EVOLUCION DE LA ENFERMERIA QUIRURGICA Y ETICA 1.pptx
I Jornada Actualización en Genética Reproductiva y Fertilidad
1. Aplicación de sistemas de secuenciación
masiva (NGS) en el Screening Genético
Preimplantacional (DGP-a)
Laboratorio de
GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
TECNALIA
Bilbao,15 Diciembre 2016
3. Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la
genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad
tecnológica:
Secuenciación Masiva
Secuenciación Capilar
DNA Microarray
PCR a Tiempo Real
Cultivo celular
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
4. El Laboratorio de Genética estructura su actividad en torno a cuatro pilares
fundamentales fuertemente conectados entre si:
PROYECTOS I+D DIAGNÓSTICO GENÉTICO
ONCOLOGICO*
GENÉTICA PREIMPLANTACIONAL*
ANALISIS DEL MICROBIOMA
(METAGENOMICA)
* TECNALIA es el Primer centro
Autorizado por el Departamento de
Salud del Gobierno Vasco
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
5. DIAGNÓSTICO GENÉTICO ONCOLÓGICO
Diagnóstico de Síndromes Tumorales Hereditarios
Síndrome de Mama y Ovario Hereditario (CMOH): BRCA1, BRCA2, CHEK2, ATM,
RAD51C, BRIP, PALB2, BARD1, PTEN, TP53, STK11, FANCD, CDH1, NBN, NF1 y MUTYH
Síndrome de Cáncer Colorectal Hereditario (CCH): MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, PMS1,
EPCAM, APC, MUTYH, TP53, PTEN, STK11, SMAD4, CDH1 y BMPR1A
Cáncer de Páncreas Hereditario, Melanoma maligno familiar, Carcinoma Medular
de Tiroides…
Diagnóstico de enfermedades Neoplásicas (tumores somáticos)
Selección del tratamiento apropiado.
Aumentar la eficacia del tratamiento farmacológico.
Disminuir los efectos adversos.
Clasificación / Estratificación de Pacientes en Ensayos Clínicos (EECC).
Identificación de biomarcadores predictivos (“Companion Diagnostics”).
6. PROYECTOS I+D
Tecnalia desarrolla distintos proyectos I+D en ámbito de la identificación de
biomarcadores de diagnóstico y desarrollo de nuevos sistemas de análisis:
ONCOLOGÍA
Utilización de nuevos marcadores moleculares de diagnóstico (PROSDIAG)
Plataforma de análisis predictivo de respuesta a tratamientos (ONKOCHANCE)
Biomarcadores pronóstico en cáncer colorrectal
Nuevos biomarcadores diagnóstico en cáncer de pulmón.
Plataforma para la Caracterización del Paciente Oncológico (HEDAI)
GENÉTICA REPRODUCTIVA
Nuevas estrategias de análisis de Aneuploidías cromosómicas
Implementación de la tecnología NGS (Next Generation Sequencing) para la
identificación de mutaciones (DGP) y alteraciones cromosómicas (PGS) en
embriones.
7. ANÁLISIS DEL MICROBIOMA (METAGENÓMICA)
Análisis e identificación, mediante la
secuenciación de fragmentos génicos
específicos, de las poblaciones microbianas
presentes en diferentes muestras
ambientales.
• Composición microbiana de diferentes
suelos en áreas de cultivo
• Análisis del microbioma bucal y el efecto
de diferentes nanocomponentes de
implantes dentales
• Estudio del microbioma intestinal asociado
al desarrollo de alimentos probióticos
9. ANEUPLOIDÍAS CROMOSÓMICAS
Cambio en el número de cromosomas característico de la especie.
22 parejas + cromosomas sexuales. 46 cromosomas
ANEUPLOIDÍA EMBRIONARIA
ERROR MEIOSIS
Alteraciones
segregación de
cromosomas
ERROR MITOSIS
Alteraciones
segregación de
cromosomas durante
primeras divisiones
embrión
Gametos Aneuploides
10. ANEUPLOIDÍAS EMBRIONARIAS
Las aneuploidías constituyen la causa mas importante de aborto espontáneo o fallo
de implantación.
70% abortos espontáneos 1er trimestre: anomalías cromosómicas (Kung A. Reprod Biomed.
2015)
90% embriones aneuploides abortan (Munne S. Fertil Steril 2005)
11. Aneuploidías embrionarias altamente frecuentes en la especie humana
ANEUPLOIDÍAS EMBRIONARIAS vs EDAD MATERNA
> 50% de los embriones IVF aneuploides durante las primeras divisiones (estadío cleavage)
Las aneuploidías están fuertemente asociadas a la edad materna: aumento % de
embriones aneuploides en madres de edad avanzada
%EmbrionesAneuploides
Edad Materna (Años)
(Franasiak, JM, et al)
(Wells, D. et al)
Edad Materna (Años)
Tasadeimplantación
13. SCREENING GENETICO PREIMPLANTACIONAL (PGS/DGP-a)
Técnica de diagnóstico prenatal que se realiza en embriones generados durante un proceso de
Fecundación In Vitro (FIV) y tiene como finalidad la identificación de alteraciones en el número de
cromosomas del embrión.
TasaImplantación(%)
TasaAborto(%)
Harton et al, Fertil Steril 2013
PGS NO-PGS
PGS NO-PGS
% Implantación (No PGS vs PGS)
Yang Z; Mol Cytogenet. 2012 aCGH 46% vs 69%
Yang Z; Mol Cytogenet. 2013 aCGH 33% vs 65%
Scott RT; Fertil Steril qPCR 47,9% vs 66,4%
16. ΔΔCt
Análisis simultáneo de 24 cromosomas
Método Rápido. No requiera WGA
4 Marcadores/cromosoma
Pocas muestras/ensayo
Requiere más de una célula de partida
qPCR
17. MICROARRAYS ADN
aCGH
SNP arrays
Análisis simultáneo de 24 cromosomas
Múltiples Marcadores/cromosoma
Tiempo analisis ≈24h
No poliploidías
Solo 1 muestra/ensayo
Análisis simultáneo de 24 cromosomas
Detección de triploidías, DUP, traslocaciones
Requiere analizar padres
Tiempo de análisis largo
19. Amplificación Genoma
PCR-Based
Amplificación Lineal
Mixtos (Sureplex)
+
Secuenciación
ACGGTAGCTAGCTAA
Miles de secuencias o “reads” a lo largo de diferentes regiones del genoma
Fragmentación Adaptadores
SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
20. ACGGTAGCTAGCTAA
Alineamiento de las secuencias a un genoma de referencia
Únicamente se secuencia una pequeña parte del genoma (aprox 0,1X)
Los fragmentos secuenciados se alinean con su correspondiente
secuencia en cada uno de los 24 cromosomas
SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
35-150 bp
22. SCREENING GENETICO ANEUPLOIDÍAS NGS
El recuento del número de lecturas en cada cromosoma
es un indicador del numero de copias del cromosoma
NumerodelecturasNormalizado
Euploide
Muestra
NumerodelecturasNormalizado
27. MULTIPLEXADO DE MUESTRAS (REDUCCIÓN DE COSTE/ANALISIS)
Amplificación
Genoma
+
Fragmentación Adaptadores
Muestra1Muestra2
Amplificación
Genoma
+
Adaptadores
CGTA
TACC
Embrión 1
Embrión 2 TACC
TACC
TACC
CGTA
CGTA
CGTA
VeriSeq Illumina posibilidad de analizar hasta 24 embriones simultáneamente
28. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MOSAICISMO
Msaico 46/45n
Secuenciación Masiva mayor rango
dinámico y sensibilidad que otras
tecnologías
Identificación de alteraciones 20%
células biopsiadas: Mosaicismo
29. Significado clínico del mosaicismo???. Transferencia vs No transferencia????
Embriones mosaicos tienen menor probabilidad de implantación.
IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: MOSAICISMO
No obstante, la implantación del embrión y embarazo es posible.
La transferencia de estos embriones puede ser considerada en determinadas situaciones
Fert and Steteril, 2016
Scott RT, et al., Fert and Steteril, 2016 Wells D, et al., Fert and Steteril, 2016
30. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: TRASLOCACIONES
NGS detección de ganancias o pérdidas de material genético (aneuploidías)
Poco eficientes en la identificación de alteraciones que NO asociadas a cambios en el
contenido de ADN: TRANSLOCACIONES BALANCEADAS
No obstante, individuos portadores de Translocaciones Balanceadas alta probabilidad
de formar gametos “desequilibrados”
Individuos fenotípicamente normales, pero:
• Infértiles: Altas tasas de aborto espontáneo/fallos de implantación
• Altas probabilidades de nacimientos con anomalías congénitas o
retraso mental
Aneuploidía
Cromosómica
Embrión
31. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: TRASLOCACIONES
El objetivo de PGS en estos casos:
Identificación de embriones con complemento de cromosomas
normal/equilibrado
Disminuir el riesgo de anomalías congénitas
Incrementar las tasas de embarazo y nacimientos en parejas infértiles
32. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: ANEUPLOIDÍAS SEGMENTALES
Alteraciones que conllevan la pérdida o ganancia de un pequeño fragmento
cromosómico
Origen:
Fallos en la meiosis durante formación de gametos
Primeras divisiones mitóticas del embrión
Translocaciones Balanceadas/No Balanceadas
Secuenciación masiva aumento de la resolución de análisis: 6-14 Mb
33. Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la
genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad
tecnológica:
Secuenciación Masiva
Secuenciación Capilar
DNA Microarray
PCR a Tiempo Real
Cultivo celular
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
34. Colaboramos con el sector biosanitario dentro del ámbito de la genética y la
genómica funcional, aportando nuestro conocimiento y capacidad
tecnológica:
Secuenciación Masiva
Secuenciación Capilar
DNA Microarray
PCR a Tiempo Real
Cultivo celular
LABORATORIO DE GENÉTICA DE TECNALIA
36. IDENTIFICACIÓN DE OTRAS ALTERACIONES: DNA MITOCONDRIAL???
30-40% embriones Euploides: NO IMPLANTAN
OTRAS CAUSAS: DNA Mitocondrial??
DNA Mitocondrial elevado:
embriones Aneuploides
embriones derivados de mujeres de avanzada edad
30% embriones euploides no implantan
NGS
cuantificación de
DNA
mitocondrial
37. CONCLUSIONES: por qué en Tecnalia empleamos NGS
Reducción de costes: Multiplexado de muestras o análisis de múltiples muestras /
ensayo, menor coste/embrión
Tiempo de análisis corto: Compatible con transferencias en fresco
Detección de Mosaicismos: Cuantificación directa del número de lecturas/cromosomas
mayor rango dinámico: Mayor sensibilidad
Detección de Aneuploidías parciales de cromosomas: Mayor Resolución NGS permite la
detección de guanacias/pérdidas parciales de cromosomas: Aneuploidías Segmentales
NGS permite análisis combinados: PGS + monogénicas (mutaciones puntuales)
Detección y análisis de ADN mitocondrial (¿?)