Aula prática

1. Universidade Federal do ABC
Transformações Bioquímicas
RELATÓRIO 03
Desnaturação e Precipitação de Proteínas
Caroline Delcole Borsolari
Diego Rodrigo Massa Monteiro
Henrique de Abreu Piccolo
Jucilaine dos Santos Pereira
Lidia Furukawa
Profº Jiri Borecky
Santo André
2009
1

2. SUMÁRIO
PÁGINA
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 3
2 OBJETIVO .............................................................................................................. 5
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 6
3.1 Materiais ........................................................................................................... 6
3.2 Métodos ......................................................................................................... 6
3.2.1 Extração do suco de abacaxi ......................................................................... 6
3.2.2 Preparação da gelatina ................................................................................ 7
3.2.3 Ensaio 1 ........................................................................................................ 7
3.2.3 Ensaio 2 ......................................................................................................... 7
4 RESULTADOS ........................................................................................................ 8
4.1 Tabelas e fotos dos resultados ............................................................................. 8
4.2 O efeito do suco de abacaxi no colágeno ............................................................. 12
4.3 O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi ............................. 13
4.4 O efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução ........... 13
4.5 Dificuldades técnicas ............................................................................................ 14
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 14
5.1 As proteoses do suco de abacaxi .......................................................................... 14
5.2 Purificação de proteínas ........................................................................................14
5.3 A otimização da atividade das proteases .............................................................. 14
5.4 O efeito da temperatura na desnaturação de proteínas no processo de cozimento
dos alimentos .............................................................................................................. 15
5.5 A utilização do abacaxi para amaciar carne ..........................................................15
6
CONCLUSÃO.............................................................................................................15
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................16
2

3. 1 INTRODUÇÃO
Proteases (ou enzimas proteolíticas) é um grupo de enzimas que catalisam a
quebra das ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.
A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB, 1984)
sugeriram o uso do termo peptidase para um subconjunto de peptídeo-hidrolases
(subclasse E.C 3.4). O termo protease é usado como sinônimo de peptidase. As
peptidases compreendem dois grupos: endopeptidases (EC 3.4. 21-99) e exopeptidases
(EC 3.4.11-19), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia
peptídica e a eliminação do aminoácido seqüencial do terminal N ou C. A Figura 1
mostra o esquema de nomenclatura das proteases. O termo proteinase também pode ser
usado para endopeptidase [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].
FIGURA 1: Esquema de nomenclatura moderna de proteases [SALLEH,
RAHMAN & BASRI, 2006].
Endopeptidases
Endopeptidases atuam preferencialmente nas regiões internas da cadeia
polipeptídica, entre as regiões N e C terminal. A presença de grupos a-amino ou a-
carboxila tem um efeito negativo na atividade da enzima.
As endopeptidases podem ser subdivididas de acordo com o grupo reativo no
sítio ativo envolvido com a catálise em serina- (EC 3.4.21), cisteína- (EC 3.4.22),
aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou
metalloendopeptidases (EC 3.4.24).
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4. Exopeptidases
As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região
N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único
resíduo de aminoácido (aminopeptidases), um dipeptídeo (dipeptidil-peptidases) ou um
tripeptídeo (tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na região carboxi
terminal livre liberam um único aminoácido (carboxipeptidases) ou um dipeptídeo
(peptidil-dipeptidases). Algumas exopeptidases são específicas para dipeptídeos
(dipeptidases) ou removem resíduos terminais que são substituídos, ciclizados ou
ligados por ligações isopeptídicas. Ligações isopeptídicas são ligações peptídicas
diferentes daquelas entre uma a-carboxila e um a-amino grupo, e estes tipos de enzimas
são denominados omega peptidases.
Fontes
Proteases podem ser obtidas das plantas, animais e microorganismos. Proteases
produzidas das plantas incluem a papaína, bromelina, queratinase e ficina. A papaina é
extraída do mamão (Carica papaya). A bromelina é extraída do caule e frutos do
abacaxi e a ficina é obtida do látex da figueira (Ficus glabrata). Essas três proteases têm
especificidades similares, apesar de serem obtidas em diferentes fontes. Alguns grupos
de plantas botânicas produzem queratinase, que pode degradar o cabelo.
Alguns exemplos de proteases produzidas por animais são protaminase, tripsina,
quimotripsina, pepsina e renina. A protaminase é isolada de pâncreas bovino, leões
marinhos e porcos, enquanto a tripsina e a quimotripsina são sintetizadas no pâncreas e
secretadas na forma de zimogênio (tripsinogênio e quimotripsinogênio,
respectivamente). A pepsina pode ser obtida a partir de células da mucosa gástrica de
porcos, e a renina, do estomago de carneiros [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].
Aplicação das Proteases
Proteases têm grandes aplicações industriais, principalmente nas indústrias de
comida, detergentes, medicina e biotecnologia. Muitas proteases bacterianas foram
purificadas, classificadas e comercializadas. Na indústria alimentícia, por exemplo, a
aplicação das proteases inclui a produção de queijos, solubilização de pasta de peixe e
amaciamento de carnes. Além disso, as proteases também são muito utilizadas no
tratamento do couro em substituição aos compostos tóxicos e poluentes até então
4

5. utilizados. Pelos aspectos econômicos e tecnológicos, as proteases bacterianas são as
enzimas industriais mais utilizadas, com grandes aplicações em várias indústrias, como
detergente, couro, seda, pão, carnes e cervejarias. As proteases englobam 60% da venda
internacional de enzimas, sendo a enzima de detergente a maior usuária de proteases
[SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].
As proteases também estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como
a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas
proteolíticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no
ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Estes
fatos tornam as proteases um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de
novos compostos farmacêuticos. As enzimas proteolíticas também participam no
catabolismo de proteínas, tanto nas vias degradativas como nas biossintéticas, e na
liberação de hormônios peptídeos farmaceuticamente ativos a partir de proteínas
precursoras. Certas modificações específicas e seletivas de proteínas durante a ativação
de enzimas ocorrem via proteólise, que também colabora no transporte de proteínas
secretórias na membrana.
Na indústria farmacêutica, as proteases são usadas em pomadas cicatrizantes e
têm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as proteínas em
peptídeos e aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas células; devido a seu papel
despolimerizante, as enzimas extracelulares têm um papel importante na nutrição.
2 OBJETIVO
Mostrar a atividade proteolítica presente no suco de abacaxi, o efeito da
desnaturação protéica por temperatura e o efeito da alteração de solubilidade protéica e
conseqüente precipitação provocados pela adição de álcool ou sal de amônio em solução
de gelatina (colágeno).
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6. 3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
• 8 tubos de ensaio de 20 mL
• 1 tubo de ensaio de 30 mL
• Pegador de tubo de ensaio
• Estande para tubo de ensaio
• Béquer de 100mL da Laborglás
• Béquer de 400mL da Laborglás
• Béquer de 20mL da Laborglás
• Funil de vidro
• Papel de filtro
• Gelo
• Almofariz e pistilo
• 2 pipetas graduadas de 5mL
• Bastão de vidro
• Pera
• Balança
• Estufa
• H2O destilada
• Solução de Sulfato de Amônio 3mol/L
• Etanol
• Abacaxi
• Gelatina incolor sem sabor
3.2 Métodos
3.2.1 Parte 1 – Extração do suco de abacaxi
Macerou-se os pedaços de abacaxi com o auxílio do almofariz e do pistilo, até
que uma boa quantidade de suco fosse produzida. O suco foi filtrado em funil de vidro
6

7. com papel de filtro dentro de um tubo de ensaio de 20mL que se encontrava em um
béquer com gelo para que fosse mantida as propriedades do suco de abacaxi.
3.2.2 Parte 2 – Preparação da gelatina
Pesou-se 2g de gelatina incolor sem sabor e dissolveu em 20mL de água
destilada em um béquer com a ajuda do bastão de vidro. Após total solubilização a
gelatina derretida foi transferida para um tubo de 20mL e levada à estufa de banho
maria à 60°C. A gelatina ficou na estufa até o momento da sua utilização.
3.2.3 Parte 3 – Ensaio 1
Com a pipeta colocou-se 2mL do suco de abacaxi obtido na parte 1 do
experimento em três tubos de ensaio de 20mL. Colocou-se 2mL de água em um tubo de
ensaio de 20mL. Um tubo com abacaxi e o de água foram mantidos à temperatura
ambiente, os outros dois foram aquecidos, ao mesmo tempo, um à 60ºC e o outro à
100°C durante 5 minutos. Após esse tempo os dois tubos foram resfriados
imediatamente no béquer com gelo. Retirou-se o tubo com a gelatina da estufa e
adicionou-se 2mL em cada um dos quatro tubos. Armazenou-se os 4 tubos à 37°C por
10 minutos. Após o tempo resfriou-se as amostras no béquer com gelo por 15 minutos.
As amostras foram observadas e os resultados anotados.
3.2.4 Parte 4 – Ensaio 2
Com a pipeta colocou-se 2mL de água, sulfato de amônio e etanol, um em cada
tubo de ensaio. Adicionou-se 2mL de gelatina em cada um dos três tubos. As amostras
foram observadas e os resultados anotados.
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8. 4 RESULTADOS
4.1 – Tabelas e fotos dos resultados
Os resultados obtidos na Parte 1 podem ser observados na Tabela 1:
TABELA 1: A ação das proteases do abacaxi sobre o colágeno
Branco Abacaxi Abacaxi 60º C Abacaxi fervido
Água 2 mL - - -
Amostra - 2 mL 2 mL 2 mL
Gelatina 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Resultado Sólido e sem
partículas.
Líquido e sem
partículas.
Líquido e com
pequenas partículas.
Sólido e com
muitas partículas.
As respectivas fotos dos resultados da Tabela 1 estão nas Figuras 2, 3, 4 e 5:
FIGURA 2: Resultado Branco Parte 1
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9. FIGURA 3: Resultado Abacaxi
FIGURA 4: Resultado Abacaxi 60ºC
9

10. FIGURA 5: Resultado Abacaxi Fervido
Os resultados obtidos na Parte 2 podem ser observados na Tabela 2:
TABELA 1: A ação do etanol e do sulfato de amônio sobre o colágeno
Branco Ensaio 1 Ensaio 2
Água
2 mL -
Gelatina
2 mL 2 mL 2 mL
Sulfato de
Amônio
- 2 mL -
Etanol
Absoluto
- - 2 mL
Resultado
Solubilizou, a
solução adquiriu
coloração
amarelada.
Solubilizou
parcialmente, com
formação de placas
sólidas.
Solubilizou
parcialmente, com
formação de
precipitado gelatinoso.
As respectivas fotos dos resultados da Tabela 2 estão nas Figuras 6, 7 e 8:
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11. FIGURA 6: Resultado Branco Parte 2
FIGURA 7: Resultado Ensaio 1
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12. FIGURA 8: Resultado Ensaio 2
4.2 – O efeito do suco de abacaxi no colágeno
A desnaturação de proteínas acarreta perda de sua estrutura original (Figura 9).
A proteína assume sua conformação nativa, ocorrendo alteração na conformação
tridimensional das proteínas (estrutura secundária, terciária e quaternária) sem romper
as ligações peptídicas (estrutura primária).
A proteína é dita desnaturada quando sua conformação nativa é destruída devido
a quebra de ligações não-covalentes e o resultado é uma cadeia polipeptídica distendida.
FIGURA 9: Desnaturação de Proteínas
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13. Um dos agentes de desnaturação de proteínas é ação de ácidos ou base fortes.
Quando adicionamos o suco de abacaxi ao colágeno ocorrem modificações no
pH que resultam em alterações no estado iônico de cadeias laterais das proteínas,
modificando as pontes de hidrogênio e as pontes salinas (associação de grupos iônicos
de proteínas de carga oposta). Como afeta a ionização da proteína, conferem a molécula
uma elevada carga positiva, ou negativa, ocasionando repulsão intramolecular, com
exposição do núcleo hidrofóbico.
4.3 – O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi
Quando elevamos a temperatura do suco de abacaxi, as enzimas presentes no
suco de abacaxi são também desnaturadas, e a capacidade de quebra do colágeno é
corrompida.
Como a estrutura tridimensional específica das proteínas é fundamental para o
exercício de suas funções, alterações estruturais provocadas pela desnaturação
ocasionam a perda parcial ou completa das suas funções. Com o aumento da
temperatura, a velocidade de vibração molecular aumenta. Eventualmente, interações
fracas como as pontes de hidrogênio são rompidas promovendo alterações na
conformação das enzimas presentes no abacaxi.
4.4 – O efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução
A adição de solvente orgânicos solúveis em água, como o etanol, ao colágeno
presente na gelatina diminuem a constante dielétrica do meio, interferem com as
interações hidrofóbicas por sua interação com os grupos R não−polares e forma pontes
de hidrogênio com a água e grupos protéicos polares. Os solventes não-polares também
rompem interações hidrofóbicas.
A adição de sais, como o sulfato de amônio a grupos ionizáveis do colágeno,
enfraquecem as interações entre grupos de cargas opostas da molécula protéica. As
moléculas de água solvatam os grupos protéicos, havendo a formação de um precipitado
gelatinoso. As moléculas de água competem pelo sal adicionado tornando a quantidade
de solvente muito pequena e, com isso, promovendo a agregação de moléculas protéicas
e a sua precipitação. Esse efeito é chamado salting out.
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14. 4.5 – Dificuldades técnicas
O suco de abacaxi poderia ter sido coado em antes de ser filtrado, para que os
maiores pedaços fossem tirados primeiro e não interferissem na filtragem de caráter tão
delicado.
5 DISCUSSÃO
5.1 – As proteases do suco de abacaxi
O abacaxi possui uma potente enzima, a bromelina, que leva esse nome pelo fato
de o abacaxi pertencer à família das bromeliáceas. A bromelina foi detectada pela
primeira vez em 1892 por Chittenden. Ela está presente em todas as partes do abacaxi,
porém é no caule que se encontra maiores quantidades, por isso que se diz que a
bromelina não é fornecida em grandes quantidades se apenas for degustado o abacaxi.
A enzima não está presente nos primeiros estágios de desenvolvimento do fruto,
porém, seu nível aumenta rapidamente, mantendo-se elevado até o amadurecimento,
onde tem um pequeno decréscimo. Essa é uma das vantagens da utilização das proteases
do abacaxi em comparação com outras proteases vegetais. Apesar da diminuição da
atividade proteolítica durante a maturação, o abacaxi é o único fruto que possui
concentrações relativamente altas de proteases no estado maduro.
5.2 – Purificação de proteínas
A purificação da bromelina pode ser realizada através de um método conhecido
por ALE (Adsorção em Leito Expandido). Esta é uma técnica cromatográfica para
separação e purificação de produtos biológicos diretamente de seu extrato bruto, sem o
uso de centrifugação, microfiltração e outros passos primários de clarificação. Esta
técnica permite que o extrato bruto seja alimentado na coluna cromatográfica sem
tratamento inicial, e enquanto o leito expande, a superfície de contato do adsorvente
aumenta, fazendo que a interação com a molécula alvo seja mais efetiva.
5.3 – A otimização da atividade das proteases
A atividade das proteases pode ser otimizada com o aumento da temperatura e
com a proximidade do pH neutro. Esta temperatura não pode ser muito elevada, senão
irá ocorrer a desnaturação da protease.
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15. 5.4 – O efeito da temperatura na desnaturação de proteínas no processo de
cozimento dos alimentos
A desnaturação de proteínas não tem grande influência na utilidade nutricional
dos alimentos, mas tem grande efeito em outras propriedades como sabor, cor,
estabilidade e solubilidade, ou seja, a desnaturação de proteínas pelo fornecimento de
calor é útil, pois facilita a digestão dos alimentos. Por exemplo, quando cozinhamos um
ovo, as proteínas desnaturadas tornam-se insolúveis e se solidificam, separando-se da
água, o que torna-se melhor para o consumo.
5.5 – A utilização do abacaxi para amaciar carne
Esta propriedade deve-se à bromelina, que é capaz de desdobrar proteínas em
substâncias mais simples como proteoses e peptonas. Ela quebra as proteínas das fibras
musculares e do tecido conjuntivo, que dá liga ao músculo e é um dos principais
responsáveis pela eventual dureza da carne. A relação do suco de abacaxi e os
amaciantes de carne comerciais são de que a bromelina pode ser utilizada na fórmula do
amaciante. Os amaciantes comerciais juntam temperos, fazendo com que não fique
gosto de abacaxi na carne. Um exemplo que temos, é um amaciante de carne da Nestlé,
que utiliza a protease do mamão, a chamada papaína.
6 CONCLUSÃO
Durante o experimento, verificamos que as proteases (enzimas catalíticas
biológicas) atuam nas ligações peptídicas, neste caso, foram às ligações do colágeno e
as quebram. A prova disso é que quando a protease envolvida (bromelina) foi
desnaturada, portanto perdendo sua função, o colágeno reagiu naturalmente, ou seja,
enrijeceu a solução, como mostrado nos experimentos.
Observamos também que uma das vias para o desnaturamento é o aumento da
temperatura, pois a 100 °C a bromelina perdeu totalmente seu poder de reação com o
colágeno. Isto pode ser visto com as fases presentes nos tubos de ensaio. Além da
temperatura, têm-se também a solvatação que foi realizada na segunda parte do
experimento e que demonstrou mesmo com a temperatura sendo ambiente como as
forças nas ligações peptídicas podem modificar-se de acordo com o reagente colocado
para atuar na proteína.
Dessa maneira, acrescentamos mais um grau de complexidade aos organismos
vivos, pois para eles existirem, para que suas proteínas exerçam suas devidas funções e
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16. não saiam de controle, deve haver intrincados sistemas de controle de temperatura e de
reações bioquímicas.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- SALLEH, Abuh B., RAHMAN, Rajah A., BASRI, Mahiran: New Lipases and
Proteases. 1ª Ed. Nova Science Publishers: New York, 2006, p. 23-34.
- URL 01: Proteases de Microorganismos. Disponível em:
http://acd.ufrj.br/proteases/ProteaseApres.htm. Acesso em 08/11/2009.
- URL 02: Bromelina. Disponível em:
http://www.todafruta.com.br/todafruta/mostra_conteudo.asp?conteudo=19499. Acesso
em 08/11/2009.
-URL 03: Bromelina como amaciante natural de carnes.
http://www.sbpcnet.org.br/livro/57ra/programas/senior/RESUMOS/resumo_1398.html.
Acesso em 08/11/2009.
- URL 04: Abacaxi. http://supermundo.abril.com.br/busca/?qu=abacaxi. Acesso em
08/11/2009.
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