşak jelatin agar
besiyeri ile yapılan ikinci tabaka zayıf ve kuvvetli proteolitik tüm mikroorganizmaların
gelişmesine olanak sağlaması, ikinci tabakanın kolonilerin yayılarak birbirine karışmasını
önlemesi ve proteolitik enzimlerin yumuşak agar içine kolayca yayılması nedeniyle daha
geniş çaplı ve opak zonlar oluşturmasıdır.
03. Örneklerin Hazırlanması ve Ekim
Örnekler standart sayım yöntemlerine göre uygun seyreltmeleri yapıldıktan sonra SMA,
SMCA veya JA besiyerlerinden herhangi birine ekim yapılır. Petri kutuları genellikle 21 oC
'da veya üzerinde çalışılan gıdanın depolama sıcaklığına uygun bir derecede 72 saat
inkübasyona bırakılır. Sürme veya dökme kültür yöntemine göre ekim yapılan SMA
besiyerinde inkübasyon sonunda petri kutusuna besiyerinin yüzeyini kaplayacak miktarda % 1
HCl veya %10 asetik asit çözeltisi konularak 1 dakika beklenir. Süre sonunda fazla gelen asit
çözeltisi uzaklaştırılır ve etrafında opak zonlar oluşan koloniler sayılır.
SMCA besiyeri kullanıldığında ise uygun seyreltmelerden yayma kültür yöntemine göre ekim
yapılması ve petri kutularının 30 oC 'da 24-72 saat inkübe edilmesi önerilmektedir. Proteolitik
psikrotrofik mikroorganizmaların sayımında ise 7 oC 'da 10 gün inkübasyon gerekmektedir.
Süre sonunda etrafında beyaz veya kirli beyaz presipitasyon zonları oluşan koloniler
sayılmaktadır.

3. JA besiyerinde proteolitik mikroorganizma aranmasında önce standart yayma kültür
yöntemine göre ekim yapıldıktan sonra besiyeri üzerine 2,5 ml yumuşak JA besiyeri ikinci
tabaka olarak dökülür. 20 oC 'da 3 gün inkübasyondan sonra besiyeri üzerine 10 ml %5 asetik
asit çözeltisi ilave edilerek 15 dakika beklenir. Süre sonunda etrafında saydam zonlar oluşan
koloniler sayılır.
04. Hızlı Yöntemler
04.01. İnce Tabaka Enzim Testi (Thin-Layer Enzyme Assay)
Bu yöntemde içi protein yapısında bir madde ile kaplanmış polistren petri kutuları
kullanılmaktadır. Buna göre test edilecek mikroorganizmanın gelişebileceği en uygun besiyeri
petri kutusuna dökülerek önce besiyeri hazırlanır. Bundan sonra iki uygulama söz konusudur.
Birincide petri kutusu alttan iki noktadan işaretlenir. Bu noktalardan birine test edilecek
kültürden diğerine ise enzim (10,0 µg/ml tripsin) çözeltisinden birer damla ekim yapılır.
İkinci uygulamada ise besiyerinde aseptik olarak 3 mm çapında iki adet kuyucuk açılır.
Bunlardan birine test edilecek kültürün süpernatantı, diğerine ise enzim çözeltisi eşit miktarda
ilave edilir. Petri kutuları mikroorganizmaya göre optimum koşullardaki inkübasyona
bırakılır. Süre sonunda agar petri kutusundan uzaklaştırılarak petri kutusunun tabanı destile su
ile yıkanır ve kuru hava akımı uygulanarak petri kutusunun tabanı kurutulur.Daha sonra petri
kutusunun protein kaplanmış tabanına 1 dakika süre boyunca 50 oC 'da su buharı uygulanır.
Süre sonunda su buharı kondensasyonu olan alanlar cetvelle ölçülerek proteolitik ktivite
olarak kaydedilir. Bu yöntem kullanılan protein film tabakası nedeniyle oldukça hassas bir
yöntemdir. Enzim aktivitesi görülen bölgede hidrofilik protein film ile kaplanmış tabaka
kolayca uzaklaştırılmış hidrofobik polistren yüzeyin su buharlarını tutması sağlanmıştır.
Burada test için kullanılan besiyerinin bileşimine katılan agar % 2 oranında hazırlanmalıdır.
Daha yüksek oranlarda agar kullanılarak hazırlanan besiyerleri enzimin difüze olmasını
engelleyebilmektedir.
04.02. Hide Powder Azure (HPA) Testi
Süt içinde bulunan proteinazlar direkt olarak HPA (Sigma) substratı kullanılarak tespit
edilebilir. Bunun için test edilecek sütün pH 'sı 1,0 ; 0,5 veya 0,1 M NaOH kullanılarak 8,3 'e
ayarlanır. Vida kapaklı tüp içine konulan 5 ml süt içine 100 mg HPA ilave edilip 37 oC 'da 5
saat arada bir karıştırılmak suretiyle (HPA 'nın süspansiyon halinde kalması için) inkübasyona
bırakılır. Süre sonunda tüp buz içine daldırılarak hızlıca soğutulduktan sonra 800 g 'de 5
dakika santrifüj edilir. Daha sonra üzerine 1 ml dietileter ilave edilip yüksek hızda vorteks ile
1 dakika karıştırılır. Sonra 800 g 'de 15 dakika santrifüjlendikten sonra eter tabakası dikkatli
bir şekilde uzaklaştırılır. Eter ekstraksiyonu denilen bu aşama iki kez daha tekrarlandıktan
sonra son olarak üst tabaka 150000g 'de 60 dakika santrifüj edilerek kazein uzaklaştırılır.
Kazeinin uzaklaştırılması aşaması santrifüjleme yerine %2 triklorasetik asit presipitasyonu ile
de yapılabilmektedir. Son olarak HPA 'dan kaynaklanan mavi renk oluşumu
spektrofotometrede 595 nm dalga boyunda absorbans olarak tespit edilir.