Como desenhar um primer

Hinweis der Redaktion

1. No site do NCBI (National Center for Biotechnology Information), na database “Nucleotide” (1.), pesquisa-se a sequência de mRNA desejada (2.).
2. Você vai encontrar assim, o registro relacionado à sua pesquisa. Clicando no botão “FASTA” (3.), você obtém a sequência completa de gene. Além disso, clicando em CDS, você obtém o a sequência de domínio conservado dentro da sequência completa.
3. Assim, de acordo com a sequência obtida em CDS, torna-se possível localizar o códon de início (verde) e o códon de parada (vermelho).
4. No site da ThermoFisher você pode localizar a ferramenta OligoPerfect™ Designer a partir da qual é possível desenhar seu primer através de quatro passos iniciais simples: a) Dar um nome para a sua sequência, b) selecionar a aplicação “PCR: detection”, c) Identificar o pesquisador e d) Colar, sem espaços, a sequência obtida no CDS, desde o códon de início até o de parada.
5. O passo seguinte é configurar os primes que serão desenhados às condições da sua reação. Alguns parâmetros podem ser ajustados: um primer ideal não pode ser muito longo e nem muito curto; logo, escolhe-se um primer com aproximadamente 20 pares de bases. Outra característica importante, que poderia ser classificada até como principal, é a Tm - temperatura de melting (ou anelamento), de forma que, você padroniza a Tm do primer desenhado às condições padrão da sua reação. Além disso, o percentual de Guanina-citosina (%GC) irá determinar a ligação das bases complementares o seu primer, uma vez que GC fazem três pontes de hidrogênio enquanto que AT fazem apenas duas. Em “Region of Analysis” é possível determinar se o primer desejado será desenhado em qualquer local das sequências de pares de bases ou em uma sequência específica. O tamanho de produto de PCR obtido também pode ser configurado, de forma a não serem desenhados primers para produtos muito pequenos, levando a um certo grau de inespecificidade na reação e nem a uma sequência muito grande, gerando uma reação demorada e dispendiosa. Outras condições podem ser ajustadas, como a concentração de sal assim como do oligonucleotídeos no produto fornecido pela Termofisher e também você pode determinar quantas sequências de pares de primers vocês deseja que a ferramenta desenhe (obviamente, respeitando as condições probabilísticas dentro da sequência fornecida as software).
6. Sendo assim, o software vai elencar os pares de primers que, segundo a matemática do sistema, são adequados para aquela sequência de mRNA. Clicando em “Highlight Target Sequence”, torna-se possível observar na sequência original, onde localiza-se o primer sense (amarelo) e onde o primer anti-sense é complementar invertido (laranja)
7. Uma ferramenta, bem simples e útil é a “reverse complement”, onde você apenas fornece as bases do seu primer anti-sense e obtém o complementar invertido (seta) a fim de localizar na sua sequência “FASTA” onde seu primer é complementar invertido.
8. Sendo assim, você obtém o seu produto de PCR na sequência FASTA (sublinhado), desde o primer sense (amarelo) até o complementar invertido do anti-sense (cor-de-rosa).
9. Adicionalmente, no site do NCBI, é possível utilizar a ferramenta “BLAST” (seta vermelha), a partir da qual se verifica o índice de homologia dos primers obtidos com a sequência desejada. O BLAST é uma ferramenta que verifica a probabilidade de alinhamento em sequências específicas. Aqui, você pode verificar BLAST de proteínas ou de Nucleotídeos; evidentemente, você deve escolher a opção Nucleotídeo (seta verde).
10. Sendo assim, ao se colar a sequência de pares de bases e selecionar as opções “Nucleotide Collection” e “Others”, é possível pesquisar a homologia da sequência fornecida com outras sequências de nucleotídeos de quaisquer espécies no banco de dados do NCBI. Ao se preencher as informações requeridas, clicar em ‘BLAST’ (seta vermelha).
11. Logo, se obtém no banco de dados do NCBI quais sequências registradas podem gerar alinhamento significativo com a sequência de pares de bases fornecida. Dentre os resultados obtidos, encontram-se sequências de mRNA, como o RNA pretendido o qual está ressaltado em vermelho, além de cDNA, etc... O que se pode observar, de acordo com os dados obtidos é que a sequência fornecida, além de relacionada ao produto desejado, é espécie-específica; ou seja, relacionada apenas a nucleotídeos da espécie Mus musculus.