1. Laboratorio
de Genética
DIAGNOSTICO MOLECULAR
DE ENFERMEDADES
ADRIANA MARIA GIL ZAPATA
Msc. CIENCIAS BASICAS
BIOMEDICAS

2. Laboratorio
de Genética
DESPLIEGUE DIFERENCIAL
No se requiere conocer la secuencia
del ARN y analiza alteraciones en el
ARNm.
Es una modificacion de RT-PCR
Inicia con cDNA-a partir de mRNA.
Usa 4 poli de timidina diferentes
unen a las colas de poliadenilacion
de los mRNA

3. DESPLIEGUE DIFERENCIAL Laboratorio
de Genética

4. Laboratorio
de Genética
DESPLIEGUE DIFERENCIAL
No tiene reproducibilidad y por tanto no se
aplica en el dx clinico.
La cantidad de ARN es pequeña.
Se observa la presencia o ausencia de una
banda no como en PCR por intensidad.

5. Laboratorio
de Genética
Enfermedades hereditarias
Confirmación a nivel molecular del defecto
Detectada la mutacion y confirmado el diagnostico
El efecto de la mutación en la proteína codificada:
Cambio de conformación
Alteración o perdida de función
Disminución en su expresión.

6. Laboratorio
de Genética
Diagnostico molecular
Actualmente no se detectan a los patógenos mediante
técnicas de cultivo que aislan al agente infeccioso,
podemos simplemente detectar la presencia del ADN del
patógeno directamente del espécimen clínico, lo cual
conlleva a un considerable ahorro de tiempo y dinero.

7. Laboratorio
de Genética
PARASITOLOGIA
El diagnóstico molecular consiste en extraer ADN y analizarlo con la
técnica PCR y detectar, en tiempo real, la amplificación del genoma
de interés.
El método clásico consiste en la detección del parásito en sangre o en
heces, pero este procedimiento es poco sensible, sobre todo cuando
el paciente tiene una baja carga parasitaria, lo cual puede ocurrir
incluso cuando los síntomas de la enfermedad son claros.
Un método de diagnóstico más avanzado es el inmunológico, que se
basa en la reacción que producen los antígenos en las muestras de
sangre, una técnica más sensible, pero poco específica, ya que
también se pueden producir reacciones con otros microorganismos
similares a los que se intentan detectar.

8. Laboratorio
de Genética
MICROBIOLOGIA
El diagnóstico serológico de utilidad en la clínica se
tiene solamente disponible para N. Brasiliensis pero
en todos los otros casos estos no es posible. Los
avances de la Biología Molecular a través de la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
permite detectar un número muy pequeño de
bacterias en cultivos aislados de pacientes infectados.

9. Laboratorio
de Genética
ADN
Las tecnicas que utilizan el ADN, tiene ventajas sobre
las proteinas, debido a que el ADN tiene la propiedad de
autoreplicarse y es posible obtner millones de copias en
el laboratorio clinico en horas gracias a la tecnica de
PCR

10. 5´ 3´
TIPOS DE POLIMORFISMOS
DE LONGITUD DE SECUENCIA
Se producen por inserciones o delecciones
Provocado por el cambio de uno o mas
de uno o mas nucleótidos.
nucleotidos en la secuencia de ADN.
Se observa mas frecuentemente en el ADN
Ej: mutaciones puntuales en el ADN-mt
repetitivo: minisatélites y microsatélites.
GGTTTTACATCACTGGAATCTTCCAAA
TTCTTGCTGGTAAGTTGTGGATGGTAA
AGTCCATGTGGAAG C/T GGGGTGCAT
GATA GATA GATA GATA GATA CCAAGTCTGCGGAATG
GATA GATA GATA
UNIDAD DE REPETICIÓN GATA
REGIÓN DE FLANQUEO

11. Laboratorio * POLIMORFISMOS DE ADN HIPERVARIABLE
de Genética
STRs: Short tandem repeat
ADN Repetitivo Microsatélite
Secuencias repetidas en tándem
Unidades de repetición: entre 2-7 pb
Tamaño: comprendido entre 80-550pb.
5´ 3´
TATC TATC TATC TATC TATC

12. (ATGA)n
STRs
2 VECES
A T G A A T G A
3 VECES
A T G A A T G A A T G A
4 VECES
A T G A A T G A A T G A A T G A
5 VECES
A T G A A T G A A T G A A T G A A T G A

13. Laboratorio
de Genética
PARA QUE QUEREMOS OTROS MARCADORES?
• Metodologías de alto rendimiento para:
Bases de datos de ADN (1 millón de perfiles por año)
Necesidad de grandes estudios de mt-ADN/ cromosoma Y
• Automatización-Miniaturización
• Mayor sensibilidad
• Mayor información (origen geográfico)
• Características físicas
• Análisis de ADN degradado

14. Laboratorio
de Genética
SNPs: Single Nucleotide Polimorphism
• Son polimorfismos de secuencia
• Es la variación mas frecuente en el genoma humano
• Se encuentran tanto en el ADN nuclear como en el mtDNA
• Presentan una tasa de mutación baja (Mutation rate 10-8)(STR 10-3)
• Son marcadores facilmente amplificables en multiplex
• Se analizan facilmente con técnicas de alto rendimiento
(ej:microarrays)
• 1 SNP cada 279 pb HapMap Bases : 13 millones SNPs
• Indels, Inserciones ALU
NCBI Database: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

15. Laboratorio
de Genética
Sequence variation
G
ATCGGCTAGCTGATCGACGATGACCGTAGCGTTGAT
T
CGGTAGGCTAGCTGAAACTTAACGGA
.
SNPs
ATTACTGATCGGTAGCTGAGCCAATGGCAGTGATGG
GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA
ATGGTAGCTGAGTGCTGGACAT Minisatel
Microsatellites or STRs
ATCGGCTAGCTGATCGACGATGACCCGGTAG
ATCTACGGATGGCTGACTGATG
ATCTACGGATGGCTGACTGATG
ATCTACGGATGGCTGACTGATG Minisatellites
ATCTACGGATGGCTGACTGATG
GTAGCGTCTGATCGTGATGGCTCGTTAGA
GTAGC[300bp -- 6.1kb units]ATCGGC SINES (Alu) / LINES

16. Laboratorio
de Genética
SNPs
Posibilidad de analizar características físicas
Predicción mas segura del origen geográfico de un
vestigio
Análisis de muestras degradadas (amplicones mas
pequeños
Resolución de casos complejos de parentesco

17. Laboratorio
de Genética
¿Por que son importantes los SNPs específicos de población?
AUMENTO DE MEZCLA DE POBLACIONES EN TODO EL MUNDO
Europeos 92%
Iberoamericanos 3.9%
Africanos 1.5%
Asiáticos 0.6%
Mezcla de población 1.9%
EL AUMENTO DE INMIGRACIÓN: africana, iberoamericana, etc.

18. Laboratorio
de Genética
SNaPshot
G AZUL
A VERDE
C NEGRO
T ROJO

19. Laboratorio
Preparación del chip para de Genética
análisis MALDI-TOF
Dispensador SpectroPOINT™
SpectroCHIP™ :
384 puntos

20. Laboratorio
de Genética
MALDI-TOF
Chip: muestra + matriz
Espectómetro:
1) láser, volatiliza la muestra
2) campo eléctrico acelera los iones
3) vuelo en columna de
vacío
4) sistema de detección
TOF: el tiempo de vuelo en la
columna es proporcional a la masa

21. Laboratorio
de Genética
SNPs Autosómicos: 52-plex
Selección de SNPs
Comprobación de frecuencias
Contenido polimórfico
Ligamiento
Calidad de la secuencia

22. Laboratorio
de Genética
Estrategia inicial
SELECCIONAR SNPs EN EL BRAZO CORTO Y EN EL BRAZO LARGO
DE CADA CROMOSOMA AUTOSÓMICO
PRUEBA PILOTO CON 22 SNPs EN UN MULTIPLEX CON SNapShot
HACER ESTUDIO DE LAS FRECUENCIAS ALÉLICAS

23. Laboratorio
de Genética
Validacion de SNPs elegidos
Los SNPs deben:
– Estar fuera de regiones repetitivas

24. Laboratorio
de Genética
Validacion de SNPs elegidos
Los SNPs deben:
– Estar fuera de regiones repetitivas
– Ser únicos: que solo se encuentren una vez en el
genoma

25. Laboratorio
de Genética
Validacion de SNPs elegidos
Los SNPs deben:
– Estar fuera de regiones repetitivas
– Ser únicos: que solo se encuentren una vez en el
genoma
– Tener buenas estimas de frecuencia

28. Laboratorio
Ligamiento de Genética
Límite de proximidad
de los SNPs candidatos
a genes es 100Kb.

29. Laboratorio
de Genética
Posicion de los SNP

30. PowerPlex16 system AmpFlSTR Identifiler
AmpFlSTR Minifiler NIST’s MiniNC01

31. Laboratorio
de Genética
• El saber si los SNPs van a sustituir o no a los STRs es
difícil de predecir. Sin embargo son una herramienta
complementaria a los STRs en aplicaciones como el
estudio de muestras degradadas, paternidades
deficientes o para determinar el origen geográfico de un
vestigio biológico e incluso para inferir características
físicas
• La creación de grandes multiplexes es la llave para el
análisis forense, que con los SNPs y las nuevas
tecnologías se flexibiliza y se hace posible

32. Laboratorio
de Genética

33. Laboratorio
de Genética

34. Laboratorio
de Genética

35. Laboratorio
de Genética

36. Laboratorio
de Genética

37. Laboratorio
de Genética
EPIDEMIOLOGIA
Síndrome Lesch-nyhan
Frecuencia 1 : 380.000 nacidos vivos.
Edad de aparición 1 a 2 años.
Mas afectados los hombres que las
mujeres.
Expectativa de vida tiene un promedio
de 20 años.

38. Laboratorio
de Genética
HERENCIA
Síndrome Lesch-nyhan
Recesiva ligada al
cromosoma X
Los hombres están
afectados o sanos.
Las mujeres:
sanas, portadoras
o afectadas.

39. Laboratorio
de Genética
Actividad residual HGPRT
Variante hiperuricemica:
Actividad residual HGPRT Mayor de 8%.
Sobreproducción de ácido úrico,
asociada
con nefrolitiasis y gota.

40. Laboratorio
de Genética
Actividad residual HGPRT
Variante neurológica:
Actividad residual HGPRT: 1.5 - 8%.
Sobreproducción de ácido úrico,
incapacidad neurológica menor.

41. Laboratorio
de Genética
Actividad residual HGPRT
Enfermedad de Lesch-Nyhan:
Actividad residual de la enzima
HGPRT:
menor 1.5 %.
Sobreproducción de ácido urico,
incapacidad neurologica y
cognitiva,
anormalidades en el
comportamiento
caracterizado por automutilacion

42. Laboratorio
de Genética
AFECTADO
Síndrome Lesch-nyhan

43. Laboratorio
de Genética
AFECTADO
Síndrome Lesch-nyhan

44. Laboratorio
de Genética
GEN HPRT
Mapeado Xq26, 57Kb.
Clonado y secuenciado más de 300
mutaciones.
9 Exones y 8 Intrones.
30% secuencias no codificantes
consisten en STRs y 49 repeticiones
Alu.

45. Laboratorio
de Genética
GEN HPRT
INTRÓN 3
Exones Tamaño Intrones Tamaño
TCTA TCTA TCTA TCTA (pb) (pb)
EXON 1 26 INTRON 1 13075
EXON 2 106 INTRON 2 1715
EXON 3 183 INTRON 3 11103
EXON 4 65 INTRON 4 3659
EXON 5 17 INTRON 5 3301
EXON 6 82 INTRON 6 4794
EXON 7 46 INTRON 7 170
EXON 8 78 INTRON 8 1343
Referencia:Edwars A, Voss H. Rice P. Civitello A.
Stegemann J. Schwager C. Zimmermann J, Erfle H. EXON 9 47
Caskey CT. Ansorge W: Automated DNA sequencingOf the
human HPRT locus. Genomics 6:593,1990.

46. Laboratorio
de Genética
MUTACIONES
Síndrome Lesch-Nyhan
VARIANTE
VARIANTE
MUTACIONES LESCH-NYHAN HIPERURICEMI
NEUROLÓGICA
CA
Puntuales 111 55 5
Deleciones 60 2 3
Inserciones 19 1 0
Otras 5 5 0

47. Laboratorio
de Genética
METODOLOGIA n = 16
Síndrome Lesch-nyhan
Consentimiento
informado
Sangre venosa
Extracción ADN
Extracció
PCR STR HPRTB Secuenciación
CHELEX
Electroforesis capilar
Genotipificación

48. Laboratorio
de Genética
INTRON 3 GEN HPRT
STR HPRTB
Fluorocro Composició
Composició
Primer Alelos Longitud
mo n secuencia
S: 5’TCTCTACTGTCT3’
5’ TCTCTACTGTCT3
9- 268-
6 FAM
17 300pb (TCTA)n
AS:5’TCACCCCTGTCT3’
AS:5’ TCACCCCTGTCT3
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA = Alelo 5
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA = Alelo 6
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA = Alelo 7
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA = Alelo 8
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA = Alelo 9

49. Laboratorio
de Genética
ELECTROFEROGRAMA STR HPRTB

50. Laboratorio
de Genética
ARBOL GENEALOGICO
STR HPRTB

51. Laboratorio
de Genética
SECUENCIACION
Delecion de una
Adenina en el
exon 2, ocasiono
un cambio de
lectura con un
codon de parada

52. Laboratorio
de Genética
CONCLUSIONES
Se caracterizo una mutación en el exón 2 del
gen HPRT analizado en los miembros de la
familia colombiana afectada por el SLN.
El STR del Cromosoma X (HPRTB), localizado en
el Intrón 3 del gen HPRT permitió establecer el
estado de portadora en las mujeres de la familia
afectada por el SLN.

53. Laboratorio
de Genética
CONCLUSIONES
La detección de portadoras es una
herramienta valiosa en esta enfermedad
en la cual no existe un tratamiento
efectivo, y por tanto la consejería genética
puede contribuir a disminuir la aparición
de nuevos casos.
El SLN, tiene diferentes mutaciones en
cada uno de los exones e intrones del gen
HPRT , esto hace que el abordaje sea
muy complejo y costoso a la hora de
caracterizar la mutación que dió origen a
la enfermedad en cada familia.