野菜についているカビの一種である、Pernosporaを検出するシステムを開発しました。より安全な、食料は健康へと繋がることになると考えられます。

1. Pernospora(カビ)検出システムの開発
ホウレンソウ、バジル
つくば遺伝子研究所
http://www.tsukuba-genetech.com/

2. 開発経過
実験１:バジル、ネギ、ほうれん草から高分子DNAの調製した。
実験２: 実験１で調製したDNAを鋳型とし、プライマーはpernospora検出用セットを
用いてPCRを行った。その結果、ほうれん草にpernosporaが見つかった。
もう一つの可能性として、「ほうれん草以外の植物由来のDNAにも、 pernosporaの
DNAはあるが、調製されたDNAにPCR阻害物質があって、PCRが働かなかったため
pernosporaが見つからなかった」という可能性を排除するために、実験３を行った。
実験３: 実験１で調製したDNAに予め、合成pernospora鋳型を混ぜておき、実験２
と同じPCRを行った。 その結果、 pernosporaのPCR産物は全てに、検出されたの
で、上の仮説は排除された。
この検出用セットは、マウス・ハムスターDNAを検出せず、プライマーダイマーも形
成されない（検証済み）。
結論 : 本システムでバジル、ネギ、ほうれん草等から、
pernospora(カビ)を検出することが出来た。

3. １1 2 3 4 5 6 7
調製したDNA
1. サイズマーカー λHindIII+φXHaeIII
2. ネギ
3. ネギ
4. ほうれん草
5. ほうれん草
6. バジル
7. バジル
PCR条件
95C 7min
>[95C 30sec >59C 30sec>72C 30sec]x30cycles
>72C 5min
DNA量 50ng
プライマ－: pernospora検出用セット
電気泳動 2.5% agarose
PCR産物 104塩基対
1: サイズマーカー 100bp ladder
2: 蒸留水
3: ほうれん草
4: ネギ
5: バジル
6: イネ
7: 合成 pernospora鋳型
1 2 3 4 5 6 7 8
実験１
実験２ PCR1
実験３ PCR2
PCR条件
95C 7min
>[95C 30sec >59C 30sec>72C 30sec]x30cycles
>72C 5min
DNA量 50ng
プライマ－: pernospora検出用セット
電気泳動 2.5% agarose
PCR産物 104塩基対
1: サイズマーカー 100bp ladder
2: 蒸留水
3: ほうれん草 + 合成 pernospora鋳型
4: ネギ + 合成 pernospora鋳型
5: バジル + 合成 pernospora鋳型
6: イネ + 合成 pernospora鋳型
7: 合成 pernospora鋳型
1 2 3 4 5 6 7

4. 実験４ pernosporaに感染していると考えられるバジル2株からDNAを抽出し、本件
で開発したプイラマーで検出できるかを検討
M 1 2 3 4
M: マーカー 100bp ラダー
1 : 実験2のほうれん草(I県産)
2 : 実験2のO県産バジル
3 : Sample1 バジル
4 : Sample2 バジル
結論: 今回検討した２株のバジルは共に、pernosporaが感染していた。また、実験２で使用した
ほうれん草も、シグナルは検出された。一方、実験２で使用したO県産バジルには、実験２同様
シグナルは検出されなかった。再現性は担保されている。
203bp
sample
M 1 1 2 2
各サンプルから独立に2回DNAを抽出
M: λHindIII+φXHaeIII
PCR条件
95C 7min
> [95C 30sec >59C 30sec >72C 30sec]x30cycles
>72C 5min

5. 開発経過２
実験５:バジルに感染するPeronospora belbahriiを他のPeronosporaと区別するプラ
イマーを開発した（L-primer: BasilL1, R-Primer: PernoR） 。
プライマーセット
L-primer: PernoL, R-Primer: PernoR
ホウレンソウ シグナルあり
バジル シグナルあり
L-primer: BasilL1, R-Primer: PernoR
ホウレンソウ シグナルなし
バジル シグナルあり
実験６：実施例１
実験７: 実施例２
結論 : 本システムでバジル特異的な pernospora(カビ)を検出することが出来た。

6. 実験５
1 2 3 4
1 2 3 4 M
結論: 開発したプイラマーセットは、２株のバジルは共に、pernosporaは感染していることが確
認されたが、ほうれん草ではシグナルが検出されなかったことから、予定通り、バジルに特異
的に感染する Peronospora belbahriiだけを検出できることが示唆された。
PCR条件
95C 7min
> [95C 30sec >59C 30sec>72C 30sec]x30cycles
>72C 5min
M: マーカー 100bp ラダー
1 : 実験2のほうれん草(I県産)
2 : 実験2のO県産バジル
3 : Sample1 バジル
4 : Sample2 バジル

7. 実験６ バジルの葉（サンプル１，２，５）及びバジル種子（サンプル３，４）について、DNA
抽出を行い、 Peronospora belbahriiの検出を試みた。
解析条件は、これまで条件と全く同じ、但しプライマ－は、L-primer: BasilL1, R-Primer: PernoR (共通)
結果
１．従来の方法でDNAを抽出した。１サンプルにつき2か所から独立に抽出を行った（抽出１、２）。バジルの葉（1
枚）のDNAは問題なく抽出された。バジル種子（300-320mg）は今までの種子とは性質が異なり、抽出効率は悪い
がPCR grade のDNAは抽出された。特にバジル種子3は電気泳動で薄いながら確認できた（ODでは～10ng/μl）。
２．独立で抽出したすべてのサンプルをPCR反応し、 Peronospora belbahriiの検出を試みた。
判定）
バジル葉 1, 2 : 陽性
バジル葉 5 : 陰性
バジル種子 3, 4 : 陽性 （4は弱い感染）
DNA抽出後の電気泳動 PCR後の電気泳動
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1: 日本ジーン marker1
2: バジル葉 1 (抽出1)
3: バジル葉 1 (抽出2)
4: バジル葉 2 (抽出1)
5: バジル葉 2 (抽出2)
6: バジル葉 5 (抽出1)
7: バジル葉 5 (抽出2)
8: バジル種子 3 (抽出1)
9: バジル種子 3 (抽出2)
10: バジル種子 4 (抽出1)
11: バジル種子 4 (抽出2)
1, 15: 100bp ladder marker
2: 水
3: negative control
4: positive control
5: バジル葉 1 (抽出1)
6: バジル葉 1 (抽出2)
7: バジル葉 2 (抽出1)
8: バジル葉 2 (抽出2)
9: バジル葉 5 (抽出1)
10: バジル葉 5 (抽出2)
11: バジル種子3 (抽出1)
12: バジル種子3 (抽出2)
13: バジル種子4 (抽出1)
14: バジル種子4 (抽出2)

8. 実験７ バジルの葉（サンプルA, B）及びバジル種子（サンプルA, B）について、DNA抽出
を行い、 Peronospora belbahriiの検出を試みた。
解析条件は、これまで条件と全く同じ、但しプライマ－は、L-primer: BasilL1, R-Primer: PernoR (共通)
結果
１．従来の方法でDNAを抽出し、１サンプルにつき2か所から独立に抽出を行った（抽出１、２）。
バジルの葉（1枚）及びバジル種子（300-320mg）のDNAは問題なく抽出された。
２．独立で抽出したすべてのサンプルをPCR反応し、 Peronospora belbahriiの検出を試みた。
判定）
バジル葉 A, B: 陰性
バジル種子 A, B: 陰性
DNA抽出後の電気泳動 PCR後の電気泳動
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1: 日本ジーン marker1
2: バジル葉 A (抽出1)
3: バジル葉 A (抽出2)
4: バジル葉 B (抽出1)
5: バジル葉 B (抽出2)
6: バジル種子 A (抽出1)
7: バジル種子 A (抽出2)
8: バジル種子 B (抽出1)
9: バジル種子 B (抽出2)
10:日本ジーン marker1
1: 100bp ladder marker
2: 水
3: negative control
4: positive control
5: バジル葉 A (抽出1)
6: バジル葉 A (抽出2)
7: バジル葉 B (抽出1)
8: バジル葉 B (抽出2)
9: バジル種子A (抽出1)
10: バジル種子A (抽出2)
11: バジル種子B (抽出1)
12: バジル種子B (抽出2)