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O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74balance de óxido-reducción en la ...
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  1. 1. Revista Mexicana de Ingeniería QuímicaUniversidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapaamidiq@xanum.uam.mcISSN (Versión impresa): 1665-2738MÉXICO 2005 O. Soto Cruz / J. Páez Lerma BALANCES EN PROCESOS DE FERMENTACIÓN: ANÁLISIS DE CONSISTENCIA Y DE FLUJOS METABÓLICOS Revista Mexicana de Ingeniería Química, año/vol. 4, número 001 Universidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapa Distrito Federal, México pp. 59-74 Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal Universidad Autónoma del Estado de México
  2. 2. REVISTA MEXICANA DE INGENIERIA QUIMICA Vol. 4 (2005) 59-74 AMIDIQBALANCES EN PROCESOS DE FERMENTACION: ANALISIS DE CONSISTENCIA Y DE FLUJOS METABOLICOS FERMENTATION PROCESS BALANCES: CONSISTENCY AND METABOLIC FLUX ANALYSIS O. Soto-Cruz * y J. Páez-LermaDepartamento de Ingenierías Químicas y Bioquímica, Instituto Tecnológico de Durango Blvd. Felipe Pescador 1830 Ote. Col. Nueva Vizcaya, 34080, Durango, Dgo. México Recibido 22 Junio 2004; Aceptado 14 Marzo 2005ResumenLos balances estequiométricos en procesos de fermentación son esenciales para su entendimiento y/o aplicación. Elcálculo de flujos metabólicos resulta fundamental en estudios cuantitativos de fisiología celular. Una poderosaherramienta para la determinación de los flujos en la red de reacciones bioquímicas es el análisis de flujosmetabólicos, en el cual los flujos intracelulares son calculados usando un modelo estequiométrico que describe labioquímica del microorganismo. El análisis de flujos metabólicos es particularmente útil en conexión con estudios deproducción de metabolitos, donde el objetivo es dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia unproducto metabólico, además de permitir el cálculo de flujos extracelulares no medidos y rendimientos teóricosmáximos, identificación de vías metabólicas alternas y puntos ramificados de control metabólico En este trabajo sepresenta una revisión de las metodologías de análisis de consistencia y análisis de flujos metabólicos y su aplicacióna sistemas de fermentación.Palabras clave: balances elementales, metabolismo, modelo estequiométrico.AbstractStoichiometric balances in fermentation processes are esential for their understanding and/or application. Thecalculation of metabolic flows is fundamental in quantitative studies of cellular physiology. Metabolic flux analysisis a powerful tool for the determination of the flows in the network of biochemical reactions. Intracellular fluxes arecalculated using a stoichiometric model that describes the biochemistry of the microorganism. Metabolic fluxanalysis is particularly useful in connection with studies of metabolite production, where the objective is to direct asmuch carbon as it is possible from a substrate towards a metabolic product, besides to allow the calculation of non-measured extracellular fluxes and maximum theoretical yields, identification of alternating metabolic pathways andbranched nodes of metabolic control. This work presents a revision of methodologies of consistency and metabolicflux analysis and their application to fermentation systems.Keywords: elemental balances, metabolism, stoichiometric model.1. Introducción conocimiento metabólico de un microorganismo en una red de reacciones Los procesos de fermentación, son bioquímicas y provee una medida del gradocaracterizados por el crecimiento de una de ajuste entre varias vías metabólicaspoblación de microorganismos, que degradan (Varma y Palsson, 1994; Stephanopoulos yun sustrato, formando algún(os) producto(s) col., 1998; Nielsen, 2001). El grado de ajustede fermentación, por lo que los balances del entre vías metabólicas se entiende como laproceso son esenciales para su entendimiento producción de intermediarios en unas y ely/o aplicación. El cálculo de flujos consumo de los mismos en otras, pormetabólicos es una herramienta de la ejemplo, cuando las condiciones ambientalesingeniería metabólica y una determinación cambian los flujos metabólicos sonfundamental en estudios cuantitativos de redistribuidos de manera que se mantenga elfisiología celular, ya que permite organizar el*Autor para la correspondencia: E-mail: soto@itdurango.edu.mxTel/Fax: (61) 88186936 Publicado por la Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química, A. C. 59
  3. 3. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74balance de óxido-reducción en la célula 1.2 Calcular rendimientos teóricos máximos(Varma y Palsson, 1994; Torres y Voit, Con base en el modelo estequiométrico2002). Una poderosa herramienta para la y la especificación de algunas restriccionesdeterminación de los flujos en la red de en el metabolismo, es posible calcular elreacciones bioquímicas es el análisis de flujos rendimiento teórico máximo para unmetabólicos (AFM), en el cual los flujos metabolito (van Gulik y Heijnen, 1995). Porintracelulares son calculados usando un ejemplo, Jørgensen y col. (1995) calcularonmodelo estequiométrico que describe la el rendimiento teórico máximo de penicilinabioquímica del microorganismo (Jørgensen y a partir de glucosa para Penicilliumcol., 1995; Nissen y col., 1997; chrysogenum en un medio complejo, bajo laStephanopoulos y col., 1998). Sin embargo, suposición de ausencia de crecimiento,ya que el análisis cuantitativo del mientras que Causey y col., (2004) realizaronmetabolismo requiere datos experimentales, un estudio similar para la conversión dees importante que la consistencia de los datos glucosa en piruvato por Escherichia coli.sea confirmada, antes de utilizarlos en ladeterminación de flujos metabólicos 1.3 Identificar vías alternativas(Stephanopoulos y col., 1998). El AFM puede considerarse como un La formulación del modelocampo de importancia fundamental y estequiométrico requiere de una informaciónpráctica, que puede proporcionar bioquímica detallada. Sin embargo, encontribuciones básicas, en la medición y muchos casos algunos detalles sonentendimiento del control de flujos in vivo, desconocidos o puede no saberse si una víaque lleva a cabo la célula (Stephanopoulos y determinada está activa bajo las condicionescol., 1998; Nielsen, 2001). Esto es de experimentación. Además, puede haberparticularmente útil en conexión con estudios varias isoenzimas con funciones que no sonde producción de metabolitos, donde el conocidas en detalle. Calculando los flujosobjetivo es dirigir tanto carbono como sea metabólicos con diferentes arreglos de víasposible desde un sustrato hacia un producto bioquímicas, puede ser posible identificarmetabólico (Nissen y col., 1997). Por otra cuál de los arreglos es el que másparte, el AFM es de gran utilidad para probablemente esté activo. Este uso del AFM(Nissen y col., 1997; Stephanopoulos y col., fue ilustrado por Aiba y Matsuoka (1979), en1998): el que se considera el primer trabajo de aplicación del AFM, dónde se examinaron varias vías anapleróticas en la producción de1.1 Calcular flujos extracelulares no medidos ácido cítrico por Candida lipolytica. Por otra parte, Zhao y col. (2004) estudiaron los En algunos casos, el modelo cambios en el metabolismo central de E. coliestequiométrico y los flujos extracelulares por cambios genéticos en la vía de lasmedidos permiten calcular, además de los pentosas fosfáto.flujos intracelulares, flujos extracelulares nomedidos o incluso algunos que sí fueron 1.4 Identificación de puntos ramificados demedidos pero fueron intencionalmente control metabólico (rigidez de nodos)omitidos en los cálculos. En éste último caso,el grado de concordancia entre los flujos Mediante la comparación de lamedidos y las predicciones del modelo, distribución de flujos bajo diferentespueden servir para validarlo. condiciones de operación es posible identificar si un nodo es flexible o rígido.60
  4. 4. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 En un nodo flexible las proporciones redundancia de datos. Esta se introducede los flujos en las diferentes ramas se cuando se emplean sensores múltiples paraajustan de acuerdo a las condiciones de medir la misma variable, o cuando lascultivo, mientras que en un nodo rígido mediciones obtenidas guardan ciertaslas proporciones son constantes restricciones, tales como cumplir conindependientemente de las condiciones de balances elementales (Nielsen y Villadsen,cultivo (Stephanopoulos y Vallino, 1991). 1994). La redundancia de datos tambiénPor ejemplo, en la producción de lisina por puede ser usada para la identificaciónCorynebacterium glutamicum, se determinó sistemática de fuentes de errores gruesos enque los nodos de glucosa-6-fosfato, piruvato las mediciones (van der Heijden, y col.,y oxalacetato son flexibles, mientras que el 1994b; Stephanopoulos y col., 1998). Paranodo de fosfoenolpiruvato es rígido (Vallino que el análisis de consistencia pueday Stephanopoulos, 1993; Tryfona y Bustard, funcionar, los datos experimentales que se2005). En este trabajo se presenta una empleen deben tener las siguientesrevisión de las metodologías de análisis de características (Stephanopoulos y col., 1998):consistencia y análisis de flujos metabólicosy su aplicación a sistemas de fermentación. a) Completos. Se deben medir todos losEn lo subsiguiente, como caso de estudio, se sustratos y productos presentes en cantidadesutilizan los sistemas lineales derivados del significativas, lo que implica el uso deproceso de fermentación estudiado por Soto- medios químicamente definidos. Cuando seCruz (2002), en el que se realizó cultivo utilizan medios complejos, los balancescontinuo de la bacteria ruminal Megasphaera elementales no se cumplen si se considera elelsdenii. Las reacciones metabólicas metabolismo en su conjunto (catabolismo yconsideradas se presentan en la Fig. 1 y se anabolismo), por lo cual el estudio sedetallan en la Tabla 2. Pueden distinguirse restringe generalmente al catabolismo sintres tipos de compuestos. Sustratos, como el considerar el crecimiento de la biomasa.L-lactato, productos como biomasa, acetato yCO2 y; compuestos intermediarios, como b) Libres de ruido (tanto como sea posible).Acetil CoA, ATP y Eritrosa4P. El ATP Ya que las tasas de reacción son derivadas deproviene de la fosforilación del ADP, el cual las mediciones de concentración, el ruido ense omite por simplicidad, en este tipo de tales mediciones introduce incertidumbre enestudios. Así mismo, debe señalarse que las variables derivadas.cuantificación de los flujos metabólicos no En el modelo de caja negra todas lastoma en cuenta la regulación metabólica, lo reacciones celulares son agrupadas en unaque es tema del análisis de control sola reacción y el método básicamentemetabólico. La comparación de los mapas de consiste en la validación de balancesflujos metabólicos, obtenidos bajo diferentes elementales, considerando a la biomasa comocondiciones de cultivo o utilizando diferentes una caja negra que intercambia materialescepas, permiten determinar el impacto de con el medio. Los flujos de entrada y salidaperturbaciones genéticas o ambientales de la caja negra son, por una parte, las tasas(Stephanopoulos y col., 1998; Torres y Voit, específicas de consumo de sustrato2002). (elementos del vector rS) y, por otra parte, las tasas específicas de formación de producto2. Análisis de consistencia de datos (elementos del vector rP). Además existeexperimentales acumulación de biomasa dentro de la caja, la El análisis de consistencia de datos cual es representada como un flujo de salidaexperimentales puede realizarse aplicando la con tasa específica µ. 61
  5. 5. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 Fig. 1. Red metabólica considerada para el caso de estudio. Tabla 1. Valores de la distribución χ2 hasta cinco grados de libertad (Tomada de Stephanopoulos y col., 1998). Nivel de confianza Grados de libertad 0.500 0.750 0.900 0.950 0.975 0.990 1 0.46 1.32 2.71 3.84 5.02 6.63 2 1.39 2.77 4.61 5.99 7.38 9.21 3 2.37 4.11 6.25 7.81 9.35 11.30 4 3.36 5.39 7.78 9.49 11.10 13.30 5 4.35 6.63 9.24 11.10 12.80 15.1062
  6. 6. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 Ya que todas las reacciones celulares 3. Un conjunto de tasas específicas deestán agrupadas en una sola reacción, los todos los sustratos y productos, incluida lacoeficientes estequiométricos de está biomasa.reacción global están dados por loscoeficientes de rendimiento con respecto a la 4. Un conjunto de tasas volumétricas debiomasa. La reacción global es: todos los sustratos y productos, incluida la biomasa. M NX + ∑ Y XPi Pi − ∑ Y SPi S i = 0 (1) Cualquiera de los arreglos anteriores i =1 i =1 proporciona los mismos resultados. Lo másDónde: usual es utilizar coeficientes de rendimiento expresados con respecto a uno de losX = Biomasa sustratos, usualmente la fuente de carbono. Antes de presentar los balances elementales, rPi es conveniente introducir la expresión de lasY XPi = = Coeficiente de rendimiento del rX fórmulas elementales de los compuestosproducto i con respecto a la biomasa. involucrados, normalizados con respecto a su contenido de carbono. Por ejemplo, laPi = Producto i fórmula elemental de la glucosa, que es rSi C6H12O6, se expresa como CH2O en base a unYSPi = = = Coeficiente de rendimiento del rX átomo de carbono. Así, el balance desustrato j con respecto a la biomasa. carbono, en base C-mol y considerando un solo sustrato, es expresado como:Si = Sustrato i M ∑Y i =1 SPi + YSX + YSC = 1 (2) Como el coeficiente estequiométrico dela biomasa es uno, la tasa de reacción estádada por la tasa específica de crecimiento de Dónde:la biomasa, la cual, junto con los coeficientes rPide rendimiento especifican completamente el Y SP i = = Coeficiente de rendimiento del rSsistema. En la aplicación del modelo de caja producto i con respecto al sustrato.negra para el análisis de consistencia, sepuede utilizar cualquiera de los siguientes rX Y SX = = Coeficiente de rendimiento deconjuntos de datos (Stephanopoulos y col., rS1998): biomasa con respecto al sustrato.1. Un conjunto de coeficientes de rCO 2rendimiento como los que aparecen en la Y SC = = Coeficiente de rendimiento del rSreacción global, junto con la tasa específica CO2 con respecto al sustrato.de crecimiento. En la Ec. 2 los coeficientes de2. Un conjunto de coeficientes de rendimiento tienen unidades de C-mol porrendimiento con respecto a otra referencia cada C-mol de sustrato. El CO2 se considera(por ejemplo un sustrato), junto con la tasa separado de los demás productos, ya que noespecífica de consumo/formación de ese contribuye al balance generalizado de gradocompuesto de referencia. de reducción: 63
  7. 7. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 M biológicos. De esta manera, las Ecs. 2 y 3∑Yi =1 SP i γ P + Y SX γ i X =γ S (3) establecen que el carbono y el grado de reducción que se introduce a la caja negra, debe ser recuperado en los productos queDónde: salen de ella. Es importante mencionar que la composición elemental de la biomasa,γ S = grado de reducción del sustrato normalizada con respecto a su contenido deγ p = grado de reducción del producto i i carbono, que tiene la forma CHaObNc,γ X = grado de reducción de la biomasa depende de su contenido macromolecular (proteínas, carbohidratos, lípidos, etc.) y, por Este balance fue introducido por Roels lo tanto, de las condiciones de cultivo. Sin(1983), como una generalización del trabajo embargo, excepto para situaciones extremas,de Erickson y col. (1978), quienes definieron es razonable usar la composición promedioel grado de reducción de un compuesto como (CH1.81O0.52N0.21, con un 6% p/p de cenizas),el número de electrones disponible para cuando la composición exacta de la biomasatransferirse al oxígeno en la combustión del no es conocida (Stephanopoulos y col.,compuesto. En el balance generalizado de 1998).grado de reducción, el grado de reducción de De una manera similar al balance deun compuesto es un factor de cálculo que se carbono que se presenta en la Ec. 2, puedenelige por conveniencia, de manera arbitraria, escribirse balances para los otros elementosde modo que los coeficientes que participan en la reacción expresada en laestequiométricos para el dióxido de carbono, Ec. 1. Estos balances pueden serel agua, la fuente de nitrógeno, la fuente de convenientemente escritos colocando laazufre y la fuente de fósforo, desaparezcan composición elemental de la biomasa,del balance generalizado de grado de sustratos y productos en las columnas de unareducción (Nielsen y Villadsen, 1994). Es matriz E, cuyos renglones representan a cadadecir, no hay una definición física del grado uno de los elementos involucrados. Para elde reducción; éste es únicamente un factor de caso de un proceso en el que, además de lacálculo y el planteamiento de Erickson y col. biomasa, se tengan M productos y N(1978) es un caso particular. Para obtener el sustratos, que incluyan I elementosgrado de reducción de un compuesto dado, se (normalmente C, H, O y N) en sudebe tomar en cuenta lo siguiente. En primer composición, se tendrá una matriz E de Ilugar, se elige al átomo de hidrógeno como la renglones por M+N+1 columnas. Este es ununidad de grado de reducción. sistema con I restricciones (balances En seguida se selecciona un compuesto elementales que se deben cumplir) y M+N+1con grado de reducción cero para cada tasas de reacción (r), el cual puede serelemento: H2O para oxígeno, CO2 para el representado por:carbono, NH3 para el nitrógeno, H2SO4 parael azufre y H3PO4 para el fósforo. Estas dos Er = 0 (4)elecciones permiten establecer que el gradode reducción de cada uno de los átomosinvolucrados es -2 para el oxígeno, 4 para el Los grados de libertad (F) del sistemacarbono, -3 para el nitrógeno, 6 para el azufre son F = M+N+1-I. Si se tienen exactamentey 5 para el fósforo. Así, puede obtenerse el F tasas de reacción medidas, es posiblegrado de reducción de los compuestos más calcular las demás, pero no hay redundanciascomunes que intervienen en procesos para validar la consistencia de los datos.64
  8. 8. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 De manera que es recomendable todos los compuestos que intervienen en elplanear la medición de más mediciones que proceso, expresados en base C-mol, y suslos grados de libertad del sistema. En el caso tasas netas de consumo/producción. Losde un sistema en el que se tenga un número balances se escriben como sigue.mayor de mediciones experimentales, que de Cada renglón de la matriz E contienegrados de libertad, el sistema se denomina los coeficientes estequiométricos de unsobredeterminado. En éste caso, la balance elemental (de arriba a abajo, C, H, Oredundancia de las mediciones puede ser y N) y cada columna contiene los coeficientesusada para: de la fórmula, en base C-mol, de los compuestos que intervienen en el proceso (de• Calcular las tasas no medidas. izquierda a derecha, lactato, biomasa, acetato,• Incrementar la exactitud de las mediciones disponibles. propionato, butirato, valerato, NH3, CO2 y• Identificar si existe una fuente de errores H2O). Se tienen dos sustratos (lactato y NH3) gruesos en las mediciones. y siete productos (biomasa, acetato, propionato, butirato, valerato, CO2 y H2O), Para el caso de estudio, el análisis de por lo tanto, los grados de libertad dellos datos comienza planteando los balances sistema son: F = 2 + 7 - 4 = 5. De manera queelementales de C, H, O y N, lo cual se conoce se deben medir al menos cinco compuestoscomo modelo de caja negra, considerando para que el sistema tenga solución única.Balance de carbono:rlactato + rbiomasa + racetato + rpropionato + rbutirato + rvalerato + rCO2 = 0 (5)Balance de hidrógeno:2rlactato + 1.81rbiomasa + 2racetato + 2rpropionato + 2rbutirato + 2rvalerato + 3rNH3 + 2rH2O = 0 (6)Balance de oxígeno:rlactato + 0.52rbiomasa + racetato + 2/3rpropionato + 1/2rbutirato + 2/5rvalerato + 2rCO2 + rH2O = 0 (7)Balance de nitrógeno:0.21rbiomasa + rNH3 = 0 (8)Estas cuatro Ecs. constituyen un sistema lineal similar a la Ec. 4, que en este caso se escribe:  r Lactato     rBiomasa   r  0   Acetato 1 1 1 1 1 1 0 1 0    rPr opionato    2 1 . 81 2 2 2 2 3 0 2   0 (9) 1 rButirato =   0 . 52 1 2/3 1/ 2 2/5 0 2 1   0    rValerato    0 0 . 21 0 0 0 0 1 0 0   0      r NH 3   rCO    rH O 2    2  65
  9. 9. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 Ya que se midieron seis compuestos metodología que se detalla a continuación. La(lactato, biomasa, acetato, propionato, matriz y el vector del lado izquierdo de la Ec.butirato y valerato), el sistema es 9 pueden verse como vectores de dossobredeterminado y puede validarse la componentes que tienen como entradas a lacalidad de los datos experimentales, matriz Em y Ec, y los vectores rm y rc,calculándose el índice de consistencia en el respectivamente, como se muestra amodelo de caja negra, h (Stephanopoulos y continuación:col., 1998), para lo cual se utiliza la   rLactato      rBiomasa   r  0     0 Acetato  1 1 1 1 1 1  0 1      rPr opionato  0  2 2  3 2    =   1 . 81 2 2 2  0  rButirato  1 2 / 5 0 1     0  0 . 52 1 2 / 3 1/ 2 2    rValerato (10)  0         0 . 21 0 0 0 0  1 0 0     0     rNH 3    r     CO 2     rH O     2  o bien: cuadrada, la solución del sistema está dada por la Ec. (Noble y Daniel, 1977): 0   (11)(E m r E c ) m r  c  0  =     0 ( rc = − E c E c T ) −1 T E C E m rm (13) 0   Una vez calculadas las tasas deDe manera que al hacer la multiplicación de consumo/producción no medidas, puedematrices del lado izquierdo de la Ec. 11, se validarse la consistencia global de las tasasobtiene: medidas y calculadas. Para esto, se inserta la Ec. 13 en la Ec. 12, con lo que se obtiene:E m rm + E c rc = 0 (12) Rrm = 0 (14)La matriz Em contiene los coeficientes de la donde R es la matriz de redundancia (van dercomposición elemental de los compuestos Heijden y col., 1994a, van der Heijden y col.,medidos y el vector rm contiene las tasas de 1994b) que está dada por:consumo/producción de tales compuestos.Por su parte, la matriz Ec contiene loscoeficientes de la composición elemental de R = Em − Ec Ec Ec T ( )−1 ET E m c (15)los compuestos no medidos, mientras que elvector rc contiene las tasas de El rango de R, es decir, el número deconsumo/producción de los compuestos no vectores renglón linealmente independientes,medidos. Como el sistema es está relacionado con las variables medidas ysobredeterminado y la matriz Ec no es especifica el número de ecuaciones independientes que tienen que satisfacerse.66
  10. 10. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 Las Ecs. linealmente dependientes se distribución χ2 y que los grados de libertadeliminan, quedando la matriz de redundancia son iguales al rango de R (Wang –yreducida, Rr, la cual constituye la base del Stephanopoulos, 1983; van der Heijden yanálisis posterior. Como consecuencia del col., 1994b, van der Heijden y col., 1994 c).error experimental, la Ec. 14 no se cumple Por lo tanto, comparando el valor calculadoexactamente. Al eliminar los renglones de la función h con los valores de lalinealmente dependientes y multiplicar Rr por distribución χ2 a los grados de libertadrm, debería obtenerse un vector cero. Sin correspondientes [rango(R)], es posibleembargo, debido al error experimental lo que validar la calidad de los datos y lase obtiene es un vector de residuos, ε, dado aplicabilidad del modelo (Stephanopoulos ypor: col., 1998). Los valores de la distribución χ2 se presentan en la Tabla 1. La manera deε = Rr rm (16) interpretar los datos obtenidos es la siguiente. Se rechaza la hipótesis de que la cantidad deDe manera que, si se dispone de estimaciones error presente en las mediciones no esde los errores de medición, se puede suponer significativa, si h ≥ χ2 a un nivel de confianzaque el vector de error es normalmente y grados de libertad dados. Un nivel dedistribuido, con media cero y matriz de confianza de 90 o 95% es usualmentevarianza-covarianza F. van der Heijden y col. adecuado (Wang y Stephanopoulos, 1983).(1994b) demostraron que los residuos de la Una vez que se ha determinado que noecuación 16 también son normalmente existen errores gruesos de medición, es decir,distribuidos, con media cero y matriz de que la calidad de los datos se ha validado, sevarianza-covarianza, P, dada por: pueden calcular las tasas de consumo/producción no medidas queP = R r FR r T (17) contiene el vector rc, utilizando la Ec. 13 (Stephanopoulos y col., 1998). Más aún, esLa matriz F es una matriz diagonal cuadrada, posible calcular mejores estimados para lascuyos elementos de la diagonal principal se tasas medidas, utilizando la Ec:calculan elevando al cuadrado el producto delos correspondientes valores de las tasas rm = rm + δ (19)medidas por sus desviaciones estándar (Wangy Stephanopoulos, 1983). Una vez que se donde rm es el vector de estimados de lastienen calculados el vector de residuos (ε) y variables medidas y δ es el vector de lossu correspondiente matriz de estimados de los errores de medición, quevarianza-covarianza (P), se puede calcular el está dado por (van der Heijden y col., 1994b):índice de consistencia, h, dado por: −1 δ = FR r P −1 R r rm T (20)h = εTP ε (18) Si, por otra parte, el valor de la función h esque es una función de prueba, la cual permite mayor o igual al correspondiente valor de χ2,establecer si los residuos son indicando errores gruesos de medición, essignificativamente diferentes de cero. Si esto posible identificar qué variable medida es laocurre, el modelo es incorrecto o existe error fuente de tales errores. El procedimientosistemático en al menos una medición consiste en eliminar cada una de las(Stephanopoulos y col., 1998). Se ha mediciones realizadas (una a la vez) deldemostrado que la función h sigue una 67
  11. 11. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74vector de tasas medidas, colocarla en el El producto final del cálculo es un mapavector de tasas no medidas y calcular la de flujos metabólicos que muestra la tasa (esfunción h. Cuando al eliminar una medición decir el flujo) a la cual ocurre cada una de lasdel vector de tasas medidas y calcular la reacciones (Stephanopoulos y col., 1998).función h, se obtenga un valor más pequeño Sobre el sistema lineal contenido en la matrizque el correspondiente de la función χ2, A, se pueden hacer algunos comentarios quepuede concluirse que la medición eliminada resultan valiosos y que es convenientees la fuente de error (Stephanopoulos y col., considerar antes de hacer experimento1998) y corregirse su valor, calculándolo alguno. Si la matriz estequiométrica esjunto con las tasas no medidas, utilizando la singular, dos o más reacciones sonEc.13. La metodología anteriormente linealmente dependientes y no existe unaexpuesta permite, mediante los balances solución única del sistema (Nissen y col.,elementales, validar calidad de los datos que 1997; Vanrollegem y Heijnen, 1998). Unase obtiene de una fermentación, detectar singularidad típica aparece cuando el ciclo deerrores gruesos de medición y aún los ácidos tricarboxílicos, el ciclo delcorregirlos, además de calcular los datos no glioxalato y la reacción anaplerótica de lamedidos. piruvato carboxilasa se consideran juntas (Stephanopoulos y col., 1998):2. Análisis de flujos metabólicos Ciclo de los ácidos tricarboxílicos: Piruvato → Una vez que la consistencia de los datos 3CO2 + 4NADH + FADH + GTPexperimentales se ha validado y la red dereacciones bioquímicas ha sido determinada, Ciclo del glioxalato: 2Piruvato → 2CO2 +la información se colecta en una matriz Oxalacetato + 4NADH+ FADHestequiométrica (A). Las tasas de reacción, oflujos metabólicos, son calculadas con base Piruvato carboxilasa: Piruvato → + ATP + CO2 Oxalacetatoen una suposición de estadopseudoestacionario para las concentraciones Si ATP y GTP se consideran iguales (lointracelulares de los metabolitos (Vallino y cual se hace frecuentemente en el análisis deStephanopoulos, 1990). Una consecuencia reacciones celulares), es obvio que el cicloimportante de esta suposición es que todos del glioxalato es una combinación lineal delos metabolitos que no se encuentren en una las otras dos vías. Las singularidades sóloramificación de la red metabólica pueden ser pueden ser eliminadas cambiando la redeliminados, dando como resultado que todas metabólica, adicionando o removiendolas reacciones que ocurren entre dos reacciones, sin embargo, esto debe hacersemetabolitos localizados en ramificaciones respetando los principios de la bioquímicapueden representarse con una sola reacción, fundamental (Nissen y col., 1997). Unasin que esto signifique ninguna pérdida de herramienta muy usada, para determinar lainformación Vallino y Stephanopoulos, 1990; presencia o ausencia de reacciones, es laVallino y Stephanopoulos, 1993), con lo que realización de ensayos in vitro de enzimasel modelo se hace más simple y más robusto intracelulares (Nissen y col., 1997;(Vallino y Stephanopoulos, 1990; Schulze, Stephanopoulos y col., 1998).1995). Como entrada para los cálculos se Es importante señalar que cualquierutiliza un conjunto de flujos extracelulares modelo estequiométrico debe sujetarse a unmedidos, típicamente tasas de consumo de análisis de sensibilidad, para lo cual el primersustratos y tasas de secreción de productos indicador es el número de condición (C) de la(Nissen y col., 1997).68
  12. 12. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 matriz estequiométrica (Vallino y se tiene redundancia y la solución es única,Stephanopoulos, 1990), que se calcula de la mientras que si se dispone de menossiguiente manera (Noble y Daniel, 1977): mediciones de las necesarias, se obtiene toda una familia de soluciones (Stephanopoulos yC (A ) = A × A # (21) col., 1998). Si se requiere de una solución en particular, y no es posible medir másDónde: variables para hacer determinado el sistema, la programación lineal combinada con alguna = alguna norma matricial función objetivo, es decir una restricción,A# = pseudoinversa, dada por: puede usarse para obtener una solución deseada (Watson, 1986; Savinell y Palsson, 1992), por ejemplo, maximizar el (A# = AΤA ) −1 AΤ (22) rendimiento de algún componente dado (Fell y Small, 1986; Varma y col., 1993a) oC es un indicador del error numérico que minimizar algún costo (Varma y col., 1993b).puede acumularse al resolver el sistema. Si C Finalmente, con más mediciones de lases del orden de 10k y el vector de residuos es necesarias para tener un sistema determinado,del orden de 10-eudoinversa, dada por: además del cálculo de los flujos metabólicos,j , puede esperarse un vector de errores del la validez del proceso puede serorden de 10k-j cuando se resuelve el sistema rigurosamente comprobada (Stephanopoulos(Schulze, 1995). El análisis de sensibilidad y col., 1998).del vector de flujos calculados (x) con Una vez que se ha determinado que losrespecto al vector de las tasas medidas (r) se datos experimentales cumplenhace calculando la matriz (Vallino y satisfactoriamente con los balancesStephanopoulos, 1990): elementales, se retoma el modelo estequiométrico y se calcula la función índiceδx de consistencia para el modelo = (A Τ A ) A Τ −1 (23) estequiométrico propuesto, hME, para validarδr la suposición de estado pseudoestacionario (Stephanopoulos y col., 1998).Los elementos de la matriz dada por la Ec. 23 Cada una de las reacciones del modelopermiten identificar qué flujos se verán estequiométrico ocurre a una tasa de reacciónafectados por determinadas mediciones. Por desconocida hasta este momento. Para la i-ejemplo, si el ij-ésimo elemento de la matriz ésima reacción, xi representa su tasa dees mayor que 1, quiere decir que el flujo i es reacción (es decir, el flujo). La tasa global departicularmente sensible a errores en la cambio (r), para cada metabolito intracelular,medición de la tasa j (Schulze, 1995), lo que es la suma algebraica de los flujos de lassignifica que habrá que hacer la medición de reacciones en las que interviene multiplicadosla tasa j con extremo cuidado. La por los correspondientes coeficientesdeterminación estequiométrica de los flujos estequiométricos y, por la suposición demetabólicos intracelulares puede basarse en estado pseudoestacionario, es igual a cero. Deigual número de balances de metabolitos, o manera que, para cada metabolito intracelularen un número menor o mayor de tales del caso de estudio, puede escribirse:balances, dependiendo del número demediciones disponibles. En el primer caso no 69
  13. 13. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74 rLactato =x1 - x2 - x4 = 0 (24) rPropionilCoA = x2 - x3 - 3/5x7 = 0 (25) rAcetilCoA = 2/3x5 - x6 - 2/5x7 - x8 - 2/5x18 - 0.164x19 = 0 (26) 2 rNADH=-1/3x +1/3x4+1/3x5-2/5x7-1/2x8-1/3x12+1/3x15+1/5x18-0.2652x19 =0 (27) rPiruvato = x4 - x5 - 3/4x9 - 0.094x19 = 0 (28) rATP = 1/2x6+1/5x7+1/4x8 - 1/4x9 - 1/4x10 - 1/3x12 - 0.9752x19 - x20 = 0 (29) rOxalacetato = x9 - x10 - 4/5x18 - 0.1073x19 = 0 (30) rPEP = 3/4x10 - x11 - 0.039x19 = 0 (31) r3Fosfoglicerato = x11 - x12 - 0.1128x19 = 0 (32) rGlicerahdehido-3-fosfato = x12 - x13 + 3/9x17 - 0.0097x19 = 0 (33) rFructosa6P = x13 - x14 + 3/5x16 + 6/9x17 - 0.0107x19 = 0 (34) rGlucosa6P = x14 - x15 - 0.0308x19 = 0 (35) rRibosa5P = 5/6x15 - x16 - 5/9x17 - 0.1126x19 = 0 (36) rEritrosa4P = 2/5x16 - 4/9x17 - 0.036x19 = 0 (37) r–α-cetoglutarato = x18 - 0.0727x19 = 0 (38)Para el caso de la tasa global de cambio de cada metabolito en la red metabólica propuesta, lasEcs. 24 a 38, se expresan en forma matricial como:  x1     x2   x  0  3  1 −1 0 −1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0     x   0 0 1 −1 0 0 0 −3 / 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0  0  4   0  x5    2 / 3 −1 −2 / 5 −1 −2 / 5 −0.164 0    0 00 0 0 0 −1/ 3 0 1 / 3 0 0 −2 / 5 −1 / 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 −1 / 3 0 0 0 0 0 0 0 0  x  1 / 5 −0.2652 0  6   0  0 0 0 1 −1 0 0 0 −3 / 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 −0.094 0   x7       x   0 0 0 0 0 0 1 / 2 1/ 5 1/ 4 −1/ 4 −1/ 4 0 −1 / 3 0 0 0 0 0 0  −0.9752 −1  8   0  0 0 0 0 0 0 0 0 1 −1 0 0 0 0 0 0 0 −4 / 5 −0.1063 0   x9      0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 / 4 −1 0 0 0 0 0 0 0 −0.039 x   0  10  =  0  (39) x11    0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 −1 0 0 0 0 0 0 −0.1128 0     x   0 −0.0097 0  12   0  0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 −1 0 0 0 3 /9 0   x 13    00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 −1 0 3 /5 6 /9 0 1 −1 0 0 0 0 −0.0107 0   x    0 −0.0308 0  14   0  0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 / 6 −1 −5 / 9 0 −0.1126 0   x 15       x   0 0  0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 / 5 −4 / 9 0 −0.036   0  16   0  0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 −0.0727 0   x 17      0  x 18  x   19     x 20 O bien: (15 metabolitos, 20 reacciones) representa una tasa global de cambio para un metabolitoAx = 0 (40) intracelular, mientras que las columnas contienen los coeficientes estequiométricosQue es la Ec. del modelo estequiométrico. En asociados a los compuestos de cada una delas Ecs. 39 y 40 cada renglón de la matriz A las reacciones que ocurren dentro de la70
  14. 14. O. Soto-Cruz y J. Páez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniería Química Vol. 4 (2005) 59-74célula. Este sistema lineal es utilizado para donde las tasas ri corresponden a los flujosvalidar la suposición de estado extracelulares medidos, lo cual puedepseudoestacionario y, posteriormente para la deducirse de la Fig. 1. Por lo tanto, el vectordeterminación de flujos metabólicos, de xc contiene los restantes flujos metabólicosacuerdo a la metodología detallada a desconocidos. La matriz Am contiene lascontinuación. La matriz A es equivalente a la columnas 1, 3, 6, 7, 8 y 19 de la matriz A,matriz E, utilizada en el modelo de caja que corresponden a los flujos medidos,negra, por lo que puede ser separada en dos mientras que la matriz Ac contiene lasmatrices Am y Ac que contengan los restantes columnas de la matriz A. Una vezcoeficientes estequiométricos validada la suposición de estadocorrespondientes a las tasas de reacción pseudoestacionario, las Ecs. 13 y 19 podríanmedidas y no medidas, respectivamente. De utilizarse para calcular los flujos metabólicosmanera similar, el vector x (vector de flujos desconocidos, es decir, los elementos deldesconocidos de las reacciones = [x1, x2, vector xc (Stephanopoulos y col., 1998). Sin.x20]T) puede separarse en dos vectores xm y embargo, un método diferente descrito porxc que contengan las tasas de reacción Tsai y Lee (1988), proporciona los mejoresmedidas y no medidas, respectivamente. Así, estimados para los flujos metabólicosla Ec. 40 puede escribirse como: medidos y no medidos. En este método la Ec. 40 se reformula para expresarse como:Am xm + Ac xc = 0 (41) xm   1 0  x m  (43)Ya que se tienen 20 flujos intracelulares   0 =  A   = Tx    m A c  x c   desconocidos y 15 balances estequiométricos,los grados de libertad del sistema son 5, esdecir, se requiere medir al menos 5 flujos donde I es la matriz identidad de dimensiónpara poder resolver el sistema. Sin embargo, igual al número de flujos medidos (en caso deya que se midieron 6 flujos, el sistema es estudio, de 6X6). En la matriz A las columnassobredeterminado. Por la similitud de la se intercambian para que al principio sematriz A con la matriz E, las ecuaciones 14 a tengan juntas las columnas que corresponden18 se utilizan para calcular la función h, a las reacciones cuyos flujos son medidos,usando xm, Am y Ac en lugar de rm, Em y Ec, mientras que otro tanto se hace con el vectorpara el modelo estequiométrico, con lo que se x. El primer renglón de la Ec. 43puede validar la suposición de estado simplemente establece que xm es igual a xm,pseudoestacionario (van der Heijden y col., mientras que el segundo renglón es idéntico1994a, van der Heijden y col 1994b, van der con la Ec. 41. La Ec. 43 se escribe, para elHeijden y col., 1994c). Para el caso de caso de estudio, de manera extendida comoestudio, el vector xm está dado por: se muestra Ec. 44: Para mayor claridad, en la Ec. 44 las líneas x1   rLactato  separan a cada una de las matrices y vectores    que componen el sistema. Las Ecs. 43 y 44 x3   rPr opionato  introducen una separación estricta entre losx   r  vectores de flujos medidos y no medidos. 6  =  Acetato  Para resolver el sistema, se debe hacer una x7   rValerato  (42) partición diferente de la matriz T, que sex   r  muestra Ec. 45 8   Butirato x   r  19   Biomasa  71

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