Cuaderneta09

CURSO DE MICROBIOLOGÍA

GENERAL

Cátedra de Microbiología

Facultad de Química

2009 v3

CURSO DE MICROBIOLOGÍA – 2009. GUÍA DE PRÁCTICO

PRIMER CICLO
Durante el primer ciclo (4 clases) se realizará la identificación primaria de bacterias y hongos
a partir de cultivos puros y de muestras de ambiente.

OBJETIVOS:
Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de:
1) Manejarse de acuerdo a las normas de bioseguridad.
2) Manejar y mantener el microscopio correctamente.
3) Trabajar asépticamente.
4) Preparar frotis y teñirlos por Gram.
5) Reconocer morfologías microscópicas y coloración Gram de bacterias.
6) Reconocer morfologías microscópicas características de hongos uni y pluricelulares.
7) Identificar bacterias (género/familia).
8) Preparar medios de cultivo.
9) Manejar el autoclave.
10) Preparar material para esterilización por calor seco.
11) Uso de Tablas de identificación de bacterias.

Al final del ciclo cada subgrupo (4 estudiantes) deberá entregar un informe indicando:
Grupo (n° y horario), nombre de los estudiantes
Resultados obtenidos:
a) Muestra de ambiente: origen de la muestra, medio y condiciones de cultivo, descripción
macro y microscópica de las colonias obtenidas.
b) Cultivos bacterianos problema: código de la muestra, descripción macro y microscópica de
las colonias en el medio selectivo aportado, pruebas bioquímicas realizadas y datos obtenidos
de cada una, género y/o Familia a la que pertenece el m.o. identificado.

Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 1 de 110

Clase Trabajo experimental Material a estudiar
- Observación macro y microscópica de cultivos puros
- Normas de bioseguridad.
de bacterias (medios sólidos y líquidos).
- Utilización de microscopio.
1 - Técnica aséptica. Frotis y tinción de Gram.
- Citología y morfología de bacterias
- Siembra de una muestra: superficie, piel, tierra, aire
- Siembra y aislamiento.
en TSA
a) Muestra sembrada en 1ª clase:
- Observación macroscópica de colonias. - Siembra y aislamiento: aislamiento por
- Observación microscópica: frotis, tinción de Gram. estrías, cultivo puro.
b) Identificación de bacterias. Cada subgrupo recibirá - Medios generalidades; Tabla "Características
un m.o. (microorganismo) sembrado en un medio de algunos medios";
selectivo: - Composición de medios (manuales
- Observación macroscópica de colonias. comerciales): ALRF, Mac Conkey, MSA, TSA,
2 - Observación microscópica: frotis, tinción de Gram. TSB.
- Reaislamiento en medio no selectivo (ALRF y TSA). - Identificación de bacterias: pruebas
- Elección de pruebas bioquímicas. Con los datos bioquímicas primarias: oxidasa catalasa, OF,
obtenidos de las observaciones macro y microscópicas relación con el oxígeno (crecimiento en
y usando la tabla, cada subgrupo deberá elegir las anaerobiosis), fermentación de glucosa.
pruebas necesarias para la identificación primaria del
m.o.
a) Continuación de la muestra sembrada en 1ª clase.
- Observación macro y microscópica.
b) Identificación de bacterias:
- Identificación de bacterias.
- Verificación del reaislamiento por observación macro
- Siembra y aislamiento: preparación de medios
3 y microscópica.
de cultivo y esterilización de material de vidrio.
- Siembra de pruebas de identificación primaria.
- Citología y morfología de hongos.
c) Observación macro y microscópica de hongos en
cultivos puros.
d) Preparación de medios (mitad del grupo).
a) Muestra de ambiente: observación macro y
microscópica.
b) Cultivo bacteriano puro: lectura de pruebas
4 bioquímicas.
c) Observación de hongos, continuación.
d) Preparación de medios de cultivo, continuación.
e) Entrega de informe y discusión de los resultados.


SEGUNDO CICLO
Durante el segundo ciclo (7 clases) se hará el análisis microbiológico de una muestra para
determinar si cumple con los requisitos exigidos según una norma determinada.

OBJETIVOS:
Al finalizar el ciclo el estudiante deberá ser capaz de:
1) Realizar el análisis microbiológico de una muestra de acuerdo a una técnica dada.
2) Informar adecuadamente los resultados del análisis microbiológico de una muestra.
3) Calcular las diluciones adecuadas a sembrar para realizar un recuento (en placa, NMP).
4) Manejar tablas de identificación de bacterias.
5) Comprender las bases bioquímicas de las pruebas utilizadas en la identificación.
6) Comprender la función de cada uno de los componentes de un medio de cultivo.
7) Realizar un esquema simplificado de una técnica microbiológica.

En la clase 6 del ciclo cada subgrupo deberá entregar el informe final (solo los resultados
obtenidos) de la muestra analizada. En la clase 7 se deberá entregar 2 fotocopias del informe
del trabajo asignado en clase 5.


Clase Trabajo experimental Observaciones y material a estudiar
1 Análisis microbiológico de una muestra según técnica Técnica microbiológica para el análisis de una
aportada. Búsqueda de los 4 m.o. correspondientes y muestra
recuentos de mesófilos, enterobacterias y hongos Muestreo para análisis microbiológico.
Recuentos: Introducción gral. y recuento en
placa
2 Continuación con el análisis microbiológico. Aislamiento Discusión de medios de cultivo empleados:
selectivo. Subcultivo a caldos selectivos. composición y uso (manuales comerciales).
Resultado preliminar del recuento de mesófilos y Test de esterilidad.
enterobacterias.
3 Recuento definitivo de mesófilos. Observación de Informes de los resultados de recuento de
colonias típicas en medios selectivos. Aislamiento de mesófilos y enterobacterias
los caldos selectivos de Salmonella. Cálculo de diluciones a sembrar para recuentos
Reaislamiento en medio no selectivo según diferentes límites.
4 Gram de colonias típicas. Pruebas primarias (catalasa, Recuentos: recuento por NMP.
oxidasa). Uso de Tabla NMP.
E. coli: IMViC. Límites microbiológicos para agua potable y
Salmonella spp: Reaislamiento de colonias sospechosas agua de playa.
en medio no selectivo. Identificación de bacterias: pruebas
Pseudomonas aeruginosa: crecimiento a 42 ºC, bioquímicas.
pigmentos. Presentación y discusión de pruebas
S.aureus: catalasa, coagulasa o DNAsa bioquímicas.
Recuentos: Siembra de agua potable o de playa por
NMP.
Recuento de heterótrofos en agua potable por
filtración.
5 Leer recuento preliminar por NMP. Confirmación de Discutir Farmacopeas. Ordenanza, normas
coliformes totales y fecales. UNIT, etc.
Siembra pruebas de tamizaje para Salmonella : TSI, Se entregarán diferentes trabajos de análisis
LIA Fenilalanina microbiológico para presentar diseño de
metodología por escrito en forma de esuema
(diluciones, medios, etc).
6 Leer NMP. Leer bioquímicas de Salmonella. Leer Discutir resultados de NMP.
resultado de recuento de heterótrofos por filtración Discusión gral sobre el tema de identificación
y recuento de hongos. de una cepa bacteriana.
Entregar resultados.
7 Presentación del trabajo de análisis asignado en clase
5 por cada subgrupo.


TÉCNICA GENERAL DE ANÁLSIS MICROBIOLOGICO DE UNA MUESTRA
Especificaciones microbiológicas para la muestra
Recuento de mesófilos aerobios viables: menos de 1000 UFC/g
Recuento de hongos y levaduras: menos de 100 UFC/g
Recuento de Enterobacterias: menos de 100 UFC/g
Ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella sp
en 10 g.

Preparar la muestra que se va a analizar mediante un tratamiento apropiado a sus
características físicas y que no altere el número y tipo de microorganismos originalmente
presentes, a fin de obtener una solución o suspensión adecuada para los procedimientos
analíticos que se van a efectuar. Es recomendable partir de una muestra no menor de 10 g (o
mL) representativa del lote a analizar y preparar las diluciones en un solvente adecuado (suero
fisiológico, tampón fosfato o agua peptonada al 0,1%).

1 RECUENTOS
1 Preparación previa de la muestra
1.1 Pesar asépticamente 10 g de la muestra y disolver o suspender en 90 mL de suero
fisiológico. Esta es la dilución 1/10 o 10-1.
1.2 Pipetear 1mL de esta dilución en cada una de tres placas de Petri estériles. Continuar el
procedimiento en 2, 3 y 4.

2 Recuentos de mesófilos aerobios viables
2.1 Agregar inmediatamente a una placa 15 a 20 mL TSA (agar tripticasa soja), previamente
fundido y termostatizado a 45 ºC.
2.2 Mezclar por rotación y dejar solidificar a temperatura ambiente.
2.3 Incubar a 35 ± 2 ºC durante 48 a 72 h. Examinar para verificar la presencia de colonias.

3 Recuento de Enterobacterias
3.1 Agregar inmediatamente a otra placa aproximadamente 15 mL de VRBGA (violet red bile
glucose agar), previamente fundido y termostatizado a 45 ºC.
3.2 Mezclar por rotación y dejar solidificar a temperatura ambiente. Luego cubrir con una
sobrecapa del mismo agar de aproximadamente 5 mL. Dejar solidificar.
3.3 Incubar a 35 ± 2 ºC durante no más de 24 h. Examinar para verificar la presencia de
colonias típicas (colonias rojas, con diámetro mayor a 1 mm, habitualmente con halo de bilis
precipitada). Reaislar un número representativo de colonias típicas (no menos de cinco) a TSA.
Confirmar mediante tinción de Gram y el ensayo de oxidasa.

4 Recuento de hongos y levaduras
4.1 Agregar inmediatamente a la placa restante 15 a 20 mL de SDA (agar glucosado de
Sabouraud) con cloranfenicol, previamente fundido y termostatizado a 45 ºC.
4.2 Mezclar por rotación cada placa y dejar solidificar a temperatura ambiente.
4.3 Incubar a 25 ± 2 ºC durante 5 a 7 días. Examinar para verificar la presencia de colonias
típicas de hongos filamentosos y/o levaduriformes (realizar una coloración simple).


5 - BÚSQUEDAS.

5.1 - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli
5.1.1 Pesar asépticamente 10 g de la muestra y agregar a 90 mL de medio TSB. Si fuera
necesario homogeneizar mediante suave agitación.
5.1.2 Incubar 18 a 24 h a 35 ± 2 ºC.
5.1.3 Realizar el aislamiento a los siguientes medios sólidos en placa: MSA (agar manitol sal) o
agar Baird Parker para Staphylococcus aureus, agar cetrimida para Pseudomonas aeruginosa y
agar Mac Conkey o EMB-Levine (agar eosina azul de metileno-Levine) para Escherichia coli.
(Para la búsqueda de Salmonella continuar el procedimiento en 5.2).
5.1.4 Incubar las placas a 35 ± 2 ºC durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias
típicas.
5.1.5 Si no existen colonias típicas en los respectivos medios, la muestra cumple la exigencia de
ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli en 10 g de
muestra.
5.1.6 Si aparecen colonias típicas de Staphylococcus aureus en MSA o agar Baird Parker,
realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Luego tomar colonias de este medio y
hacer la coloración de Gram, el ensayo de catalasa y el ensayo de coagulasa.
5.1.7 Si aparecen colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimida, realizar un
reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar la coloración
de Gram, el ensayo de oxidasa y el crecimiento a 42 ± 0,5 ºC en TSB. Si fuese necesario
confirmar la producción de pigmento piocianina en agar King A (incubar no menos de 3 días a 35
± 2 °C o a temperatura ambiente).
5.1.8 Si aparecen colonias típicas de Escherichia coli en agar Mac Conkey o EMB-Levine,
realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar
una coloración de Gram, el test de catalasa, oxidasa y realizar el ensayo de IMViC (indol, rojo
de metilo-Voges Proskauer, citrato)

Descripción de colonias típicas de Staphylococcus aureus

Medio Descripción de colonias típicas
Agar manitol sal Colonias amarillas rodeadas de un halo amarillo
Agar Baird-Parker Colonias negras, brillantes rodeadas de un halo claro

Descripción de colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa


Colonias castaño claro con pigmento verde-azulado que
Agar cetrimida
fluoresce al UV y difunde al medio.


Descripción de colonias típicas de Escherichia coli

Colonias rojas habitualmente con halo de bilis
agar Mac Conkey
precipitada

Colonias negras habitualmente con brillo metálico
agar EMB (Levine)
verdoso bajo luz reflejada

Pruebas para Staphylococcus aureus
Coloración de Gram: cocos positivos en racimos
Fermentación de manitol: positiva
Catalasa: positiva
Coagulasa o DNAsa: positiva

Pruebas para Pseudomonas aeruginosa
Coloración de Gram: bacilos negativos
Oxidasa: positiva
Catalasa: positiva
Crecimiento a 42 ºC: positivo
King A: pigmento azulado

Pruebas para Escherichia coli
Coloración de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos
Oxidasa: negativa
Catalasa: positiva
OF glucosa: fermentativo
Indol: Positivo o negativo
Rojo metilo: positivo
Voges Proskauer: negativo
Citrato: negativo

5.2 - Salmonella spp.
5.2.1 Pipetear 0,1 mL del TSB previamente incubado durante 18 a 24 h a un tubo con 10 mL de
caldo Rappaport-Vassiliadis y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato.
5.2.2 Incubar ambos tubos a 35 ± 1 ºC (el caldo Rappaport-Vassiliadis puede incubarse a 41,5 ±
1 ºC) por no más de 24 h.
5.2.3 De ambos tubos realizar aislamiento a XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) y a por lo
menos uno de los siguientes medios sólidos en placa: VB (agar verde brillante) y SS (agar
Salmonella Shigella).
5.2.4 Incubar las placas a 35 ± 2 ºC durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias
típicas.
5.2.5 Si no existen colonias típicas, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Salmonella
spp. Si aparecen colonias típicas en alguno de los medios, realizar un reaislamiento de algunas
colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar luego la coloración de Gram, el ensayo


de oxidasa, catalasa, TSI, lisina de Möeller (o LIA) y ureasa (o fenilalanina). Realizar una
identificación mas completa con sistemas de identificación apropiados y confirmar con el uso
de antisueros polivalentes de Salmonella.

Descripción de colonias típicas de Salmonella spp*

Medio Descripción de colonias
Agar xilosa lisina desoxicolato Colonias rojas con o sin centro negro

Colonias blancas o rosadas, pequeñas, transparentes,
Agar verde brillante
con halo rojizo

Agar Salmonella Shigella Colonias incoloras o castañas con o sin centro negro

*algunas cepas de Salmonella fermentadoras de lactosa pueden dar colonias con
características diferentes a las descritas

Pruebas para Salmonella spp
Coloración de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos
Oxidasa: negativa
Catalasa: positiva
TSI: alcalino/ácido con o sin producción H2S, con o sin gas
Ureasa y fenilalanina: negativa
Lisina Möeller: positiva.
LIA: pico alcalino/fondo alcalino con o sin producción de H2S


ESQUEMA DE BUSQUEDA DE SALMONELLA

10 g PRE-
muestra ENRIQUECIMIENTO
+ TSB

35 ºC
24 h

0,1 mL 1 mL

Caldo Caldo ENRIQUECIMIENTO
Rappaport tetrationato SELECTIVO

41,5 ºC 35 ºC
24 h 24 h

Agar VB Agar XLD

35 ºC 35 ºC
24 h 24 h AISLAMIENTO
SELECTIVO

Colonias no típicas Colonias típicas

AUSENCIA de Reaislamiento de
Salmonella sp en varias colonias
10 g

IDENTIFICACION

Confirmación con
pruebas bioquímicas y
serológicas


RECUENTO DE HETEROTRÓFICOS POR EL MÉTODO DE MEMBRANA FILTRANTE

1 - Definiciones
1.1 Bacterias heterotróficas. Se considera a las bacterias aerobias y anaerobias facultativas,
mesófilas y psicrotróficas, capaces de crecer en un medio de agar nutritivo.
1.2 Filtro de membrana. Es un elemento de filtración, delgado, no fibroso, para líquidos y gases,
de acetato o nitrato de celulosa que tiene un tamaño de poro medio de 0,45 micras de
diámetro, en donde las partículas de mayor tamaño que el del poro son retenidas sobre la
superficie cuando se aplica succión o presión. No debe contener sustancias inhibitorios del
crecimiento bacteriano.

2 - Procedimiento
2.1 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar.
2.2 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiológico (SF) u otro diluyente
apropiado (dilución 1/10 o 10-1).
2.3 Pipetear 1 mL de la dilución resultante en un frasco con 10 a 50 mL de suero fisiológico, de
manera de mojar toda la superficie de la membrana.
2.4 Filtrar el total del volumen resultante (correspondiente a 0,1 mL de la muestra original) por
embudo de filtración equipado con filtro de membrana estéril bajo vacío parcial.
2.5 Enjuagar el embudo con tres porciones de 50 mL de suero fisiológico.
2.6 Colocar la membrana cuidadosamente sobre el medio sólido en placa de Petri (PCA o TSA),
evitando la formación de burbujas.
2.7 Incubar a 35 ± 2 ºC por 48 h.
2.8 Contar las colonias en los filtros de membrana. La densidad óptima de colonias por filtro es
entre 20 y 200.


RECUENTO DE COLIFORMES FECALES EN AGUA DE PLAYA POR NMP.

1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales

1.1 Colocar en una gradilla nueve tubos con medio caldo lauril triptosa (CLT) simple
concentración con campana de Durham, para hacer la serie (3-3-3).
1.3 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiológico (SF) u otro diluyente
apropiado (dilución 1/10 o 10-1).
1.4 Con una pipeta de 1 ó 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en cada uno de tres tubos con medio
de simple concentración (primera serie), 0,1 mL de la muestra (o 1 mL de la dilución 1/10) en
otros tres tubos (segunda serie) y 0,1 mL de la dilución 1/10 (equivalente a 0,01 mL de la
muestra) en otros tres tubos (tercer serie). Rotular adecuadamente los tubos con la dilución
sembrada
1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitación suave.
1.6 Incubar los tubos a 35 ± 0,5 ºC. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar.
1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al
crecimiento bacteriano y gas en la campana.
1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h.

2 - Ensayo de coliformes fecales

2.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo
con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC.
2.2 Incubar en baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC por 24 ± 2 h.
2.3 Considerar tubos positivos a los que presentan crecimiento y producción de gas a las 24 h.
2.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del número de tubos positivos del
medio EC.

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA POTABLE POR NMP.

1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales

1.1 Colocar en una gradilla tres tubos con medio CLT doble concentración, y seis tubos con
medio CLT simple concentración, para hacer la serie (3-3-3). Todos los tubos deben tener
campana de Durham.
1.3 Con una pipeta de 10 mL estéril sembrar 10 mL de la muestra en cada uno de los tres tubos
con medio de doble concentración.
1.4 Con una pipeta de 1 ó 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en tres tubos con medio de simple
concentración y 0,1 mL de la muestra en los otros tres tubos. Rotular adecuadamente los
tubos.
1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitación suave.
1.6 Incubar los tubos a 35 ± 0,5 ºC. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar.


1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al
crecimiento bacteriano y gas en la campana.
1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h.

2 - Ensayo confirmativo de coliformes totales

2.1 Someter a la prueba confirmativa todos los tubos que a las 24 ó 48 h presenten reacción
positiva presuntiva. Si esta reacción positiva aparece a las 24 h, es conveniente pasar a la
confirmación sin dejar transcurrir las 48 h.
2.2 Agitar suavemente los tubos.
2.3 Subcultivar por medio de un ansa de cada tubo con resultado positivo presuntivo a un tubo
con medio caldo lactosa bilis verde brillante (CLBVB) con campana de Durham. Rotular todos
los tubos adecuadamente.
2.4 Incubar los tubos de CLBVB por 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 ºC.
2.5 La producción de gas constituye un resultado positivo confirmado.
2.6 Calcular el valor de NMP de coliformes totales confirmados a partir del número de tubos
positivos del medio CLBVB.

3 - Ensayo de coliformes fecales

3.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo
con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC.
3.2 Incubar en baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC por 24 ± 2 h.
3.3 Considerar tubos positivos a los que presentan producción de gas a las 24 h.
3.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del número de tubos positivos del
medio EC.


COMPOSICIÓN DE MEDIOS A EMPLEAR

SUERO FISIOLÓGICO
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1L

TSA (agar tripticasa soja)
Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g
Digerido Papaínico de Harina de Soja 5,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1L

TSB (caldo tripticasa soja)
Digerido Papaínico de Harina de Soja 3,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g
Glucosa 2,5 g
Agua 1L

SDA (agar Sabouraud glucosado)
Glucosa 40 g
Digerido péptico de tejido animal 5g
Digerido pancreático de caseína 5g
Agar 15 g
Agua 1L

Agregar antes de esterilizar 50 mg de cloranfenicol por litro de medio
pH después de la esterilización: 5,6 ± 0,2.

ALRF (Agar Rojo Fenol Base + lactosa)
Digerido pancreático de caseína 10 g
Agar 15 g
Rojo Fenol 0,018 g
Lactosa 10 g
Agua 1L
pH final: 7,4 ± 0,2

VRBGA (violet red bile glucose agar)
Peptona 7,0 g
Extracto levadura 3,0 g
Sales biliares 1,5 g
Glucosa 10,0 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 2 mg
Agar 15,0 g
Agua 1L


AGAR BAIRD PARKER
Extracto de Carne Vacuna 5,0 g
Extracto de Levadura 1,0 g
Cloruro de Litio 5,0 g
Agar 20,0 g
Glicina 12,0 g
Piruvato de Sodio 10,0 g
Agua 1L

Esterilizar y dejar enfriar a una temperatura entre 45° y 50 °C. Agregar 10 mL de solución estéril de telurito de
potasio (1 en 100) y 50 mL de emulsión de yema de huevo. Mezclar

MSA (agar manitol sal)
Digerido Péptico de Tejido Animal 5,0 g
Extracto de Carne Vacuna 1,0 g
D-Manitol 10,0 g
Rojo de Fenol 25 mg
Agar 15,0 g
Agua 1L

AGAR CETRIMIDA
Digerido Pancreático de Gelatina 20,0 g
Cloruro de Magnesio 1,4 g
Sulfato de Potasio 10,0 g
Bromuro de Cetiltrimetilamonio (Cetrimida) 0,3 g
Glicerina 10 mL
Agar 13,6 g
Agua 1L

EMB LEVINE (agar eosina azul de metileno Levine)
Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 g
Lactosa 10,0 g
Eosina Y 400 mg
Azul de Metileno 65 mg
Agar 15,0 g
Agua 1L

AGAR MAC CONKEY
Lactosa 10,0 g
Rojo Neutro 30 mg
Mezcla de Sales Biliares 1,5 g
Cristal Violeta 1,0 mg
Agar 13,5 g
Agua 1L


CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS
Peptona de soja 4,5 g
Cloruro de magnesio hexahidratado 29,0 g
Fosfato dibásico de potasio 0,4 g
Fosfato monobásico de potasio 0,6 g
Verde de malaquita 0,036 g
Agua 1L

CALDO TETRATIONATO
Sales Biliares 1,0 g
Carbonato de Calcio 10,0 g
Tiosulfato de Sodio 30,0 g
Agua 1L

Calentar la solución de los sólidos a ebullición. En el día de su utilización, agregar una solución de 5 g de yoduro de
potasio y 6 g de yodo en 20 mL de agua. A continuación, agregar 10 mL de una solución de verde brillante (1 en 1000) y
mezclar. No se debe calentar el medio después de agregar la solución de verde brillante.

AGAR XLD (agar xilosa lisina desoxicolato)
L-Lisina 5,0 g
Xilosa 3,5 g
Lactosa 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Rojo de Fenol 80 mg
Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Tiosulfato de Sodio 6,8 g
Citrato Férrico Amónico 800 mg
Agar 13,5 g
Agua 1L
pH final: 7,6 ± 0,2

AGAR SALMONELLA SHIGELLA
Extracto de carne 5,0 g
Peptona 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Citrato de sodio 8,5 g
Tiosulfato de sodio 8,5 g
Citrato férrico 1,0 g
Verde brillante 0,33 mg
Rojo neutro 25 mg
Agar 13,5 g
Agua 1L


AGAR VERDE BRILLANTE
Digerido Pancre tico de Caseína 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Rojo de Fenol 80 mg
Agar 20 g
Verde Brillante 12,5 mg
Agua 1L

CLT (caldo lauril sulfato triptosa)
Triptosa 20,0 g
Lactosa 5,0 g
Fosfato dipotásico 2,75 g
Fosfato monopotásico 2,75 g
Lauril sulfato de sodio 0,1 g
Agua 1L

CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)
Peptona 10,0 g
Bilis vacuna 20,0 g
Lactosa 10,0 g
Verde brillante 13,3 mg
Agua 1L

Caldo EC
Triptosa 20,0 g
Lactosa 5,0 g
Fosfato dipotásico 4,0 g
Fosfato monopotásico 1,5 g
Agua 1L

PCA (agar para recuento en placa)
Triptona 5,0 g
Extracto de levadura 2,5 g
Glucosa 1,0 g
Agar 15,0 g


TERCER CICLO
Durante el tercer ciclo (2 clases) se hará el estudio de agentes físicos, químicos y biológicos
sobre los m.o.

OBJETIVOS:
Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de:
1) Diseñar un ensayo para evaluar la acción de un agente antimicrobiano
2) Comprender el uso de la escala de Mac Farland
3) Calcular el tiempo de reducción decimal de un agente antimicrobiano
4) Calcular la CIM de un antibiótico para una cepa dada

Clase Trabajo experimental Material a estudiar
Curva de muerte de E. coli a 63 °C. Cálculo de D. Recuentos: determinación de la masa celular,
Evaluación de desinfectantes. Ensayo de difusión de turbidimetría, escala de Mac Farland.
1 antibióticos y extractos. Control del crecimiento microbiano. Agentes
Calcular la CIM para un antibiótico y una cepa dadas físicos, químicos y biológicos
2 Lectura y discusión de resultados

ESTUDIO DE AGENTES

Se evaluará el calor como agente físico frente a una cepa de E. coli. Se realizará el cálculo del
tiempo de reducción decimal en suero fisiológico a 63 °C.
Se evaluará la acción del hipoclorito (250 ppm u otras) con y sin sustancias interferentes y del
etanol 70% sobre una cepa de Staphylococcus aureus, según la norma europea (modificada)
EN 1276:1997: “Antisépticos y desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de suspensión
para la evaluación de la actividad bactericida de los antisépticos y desinfectantes químicos
utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad. Método de
ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1)”. Según esta norma, un desinfectante debe ser capaz de
reducir por lo menos en 5 órdenes la carga microbiana inicial, luego de 5 minutos de contacto a
20 ºC. Para realizar el recuento después del contacto con el agente, es necesario eliminar todo
efecto inhibidor del agente, ya que su presencia puede falsear el resultado. Para ello se pueden
usar diferentes métodos: dilución, neutralización o filtración. Para el caso del hipoclorito se
usará tiosulfato de sodio al 10% como neutralizante, para el caso del etanol se utilizará
filtración por membrana para eliminar el agente.


1 Agentes Físicos: calor
1.1 Preparar una suspensión de Escherichia coli (ATCC 25922) en suero fisiológico, equivalente
al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado en TSA.
1.2 Homogeneizar bien la suspensión en vortex.
1.3 Sacar una alícuota y realizar las diluciones necesarias en suero fisiológico.
1.4 Realizar el recuento en superficie en placas de TSA secas sembrando tres diluciones
sucesivas. Extender con rastrillo estéril y dejar adsorber unos 15 min.
1.5 Incubar durante 24 h a 35 ± 2 ºC.
1.6 Colocar el resto de la suspensión en baño de agua a 63 °C. y comenzar a registrar el tiempo
transcurrido.
1.7 Extraer a distintos tiempos alícuotas de 1,5 mL a un tubo vacío estéril y enfriar
inmediatamente en baño de hielo.
1.8 Realizar el recuento de viables de las alícuotas extraídas a los distintos tiempos sembrando
las diluciones necesarias en superficie en placas de TSA. Extender con rastrillo estéril y dejar
adsorber unos 15 min.
1.9 Incubar durante 24 h a 35 ± 2 ºC.
2.0 Construir tabla de Nº de m.o. sobrevivientes en función del tiempo y la correspondiente
gráfica de log Nº de sobrevivientes en función del tiempo.
2.1 Calcular el valor D.

Nota: sabiendo que el tiempo D a 63 ºC en TSB para E. coli ATCC 25922 es de 0,7 minutos,
determinar los tiempos y las diluciones necesarias para construir la curva de muerte para el
mismo m.o. en suero fisiológico.

2 Evaluación de Desinfectantes
2.1 Hipoclorito de sodio
2.1.1 Preparar una suspensión de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiológico,
equivalente al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA.
2.1.2 Homogeneizar bien en vortex.
2.1.3 Tomar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico y agregar a 9,0 mL de agua
destilada estéril. Esta suspensión es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para
obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensión Ni
representa el valor a tiempo cero.
2.1.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solución de hipoclorito de sodio
250 ppm. Luego agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico.
2.1.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5
minutos. Esta suspensión es Nf.
2.1.6 Tomar luego 1 mL de esta suspensión y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solución de
neutralizante.
2.1.7 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensión en una placa
de Petri estéril.
2.1.8 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC.
2.1.8 Comparar el resultado del recuento obtenido para Ni y Nf (luego del contacto durante 5
minutos con el agente).


2.2 Hipoclorito de sodio con sustancias interferentes
2.2.1 Agregar 1,0 mL de sustancia interferente (p. ej. leche descremada diluida) a un tubo con
8,0 mL de solución de hipoclorito de sodio 250 ppm (u otra concentración elegida).
Homogeneizar bien.
2.2.2 Agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus preparada en 2.1.2 en suero fisiológico.
Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5
minutos.
2.2.3 Tomar luego 1 mL de esta suspensión y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solución de
neutralizante.
2.2.4 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensión en una placa
de Petri estéril.
2.2.5 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC.
2.2.6 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.1.3) y Nf, luego
de 5 minutos con el agente y la sustancia interferente.

ESQUEMA PARA Susp Mac Farland N°4

HIPOCLORITO DE 1 mL 1 mL
SODIO

Ensayo Ni t=0
8 mL desinf + 1 mL
9 mL de agua
agua (o sust.
destilada
interf.)

5 min. 1 mL

Nf t=5 min 1 mL
Diluciones
en SF

9 mL neutralizante

1 mL

Recuento en Recuento en
placa TSA placa TSA

Calcular el efecto de reducción decimal o efecto germicida EG: Log Ni – Log Nf
donde Ni es el resultado del recuento obtenido para el Ni a tiempo cero (1/10 del valor de la
suspensión McFarland Nº4) y Nf es el resultado del recuento obtenido en la suspensión luego
del contacto con el agente (calcular el recuento en contacto con el agente corrigiendo según las
diluciones sembradas).


2.3 Etanol
2.3.1 Preparar una suspensión de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiológico,
equivalente al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA.
2.3.2 Homogeneizar bien en vortex.
2.3.3 Tomar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico y agregar a 9,0 mL de agua
destilada estéril. Esta suspensión es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para
obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensión Ni
representa el valor a tiempo cero.
2.3.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solución de etanol al 70% (u
otra concentración). Luego agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico.
2.3.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5
minutos. Esta suspensión es Nf.
2.3.6 Tomar inmediatamente 1 mL de esta suspensión y agregar a 50 mL de suero fisiológico
2.3.7 Homogeneizar y filtrar 5 mL mediante embudo con membrana aplicando vacío.
2.3.8 Enjuagar la membrana con dos porciones de 50 mL de suero fisiológico
2.3.9 Colocar la membrana sobre placa de TSA.
2.3.10 Incubar a 35 ± 2 ºC por 48 h.
2.3.11 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.3.3) y Nf, luego
de 5 minutos en contacto con el agente.

ESQUEMA Susp Mac Farland N°4
PARA ETANOL
1 mL 1 mL

Ensayo Ni t=0
9 mL etanol
9 mL de agua
destilada

Nf t=5 min 5 min. 1 mL

1 mL
Diluciones
en SF
50 mL SF

FILTRAR Y
5 mL
ENJUAGAR

Recuento en Recuento en
placa TSA placa TSA

Calcular el efecto de reducción decimal o efecto germicida EG: Log Ni – Log Nf


Controles
A) Efecto bactericida del neutralizante
Tomar 1 mL de la suspensión Ni (preparada en 2.1.3) de S. aureus y agregar a 9,0 mL de
solución neutralizante. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Realizar el recuento de esta
suspensión en TSA incorporado (realizar las diluciones adecuadas en SF). Verificar que la
solución neutralizante no ejerce efecto bactericida sobre la cepa ensayada.

B) Validación de la neutralización
Tomar 1 mL de agente desinfectante y agregar a 9 mL de solución neutralizante, mezclar bien.
Tomar luego 0,1 mL de una dilución de la suspensión S. aureus (preparada en 2.1.1) de
concentración conocida (que contenga alrededor de 1000 células en el volumen a agregar) a
esta solución. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Sembrar 1 mL de esta suspensión en
una placa de Petri estéril y agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC. Comparar
el resultado obtenido con el recuento de la suspensión conocida de S. aureus de alrededor de
1000 células.
Verificar que el neutralizante es efectivo para neutralizar el antiséptico a la concentración
ensayada.

3 Evaluación de agentes biológicos
3.1 Ensayos de difusión.
3.1.1 Prepara una suspensión del m.o. ajustada al 0.5 de la escala de Mc Farland.
3.1.2 Hisopar la superficie de dos placas de agar Mueller Hinton.
3.1.3 Colocar cuidadosamente sobre la superficie de una placa -a una distancia de 1,5 mm entre
sí y del borde de la placa- discos de antibióticos de concentración conocida.
3.1.4 Colocar sobre la superficie de la otra placa 4 cilindros de metal. Cargar los cilindros con
100 μL de las soluciones de antibióticos y extractos.
3.1.4 Incubar a 35 °C durante 18 a 20 h.
3.1.5 Leer los halos de inhibición.

3.2 Ensayo de dilución en medio líquido. Determinación de la concentración inhibitoria mínima.
3.2.1 Preparar una suspensión del m.o. en un tubo conteniendo 4.5 mL de caldo Mueller Hinton,
a partir de un cultivo de 18 h y ajustar la turbidez a 0,5 de Mac Farland.
3.2.2 Realizar dos diluciones seriadas de 1: 10 en caldo Mueller Hinton (para alcanzar una
concentración de 1 x 106 ufc/mL) (Inóculo).
3.2.3 Transferir 1 mL de la suspensión bacteriana de 1x106 ufc/mL a cada uno de los tubos
conteniendo 1mL de dilución del antibiótico y al tubo control. Rotular los tubos con la
concentración final de antibiótico.
3.2.4 Incubar los tubos inoculados conteniendo las diferentes concentraciones de antibiótico y
el tubo control de crecimiento a 35 ºC, durante 16-20 h.
3.2.5 Determinar la C.I.M.


NORMAS BÁSICAS DE SEGURIDAD EN UN LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA

1. Esta prohibido, comer, beber, fumar, tomar mate, almacenar alimentos, aplicarse cosméticos y

cambiarse lentes de contacto en el área de trabajo. Los lentes de contacto solo se deben utilizar

cuando no se puedan usar otro tipo de lentes.

2. Está prohibido pipetear con la boca.

3. Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se sospeche

contacto con material contaminado.

4. Se debe trabajar de manera tal de minimizar la creación de aerosoles.

5. Se debe usar túnica y esta debe estar abrochada.

6. El pelo largo se debe usar atado.

7. Cuando sea necesario se debe usar lentes de seguridad para proteger la cara de salpicaduras,

sustancias corrosivas, luz UV y otras radiaciones.

8. El laboratorio se debe mantener ordenado y limpio. Se debe minimizar el material que no sea

pertinente al trabajo en las mesadas.

9. Todo material contaminado se debe descontaminar antes de desechar.

10. Las superficies de trabajo se deben limpiar y descontaminar con desinfectantes adecuados al

final del trabajo y en caso de haberse volcado material contaminado.

11. Todos los accidentes o vuelcos de material deben ser comunicados al docente encargado de

grupo.


UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO

1. Colocar una preparación.
2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo.
3. Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de su
trayectoria.
4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x.
5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable.
6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el
microscopio lo permite.
7. Enfocar la preparación.
8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal.
9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos.
10. Ajustar el enfoque.
11. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador.
12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlo
más. No tocar más la altura del condensador.
13. Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador.
14. Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar el
diafragma a 2/3 abierto (2/3 del campo iluminado).
15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificar
la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del condensador.
Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del
condensador a la apertura del objetivo.

MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO DIARIO (cada vez que se usa)

Limpiar el aceite de inmersión de lentes y otras superficies del microscopio con papel tissue. El
aceite de inmersión debe conservarse cerrado.
Apagar la fuente de luz del microscopio
Cubrir el microscopio con su funda.


CITOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE BACTERIAS

Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos microscópicos (incluyendo
levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos (m.o.). El término microorganismo no
tiene un significado taxonómico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones
microscópicas (< 0,1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre sí. Por ejemplo incluye
organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. También
difieren notablemente en el tamaño aunque sean todos microscópicos. En una escala comparativa
tenemos:
Protozoarios > levaduras > bacterias > virus

Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan
una de las tres formas generales siguientes:
• elipsoidal o esférica
• cilíndrica o en forma de bastón
• espiral o helicoidal

Las bacterias esféricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta forma
presentan modelos de agrupación que derivan de los diversos planos de división celular. Así
tenemos:
cocos en pares (diplococos), ej. Neisseria
cocos en cadena, ej. Streptococcus
cocos en racimo, ej. Staphylococcus
cocos en tétradas, ej. Pediococcus
cocos en cubos, ej. Sarcina
cocos sin distribución especial

Las células bacterianas cilíndricas se denominan BACILOS o BASTONES (rod en inglés) y
presentan otros modelos de agrupación. Así tenemos:
• bastones en cadena, ej. Bacillus
• bastones en letras chinas o empalizadas, ej. Corynebacterium
• bastones sin distribución especial

Las bacterias helicoidales se presentan en general como células individuales independientes; pero
las células de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, número y amplitud
de las espiras y rigidez de la pared.

OBSERVACIÓN Y EXAMEN MICROSCÓPICO

La observación y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales:
• observando los microorganismos vivos sin teñir
• observando las células fijadas, teñidas con colorantes

Las bacterias vivas en suspensión acuosa tienen propiedades ópticas similares a las del agua y,
por lo tanto, son difíciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de
contraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta cuando se las tiñen con un colorante
adecuado. Sin embargo, para muchos fines es preferible evitar la coloración debido a que puede
alterar la forma y además mata a las células.
Si se quiere observar los m.o. vivos es conveniente usar un microscopio de campo de contraste de
fases o en su defecto un microscopio de campo claro con iluminación mínima. Ésta se logra
bajando el condensador, minimizando la iluminación.


El movimiento de traslación de algunas bacterias puede observarse en preparaciones húmedas del
material, es decir con los m.o. vivos. Debe distinguirse claramente el movimiento independiente de
las bacterias móviles del movimiento por arrastre por corrientes de convección y el movimiento
browniano. Cuando el movimiento se realice por propulsión flagelar, el tipo de movimiento variará
con la disposición de los flagelos en el cuerpo celular.

La coloración de las bacterias tiene como fines:
• poder visualizarlas para determinar morfología y tamaño.
• diferenciar grupos bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes.
• revelar la presencia de distintas estructuras internas.

Los colorantes utilizados son sales en las que el anión o el catión es el responsable del color; en el
primer caso se trata de un colorante ácido o aniónico y en el segundo, básico o catiónico. Cuando
el medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad la célula bacteriana tiene una débil carga
negativa. Como la diferencia de carga eléctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante y
la célula, las bacterias tendrán afinidad por los colorantes básicos (ej.: cristal violeta y azul de
metileno).

Cuando se utiliza un solo colorante básico, el método se denomina coloración simple, mientras que
cuando se usan dos o más se llama coloración compuesta. La coloración diferencial es un caso
particular de coloración compuesta.
Cuando a una preparación bacteriana se le aplica un colorante ácido tal como eosina, éste no se
une a las células cargadas negativamente, pero si se deposita alrededor de ellas, quedando así un
fondo coloreado donde contrastan las células incoloras. No es, por lo tanto, una verdadera tinción y
se denomina tinción negativa o indirecta.
En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, es decir, alguna sustancia que contribuya
a la fijación del colorante a la célula, por ejemplo: ácido tánico, sales de Al, Fe, etc.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS
Comprende las siguientes etapas:
1) extendido del material en un portaobjetos
2) secado
3) fijación
El propósito de la fijación es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y
adherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría la capa de células
durante el proceso de tinción.
El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin que
aparezcan estructuras que no existían en la célula original. El calor es en general el método de
fijación mas utilizado para la observación de la morfología de células bacterianas. Cuando además
de los microorganismos interesa la observación de células animales, se utiliza un método químico
como la fijación por metanol y por formol, que altera menos que el calor la morfología de las
células.

Coloración simple
Consiste en la aplicación de un colorante luego de fijada la preparación. Pueden emplearse los
siguientes colorantes básicos: azul de metileno, cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan
diferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de aplicación serán distintos.

Coloración de Gram
Los m.o. difieren física y químicamente entre sí y por eso reaccionan de una manera diferente
frente a un determinado proceso de tinción. Esto constituye el fundamento de las tinciones
diferenciales. La tinción de Gram, la más empleada en bacteriología, es una coloración diferencial.
Por este método se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram
negativos (Gram –), en función de su reacción frente a la coloración.


Las células previamente fijadas se tiñen con solución de cristal violeta, se lavan y se tratan con
lugol. El yodo del lugol forma un complejo con el cristal violeta que sirve para fijar éste a la célula.
Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o mezclas de ambos) en el cual el
complejo yodo-cristal violeta es soluble.
Algunos microorganismos son decolorados (los Gram –) mientras que otros no (los Gram +). Luego
de la decoloración se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que hace visibles
las bacterias Gram – que habían sido decoloradas. Las bacterias Gram + se ven de color azul-
violeta y las Gram – se ven rosadas.
Las bacterias Gram + poseen paredes gruesas de peptidoglicano, que cuando se deshidratan por
el alcohol provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo yodo-cristal
violeta se escape. En las bacterias Gram –, la fina capa de peptidoglicano no evita el pasaje del
solvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la célula.

Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composición química totalmente
diferente, generalmente se tiñen como Gram +. En este caso no son los constituyentes químicos,
sino la estructura física de la pared lo que le confiere su coloración como Gram +.

Coloración de ácido resistentes
La tinción de ácido-resistentes es una tinción diferencial que demuestra la resistencia de la célula a
ser decolorada por los álcalis, ácidos y alcohol. En algunos microorganismos de los géneros
Mycobacterium y Actinomyces la propiedad ácido resistente está relacionada con su alto contenido
en lípidos.

Coloración de estructuras

Esporas
Ciertas especies bacterianas, en particular de los géneros Bacillus y Clostridium, producen
elementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman dentro de
la célula, a razón de una por célula. A diferencia de la célula vegetativa que la produce, la espora
es muy resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura, baja humedad, radiaciones
y agentes químicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos períodos como tal
y cuando desaparecen las condiciones adversas puede germinar. También puede inducirse esa
germinación mediante, por ejemplo, un shock térmico, es decir un calentamiento a 80ºC.
Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las técnicas de
coloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células coloreadas. Por lo
tanto, para teñir las esporas específicamente, deben usarse métodos de coloración especiales. Los
datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloración son:

• presencia o ausencia de esporas
• deformación o no del cuerpo celular
• posición dentro del cuerpo celular

En base a la posición de la espora dentro de la célula se las clasifica en: terminales, centrales y
subterminales (posición intermedia).

Flagelos
Muchas bacterias son móviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debe
generalmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apéndices largos,
delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la célula por otro. Son tan delgados
que solo se pueden ver al microscopio común luego de una coloración especial que hace uso de
un mordiente. Este promueve la fijación de las moléculas de colorante al flagelo dando lugar a la
formación de un precipitado a lo largo del flagelo, haciéndolo visible.
La célula bacteriana puede tener uno o más flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso
se clasifican en: polar (flagelo en un extremo del cuerpo celular), anfitrica (flagelos en ambos


extremos), lofotrica (penacho de flagelos en un extremo) y peritrica (flagelos alrededor de toda la
célula sin distribución).

Cápsula
Ciertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por polisacáridos,
polipéptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone de una manera
compacta alrededor de la superficie celular se denomina cápsula. La mejor forma de observarla es
con tinción negativa, aunque existen técnicas especiales, para la coloración específica de la
cápsula.


TÉCNICAS

MANIPULACIÓN ASÉPTICA DE CULTIVOS

• Tomar el tubo de cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del tubo toque la
palma de la mano y probar (con la mano derecha) que el tapón esté libre, girándolo sin
destapar.
• Tomar el ansa con la mano derecha, con los dedos pulgar, índice y mayor, dejando libres
el anular y el meñique. Quemar el ansa introduciendo la punta en el cono frío de la llama
del mechero, en posición vertical y luego ir levantándola hasta que quede toda al rojo.
• Pasar el ansa por la llama en un ángulo de 60º con la vertical, manteniéndola siempre en
posición paralela al cuerpo.
• Flamear el metal adyacente al ansa.
• Trabajando cerca del mechero, tomar el tapón de algodón del tubo con los dedos anular y
meñique de la mano derecha y quitarlo girando el tubo; flamear la boca del tubo.
• Introducir el ansa tocando la pared fría dentro del tubo (sin soltar el tapón de algodón) para
que se enfríe el ansa y luego introducirla en el cultivo líquido o deslizarla sobre la superficie
del cultivo sólido de abajo hacia arriba, para tomar las células a transferir (inóculo).
• Sacar el ansa así cargada del tubo, flamear la boca del tubo y taparlo. Transferir el inóculo,
ya sea a un portaobjetos para hacer un frotis o a otro medio de cultivo. Quemar
nuevamente el ansa.

Siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con cualquier finalidad debe procederse
según técnica aséptica descrita, con el fin de no introducir contaminación en el cultivo o en la
muestra.

OBSERVACIÓN DE UN PREPARADO FRESCO (para observar movilidad, forma, etc)
Método de la gota pendiente
Colocar una gota de muestra usando técnica aséptica en el centro de un cubreobjetos limpio.
Invertirlo cuidadosamente y colocarlo sobre la depresión de una lámina excavada, de manera que
no deslice la gota por el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresión.
Aplicar unas gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo en su lugar. Observar
con el lente seco de mayor aumento.

Método de lámina-laminilla
Colocar una gota de la muestra usando técnica aséptica sobre un portaobjetos limpio y cubrir con
un cubreobjetos. Para prevenir las corrientes de convección y el secado de la preparación, se
puede sellar poniendo en los bordes del cubreobjetos vaselina sólida o esmalte de uñas. Observar
igual que el anterior. En caso de disponer de microscopio de contraste de fases la visión es mucho
mejor.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS
1) Colocar con un ansa una gota de muestra -si es líquida- sobre un portaobjetos limpio. Si la
muestra proviene de un cultivo en medio sólido, colocar primero una gota de agua sobre el porta,
tomar la muestra con el ansa, tocar la gota, quemar el ansa y luego de enfriada, mezclar bien con
el agua para lograr una suspensión homogénea.


2) Secar al aire. Puede acelerarse el secado, manteniendo la lámina encima de la llama del
mechero a 15 cm o más de distancia.
3) Fijar. Con el frotis seco, pasar el porta tres veces por la llama del mechero para fijar.

Coloración simple
Preparar un frotis según la técnica habitual antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para
tinciones. Cubrir la preparación con 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno o de cristal violeta
y dejar 1 minuto. Lavar con agua. Secar encima de la llama del mechero. Observar al microscopio
con lente de inmersión (100x) y determinar forma, disposición y relación de tamaños de las
distintas bacterias.

Coloración de Gram (Técnica de Hucker)
Preparar un frotis según la técnica antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones.
Cubrir con solución de cristal violeta y dejar actuar 1 min. Lavar suavemente con agua de la canilla.
Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min. Lavar de la misma manera. Cubrir con etanol 95% y dejar 30
seg. moviendo suavemente la lámina. Seguir lavando con etanol hasta que este no arrastre más
colorante. Lavar con agua. Cubrir con solución de safranina y dejar 15 seg. Lavar y secar.
Observar por inmersión. Las bacterias Gram + se verán de color azul-violeta y las Gram - rosadas.

Coloración de esporas
Preparar un frotis pasando 10 veces por la llama para fijar. Colocar la lámina sobre una plancha
para tinciones. Cubrir con pequeños trozos de papel de filtro, impregnar éstos con solución de
verde de malaquita y calentar durante 5 min. con el mechero. Mantener el papel siempre saturado
con verde de malaquita mediante agregado de solución. Lavar suave pero abundantemente con
agua. Dar contraste con solución de safranina durante 30 s. Lavar con agua y secar. Observar por
inmersión.

Se verán las esporas verdes y los cuerpos celulares rosados. Si se dispone de un microscopio con
contraste de fases, se puede observar la endospora sin teñir como una estructura densa, blanca
dentro de la célula.

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
La microscopía de fluorescencia se basa en los mismos principios de óptica que la microscopía
común, con diferencias en el manejo y el diseño relacionadas con la generación y transmisión de
longitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar, ya sean propios de la
muestra o de la coloración utilizada.
Los procesos de excitación generalmente requieren longitudes de onda cortas, en el UV cercano
(lámpara de halógeno-cuarzo, arcos de mercurio, etc.). Las lentes deben ser de algún material
(generalmente fluorita) que transmita esas longitudes de onda y el aceite de inmersión de ser no
fluorescente.
Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales tales como algunas vitaminas,
esteroides, porfirinas, etc. Un ejemplo de estudio de bacterias por visualización directa de
fluorocromos naturales es la observación de bacterias metanogénicas con luz UV. Estas fluorescen
con luz UV en preparaciones sin coloración debido al la presencia de coenzimas fluorescentes F
420 y F 350, relacionadas con el metabolismo del C y la metanogénesis.
Otros compuestos que fluorescen (rodamina, auramina, fluoresceína, colorantes de acridina) se
utilizan en distintas técnicas de tinción; por ejemplo la tinción de microorganismos ácido-resistentes
con auramina-rodamina en muestras de tejido y esputo.
También se utilizan las técnicas de inmunofluorescencia que consiste en la aplicación a la muestra,
de una solución de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente; si la muestra tiene el
antígeno que se busca, este reaccionará y así se localizará. Tal es el caso, por ejemplo, de la
detección de Salmonella con anticuerpos marcados con fluoresceína.


CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOS

INTRODUCCIÓN
Los hongos constituyen un grupo muy heterogéneo de organismos eucariotas, heterótrofos no
fotosintéticos y con pared celular. Basándose en la apariencia macroscópica de la colonia se
pueden diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas se
denominan levaduras; si producen crecimientos aéreos, velludos, algodonosos o pulverulentos se
llaman hongos filamentosos o mohos.
Existe un tercer grupo que se desarrolla como levaduras cuando crece a 37ºC y como hongo
filamentoso a 25ºC. Este fenómeno se denomina dimorfismo.
El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo. El talo puede ser unicelular
(en levaduras). En hongos filamentosos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio, compuesto
por hifas y una parte reproductora.
Las hifas son tubos que contienen núcleos y citoplasma. Pueden presentar septos (micelio
tabicado) (fig.1) o no (micelio no tabicado) (fig.2).
Los septos presentan poros que conectan los distintos segmentos de la hifa. A veces las levaduras
constituyen cadenas de células denominadas pseudomicelio (fig.3).
Pueden existir elementos de resistencia como los esclerotes que son masas endurecidas de
micelio presentes en algunos géneros de Ascomycetes y Basidiomycetes.
Los hongos se pueden reproducir asexuada y sexualmente. En algunas especies coexisten las dos
formas de reproducción en el mismo organismo que se denomina entonces holomorfo. El
holomorfo tiene a la vez una forma de multiplicación asexuada, el anamorfo o estado imperfecto y
una sexuada, el teleomorfo o estado perfecto.
La reproducción asexuada puede ocurrir por propagación vegetativa a partir de fragmentos de
micelio, o por formación de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.).
La reproducción sexuada se caracteriza por la unión de dos núcleos que dan lugar a esporas
sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.).
Los hongos pueden ser homotálicos si poseen en el mismo micelio núcleos complementarios que
pueden conjugarse o heterotálicos cuando requieren núcleos provenientes de micelios diferentes.
En general la reproducción asexuada es más importante para la propagación de la especie. En
muchos hongos la reproducción sexuada se da solo una vez al año. Hay un grupo de hongos a los
que no se les conoce reproducción sexuada. Existe otro grupo que no forma esporas de ningún
tipo y solo se reproduce por fragmentación del micelio.

ZYGOMYCETES
Estructura
Hongos filamentosos con micelio no tabicado, cenocítico. Pueden presentar órganos de fijación:
rizoides, típicos de Rhizopus.

Reproducción
ASEXUADA:
Clamidosporas: células vegetativas que se rodean de una pared gruesa constituyendo a la vez
elementos de resistencia (fig.4) y que luego dan origen al micelio.
Esporangiosporas: esporas producidas endógenamente dentro de un esporangio. A veces, como
en Mucor sp., el esporangio puede presentar una columela (fig. 5). La columela es una vesícula o
parte central del esporangio que es continua con el esporangióforo (hifa que genera el esporangio).

SEXUADA:
Zigotes o zygosporas: cuerpos marrones o negros, con paredes gruesas que frecuentemente está
cubierto por espinas, que son formados por la fusión de dos gametangios (fig. 6).


Ej.: zigote heterotálico: Absidia coerula, zigote homotálico: Mucor baciliformis

ASCOMYCETES

Estructura
Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras.

Reproducción
ASEXUADA:
Gemación (o fisión ) en levaduras (fig.7). Conidios formados en conidióforo

SEXUADA:
Ascosporas contenidas en un asco que se forma frecuentemente por kariogamia de 2 núcleos
distintos. Generalmente se forman 8 aunque pueden formarse 2 o 4. Los ascos pueden estar
incluídos o no dentro de un ascocarpo.

GRUPO FORMAS DE REPRODUCCION

Asexuada Sexuada Fig Ejemplo

Hemiascomycetes gemación Ascos sin ascocarpo 8 Saccharomyces
Euascomycetes conidios Ascos cleistotecio 9 Emericella
en peritecio 10 Sordaria
ascocarpo apotecio 11 Pyronema

BASIDIOMYCETES

Estructura
Hongos filamentosos con micelio tabicado y algunas levaduras.

Reproducción
ASEXUADA: crecimiento vegetativo, rara vez forman esporas.
SEXUADA: basidiosporas formadas sobre basidios.

DEUTEROMYCETES O FUNGI IMPERFECTI

Estructura
Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras.
Se agrupan aquí los hongos a los que no se les conoce forma de reproducción sexuada. Se
presume que éstos son estados no sexuados o anamorfos de Ascomycetes (o más
raramente Basidiomycetes) cuyos estados sexuados o teleomorfos no han sido descubiertos.
Si se observa el estado sexuado de una especie de Deuteromycetes, ambos estados se transfieren
al grupo al que pertenece el teleomorfo.

Reproducción
Conidios formados en células especializadas, las células conidiógenas que pueden encontrarse en
una hifa especializada: el conidióforo.


La clasificación dentro de este grupo se basa en la observación del aparato conidiógeno. La forma
en que se produzca la conidiogénesis dará lugar a la formación de conidios solitarios, en racimos o
en cadenas.
En algunos géneros las células conidiógenas no se diferencian del resto de la hifa, ej.:
Aureobasidium (fig.12).
En otros, las células conidiógenas se alargan denominándose fiálides, ej.: Penicillium (fig.13), se
ramifican, ej. Botrytis (fig.14), o el extremo se dilata, ej.: Aspergillus (fig.15).
Algunos géneros forman artrosporas por fragmentación de la hifa, ej.: Geotrichum (fig.16) y otros
clamidosporas.
Pueden ser unicelulares o contener dos o más células: macroconidias, ej. Alternaria (fig.17) o
Fusarium (fig. 18).
Las células conidiógenas pueden estar contenidas dentro de pycnidios, ej.: Phoma, (fig.19). Los
pycnidios son cuerpos de fructificación globosos, con forma de matraz y poseen una apertura
apical llamada ostiolo

PARTE PRÁCTICA

En la identificación de hongos filamentosos juega un rol muy importante las características
morfológicas macro y microscópicas.

Observación microscópica
El micelio se debe describir según:
• su situación: aéreo (razante a la superficie o elevado) o profundo
• su morfología: velludo, glabro, rugoso, etc.
• su coloración
• produzca o no pigmentos que difundan al medio

Se debe tratar de observar las estructuras lo más intacta posible.
Puede observarse directamente la placa de Petri con bajo aumento. Las preparaciones se hacen
entre lámina y laminilla. Se coloca en un portaobjeto una gota de solución aclarante de KOH al 10
% o de una solución colorante de azul de metileno. Se corta, con el ansa, una pequeña porción del
material a estudiar. Para disminuir el daño, se puede utilizar un trocito de cinta adhesiva que se
presiona suavemente sobre el cultivo. Se coloca el material o el trozo de cinta en la gota, se cubre
con un cubreobjeto y se presiona suavemente. Se observa con bajo aumento.

BIBLIOGRAFIA
Samson, R.A and col.; "Introduction to Food-Borne Fungi",, 1995.
Stanier and col.; The Microbial World, 5ta ed., Prentice-Hall, 1986, p.536-544.
Lennette and col.; Manual of Clinical Microbiology, 4ta Ed., American Society for Microbiology, 1985,
cap.46.
Pelczar and Reid; Microbiology, McGraw-Hill Book Cy., 1972, caps.14 y 15.
Guiraud, J. and Galzy, P.; L'analyze microbiologique dans les industries alimentaires, Editions de
L'usine, 1981, cap.2.
Alexopoulos,C.J. and Mims, W.; Introducción a la Micología, Ed. Universitaria de Buenos Aires,
1977.
Moore-Landecker, E.; Fundamentals of The Fungi, 2nd ed., Prentice-Hall, 1982.
Pitt, J. & Hocking, A., Fungi and food spoilage, Academic Press, London, 1985

FIGURAS DE HONGOS


Fig. 1
Fig. 2 Fig. 3
Micelio no tabicado
Micelio tabicado Pseudomicelio

Fig. 4
Clamidosporas Fig. 6
Zygote

Fig. 5

Fig. 8
Fig. 7 Ascos desnudos
Gemación
Fig. 9
Cleistotecio

Fig. 11
Fig. 10 Apotecio
Peritecio


Fig. 12
Aureobasidium

Fig. 13
Penicillium

Fig. 14 Fig. 15 Fig. 16
Botrytis Aspergillus Geotrichum

Fig. 18
Fusarium

Fig. 19
Phoma
Fig. 17
Alternaria


SIEMBRA Y AISLAMIENTO - BÚSQUEDA

SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado el medio de cultivo debe
incubarse a una temperatura adecuada para el crecimiento de los m.o. La siembra puede
realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril.

Cultivo en medio líquido
Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por aparición
de turbidez, formación de velo o película o sedimento.

Cultivo en medio sólido
Puede ser en tubos con medio sólido o placas.

Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre la
superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando
de no dañar el agar.
Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. También se llama
siembra por picadura.
Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada.

En superficie
• Se colocan 0,1 mL de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro de la placa, y
se distribuye con un rastrillo estéril.
• Se siembra con un ansa para aislar, como se explica más adelante.
• Se siembra con un hisopo.

Incorporada
• Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la misma. Sobre
ella se agregan 20 mL de medio de cultivo sólido fundido y termostatizado a 45ºC; luego
se mueve suavemente la placa para que la muestra se mezcle con el agar y se deja
solidificar.

En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se
puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar.
Cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, puede ser
necesario diluir la muestra con un diluyente estéril como suero fisiológico.

AISLAMIENTO
Aislar es separar un microorganismo a partir de una población que los contiene de varios tipos. En
ecosistemas naturales raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro o axénico (un
solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento
para separar los distintos tipos de microorganismos presentes para luego así poder identificarlos.
El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los
microorganismos están en una proporción adecuada.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
a) aislamiento por estrías.
b) aislamiento por dilución


Aislamiento en placa por estrías
Existen distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas.
Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la
cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfría, se
gira la placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada
inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por último, sin quemar el
ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

Aislamiento por dilución en medio sólido
Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser
necesario diluir la muestra usando suero fisiológico o algún otro diluyente.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
Para aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por exposición al
oxígeno, las placas pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en
recipientes cerrados en atmósfera sin oxígeno. También se puede sembrar diluciones en tubos con
agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina para evitar el
acceso de aire. Con anaerobios más sensibles al oxígeno, se trabaja en cámaras anaeróbicas, o
también usando la técnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las
paredes al hacerlo girar mientras se enfría; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas
libre de oxígeno mientras el tubo está destapado.

BÚSQUEDA
Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en
una muestra, se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda, que involucra una primera etapa
de aumento del número del tipo de microorganismo que se desea aislar. Luego se aísla por el
método de estrías o por dilución y se identifica.

Una búsqueda generalmente implica los siguientes pasos:

1) enriquecimiento
2) aislamiento selectivo (medios selectivos y/o diferenciales)
3) reaislamiento (medio no selectivo)
4) identificación

El objetivo de la etapa de enriquecimiento es aumentar el número del microorganismo que se
desea determinar y en algunas ocasiones puede subdividirse en dos: preenriquecimiento y
enriquecimiento selectivo. El preenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse
solamente cuando los microorganismos buscados están debilitados o dañados y se usan siempre
medios nutrientes líquidos no selectivos. El enriquecimiento selectivo se realiza incubando la
muestra en medios líquidos selectivos, ya sea en presencia de agentes químicos o biológicos que
suprimen el crecimiento de otros m.o. no deseados y permiten el desarrollo en particular del o de
los microorganismos buscados.
Luego de cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleando
la técnica de estrías en superficie en medios sólidos generalmente selectivos y diferenciales. En
estos medios deben examinarse las colonias típicas para el tipo de m.o. que estamos buscando.
Las colonias deben describirse por examen macroscópico en función del tamaño, la forma, el
borde, la elevación, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy útil en la identificación.

En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en un medio no
selectivo por el método de estrías. Esto se conoce como reaislamiento y es necesario para
asegurar la obtención de un CULTIVO PURO del microorganismo de interés, ya que en los medios


de aislamiento selectivos puede ocurrir que una colonia característica del m.o. que estamos
buscando pueda contener como contaminantes –en muy bajo número- otros microorganismos que
no hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero al subcultivarlos en condiciones
favorables puedan crecer. El examen microscópico de una colonia de un cultivo puro de un
microorganismo debe mostrar células razonablemente semejantes respecto al Gram y a la
morfología. El informe de una búsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIA
en los gramos o mL de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento
(enriquecimiento).

DESCRIPCIÓN DE COLONIAS DE BACTERIAS Y LEVADURAS

Las colonias de muchos m.o. se pueden describir teniendo en cuenta el tamaño, color, superficie,
etc. Esta descripción no incluye hongos filamentosos.

Tamaño:
Grande: diámetro mayor a 1 mm
Mediana: diámetro aproximadamente igual a 1 mm
Pequeña: diámetro menor a 1 mm

Color
Blanco, Crema, Amarillo limón, Negro, etc

Superficie
Brillante, Lisa, Granular, Rugosa

Consistencia
Viscosa, Mantecosa, Friable (se disgrega al tocarla)

Densidad (con luz a través de la colonia)
Opaca, Transparente, Traslúcida

FORMA

Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Lanceolada
ELEVACIÓN

Chata Elevada Convexa Cúpula Umbonada Umbilicada

MARGEN

Entero Ondulado Lobado Ondeado Filamentoso


MEDIOS DE CULTIVO

GENERALIDADES

Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos,
etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de
ellos frente a otros m.o. que los acompañen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de
cultivo y condiciones de incubación (atmósfera, temperatura, pH) considerando las características
fisiológicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema.
Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no
interfieran durante el aislamiento de los que sí interesan.

Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificación de m.o. es el siguiente:

Fuente de inóculo Caldo de enriquecimiento Aislamiento Identificación

Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo
de m.o. y simultáneamente minimizar la interferencia de otros:

Muestra
Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se está buscando debe ser factible de estar
presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante.
Debemos considerar si es útil someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor selección
se realice en este paso inicial, menos selectivos deberán ser los medios de cultivo a utilizar.
¿Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que
deseamos aislar está en un bajo número, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que
favorezca su multiplicación (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio
formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompañantes no deseados, se denomina
enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado está en alto número, no se necesita realizar un
enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio sólido adecuado directamente.

Medio de cultivo
Todo medio de cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento de una o varias
especies microbianas y dar condiciones tales como pH, presión osmótica, oxígeno disuelto, etc.
adecuados para el crecimiento.
Debemos utilizar una formulación de los medios de cultivo adecuados al tipo de m.o. a cultivar. En
general en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos (agregando un inhibidor de
la flora acompañante), o utilizando un medio de cultivo restrictivo al incluir un nutriente que sólo el
m.o. deseado sea capaz de utilizar o utilizando condiciones de incubación particulares.
Debemos utilizar las condiciones de incubación adecuadas: temperatura, luz, atmósfera (aerobia o
anaerobia, atmósfera con concentración de CO2, etc.).
Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son:

• Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podrían quitar todos los compuestos orgánicos
para permitir el crecimiento de m.o. autótrofos que son capaces de obtener su fuente de
carbono del CO2 (que difunde de la atmósfera al medio o por agregado de bicarbonato). O
incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar
degradadores de ese compuesto.


• Fuente de nitrógeno. Generalmente se agrega como sales de amonio o peptonas. Se
puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgánica u inorgánica) para permitir el
crecimiento de fijadores libres de nitrógeno, que son capaces de obtener su fuente de
nitrógeno del N2 atmosférico.

• Fuente de energía. Si no se agrega ningún compuesto capaz de ser utilizado como fuente
de energía y se incuba a la luz, sólo crecerán los m.o. fotosintéticos que usan la luz como
fuente de energía.

• Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento
(vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, etc.) según se necesiten o no.

Peptonas
Las peptonas son uno de los constituyentes principales de los medios de cultivo en microbiología.
Se preparan por hidrólisis de proteínas y por lo tanto están constituidas por mezcla de polipéptidos,
péptidos de diverso peso molecular y aminoácidos. Las peptonas de uso microbiológico son
mezcla de varios productos resultantes de la hidrólisis proteica: bases nitrogenadas, sales
inorgánicas y trazas de minerales y compuestos varios. Algunas fuentes comunes de peptonas
son: carne (fresca, deshidratada o congelada), pescado (fresco o deshidratado), caseína, gelatina,
proteína de soja, microorganismos (levaduras, algas), sangre, albúmina de huevo, etc. La hidrólisis
puede ser en medio ácido o alcalino o a presión superior a la atmosférica para lograr más altas
temperaturas. Las peptonas resultantes en este proceso tienen en general bajo contenido de
vitaminas y aminoácidos porque son destruidos en el proceso. Sin embargo la hidrólisis también
puede ser enzimática (con papaína, pancreatina, pepsina) y es realizada a mas bajas
temperaturas, y por lo tanto las peptonas del proceso tienen más elevado contenido de
aminoácidos y vitaminas que las de la hidrólisis ácida o alcalina.

Infusiones y extractos
Las fracciones solubles en agua de materiales como hígado, células de levadura, extracto de malta
y músculo tienen bajo contenido en péptidos pero contienen sustancias valiosas para un medio de
cultivo como vitaminas, metales traza y carbohidratos complejos. Ejemplos de ellos son los
extractos de carne (ricos en compuestos nitrogenados, vitaminas, aminoácidos), levadura (ricos en
vitaminas del complejo B, aminoácidos y compuestos carbonados y nitrogenados), malta (rica en
carbohidratos, especialmente maltosa y otros nutrientes) y corazón de buey.

Según la finalidad del medio de cultivo podemos encontrar distintos tipos:

1) Medios nutrientes (no selectivos)
Son medios de propagación que permiten el desarrollo de varios tipos de microorganismos. No
contienen inhibidores. Como ejemplos de medios nutrientes comunes tenemos agar nutriente, agar
tripticasa soja, caldo nutriente, etc. A veces estos medios se enriquecen con ciertos productos tales
como sangre, yema de huevo, etc. para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes:
tendríamos entonces un medio de cultivo rico o enriquecido; ej. agar sangre, agar chocolate (el
medio contiene sangre hemolizada).
También pueden contener indicadores de pH u otros para diferenciar la reaccion de los m.o.; tales
medios se llamarían medios diferenciales, por el. agar lactosa rojo fenol (indicador de pH rojo
fenol), caldo tioglicolato (indicador de potencial redox resazurina).

2) Medios selectivos o inhibitorios
Son medios que contienen además de los nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollo
de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros, por ej. agar cetrimide.
Estos medios también pueden contener indicadores para diferenciar los distintos tipos de
microorganismos que puedan crecer en él; tal medio sería selectivo y diferencial, por ej. Mac
Conkey, Baird Parker, EMB, etc. Los medios de enriquecimiento selectivo son medios selectivos


líquidos que contienen inhibidores, ej., sales biliares, altas concentraciones de cloruro de sodio,
etc.

3) Medios diferenciales
Contienen sustancias que permiten diferenciar las distintos tipos de m.o. por ej por sus
propiedades bioquímicas (producción de ácido de un carbohidrato, producción de pigmentos,
hidrólisis de un compuesto, etc) , ej: agar lactosa rojo fenol, agar Mac Conkey, agar Baird Parker
(contiene yema de huevo que permite ver la producción de lipasas). Pueden ser selectivos o no.

Para referirse a otras generalidades de los medios de cultivo, sus constituyentes, preparación en el
laboratorio, control de calidad y almacenamiento se pueden consultar los manuales de medios de
cultivo comerciales

Preparación de medios de cultivo
Cuando el medio va a repartirse en placas, se esterilizan por separado el medio de cultivo
(generalmente por autoclavado) y las placas de Petri (en horno); luego el medio termostatizado a
45 ºC se reparte en placas, usando técnica aséptica.
Cuando el medio va a repartirse en tubos, se reparte antes de su esterilización, colocando en cada
tubo un determinado volumen según el tamaño del tubo y si queremos o no que quede fondo.
Cada tubo se tapa con algodón (o también con capuchón de metal, plástico o tapón de rosca).
Cuando alguno de los constituyentes del medio de cultivo es termolábil se esteriliza por filtración y
se agrega al medio base luego de autoclavado.

Esterilización de material de vidrio:
Placas de Petri: se preparan en paquetes de 8 a 10 placas según el tamaño, envolviéndolas con
papel. Tubos: se tapa cada uno con un tapón de algodón y se envuelven con papel en paquetes
Pipetas: se coloca un algodón en la parte superior de la pipeta y se envuelve con papel. Se
esterilizan en horno a 160 (2 h) o a 180 ºC (1 h).


CARACTERÍSTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO

Agente Azúcar Sistema
Medio de cultivo Tipo de medio
bacteriostático fermentable Indicador
ALRF (agar lactosa diferencial (no
----- lactosa rojo fenol
rojo fenol) selectivo)
bromuro de
Agar Cetrimide selectivo ----- -----
cetiltrimetil amonio
selectivo y cristal violeta, sales
Agar Mac Conkey lactosa rojo neutro
diferencial biliares
VRBA (violeta rojo selectivo y cristal violeta, sales
lactosa rojo neutro
bilis agar) diferencial biliares
Manitol Salt Agar selectivo y
cloruro de sodio manitol rojo fenol
(Chapman) diferencial
rojo fenol, citrato
lactosa,
XLD agar (xilosa selectivo y desoxicolato de férrico amónico y
xilosa,
lisina desoxicolato) diferencial sodio tiosulfato de
sacarosa
sodio
selectivo y Cloruro de litio y yema de huevo,
Baird Parker agar ------
diferencial telurito de potasio telurito de potasio
enriquecimiento
TSB + 10% NaCl cloruro de sodio ------ ------
selectivo
Tetrationato, sales
enriquecimiento
Caldo Tetrationato biliares (verde ------ ------
selectivo
brillante)
CLBVB (caldo
enriquecimiento verde brillante, sales producción de
lactosa bilis verde lactosa
selectivo biliares gas
brillante)


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