1. 中国药科大学
本 科 毕 业 论 文
论文题目 秋水仙碱缓释微丸大鼠药代
动力学检测方法探究
英文题目 The detection method for Pharmacokinetics of colchicine
sustained-release micro pellet on rats
专 业 药物制剂
院 部 药学院
学 号 1041818
姓 名 张鹏飞
指导教师 郑稳生
课 题

2. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
完成场所 中国医学科学院药物研究所
论文工作时间：2014 年 2 月 至 2014 年 6 月
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3. 秋水仙碱缓释微丸大鼠药代动力学检测方法探究
目录
摘要………………………………………………………………………1
前言………………………………………………………………………3
第1章 秋水仙碱药代动力学 HPLC 检测方法的建立和验证…………
5
1.1 试药与仪器…………………………………………………………5
1.2 实验基本操作步骤…………………………………………………5
1.3 HPLC 条件筛选………………………………………………………6
1.4 HPLC 方法学验证……………………………………………………9
第二章 秋水仙碱药代动力学检测……………………………………14
2.1 大鼠给药方法探究…………………………………………………14
2.2 大鼠给药剂量和取样方案…………………………………………14
2.3 实际给药后血药浓度测定…………………………………………15
第三章 结论……………………………………………………………17
参考文献…………………………………………………………………18
致谢………………………………………………………………………20

4. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
秋水仙碱缓释微丸大鼠药代动力学检测方法探究
1041818 张鹏飞
摘要：
目的：本研究尝试建立 HPLC 的方法对灌胃给予秋水仙碱缓释微丸的大鼠的体内血液药
物浓度进行检测。
方法：（1）秋水仙碱缓释微丸采用流化床底喷法制备（2）血浆样品制备：用玻璃毛细
管大鼠眼眶取血 5 滴，4500r 室温离心 10min，即可分离出 50ul 血浆。得到的血浆加入
0.3ml 乙酸乙酯，手摇震荡 20min，3000r 室温离心 10min，取上层有机层 0.2ml，室温
氮吹干，残留物加入 1ml 溶剂即为样品。萃取回收率为：30.5%，rsd：4.8%（3）微丸
给药方法：暂定套管针填塞（4）药代动力学研究 HPLC 条件：色谱柱: Kromasil 100-
5C18（250x4.6mm E59392）柱；流动相: 45％甲醇＋55%水；流速:1 mL／min； 柱
温:20 ℃； 进样量:100µL ；检测波长：254nm；溶剂：10%甲醇＋90%水。线性范围
10ng／ml～1ug／ml，y = 14954x - 1811.8,R² = 0.99999；检测限：1ng；定量限：
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5. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
5ng ； 加 样 回 收 率 ： 80% 组 ： 100.2% ； 100% 组 ： 98.7% ； 120% 组 ： 98.1% ；
rsd:1.09%。
结果：我所建立的 HPLC 方法理论上可用于大剂量给药后大鼠体内药代动力学检测，但
由于时间关系还没有通过实际实验来验证。
关键词：秋水仙碱；缓释微丸；药代动力学；HPLC
The detection method for Pharmacokinetics of colchicine
sustained-release micro pellet on rats
1041818 Pengfei Zhang
Abstract：
Purpose：This research try to build a HPLC method to detect and measure colchicine in the
blood of rats which is given orally with colchicine micro pellet.
5

6. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
Method: (1)The colchicine mirco pellet is made by fluidized bed. (2)The preparation of blood
sample:Take 5 drops blood from the rim of rat’s eye, centrifuge (4500R，10min), separate 50ul
upper liquid, add 0.3ml ethyl acetate, shake with
hand(20min) ， centrifuge （ 3000R ， 10min ） ， separate 0.2ml upper liquid ， blow with
nitrogen，add 1ml solution in reminder. Recovery of extraction: 30.5%，rsd：4.8% (3)The
method for giving micro pellet to rats: we temporarlly decide to use the drivepipe to tamp.
(4)The condition of HPLC: Chromatographic column: Kromasil 100-5C18 （ 250x4.6mm
E59392 ） ; Flow part: 45 ％ methanol ＋ 55%H2O; Flow rate:1mL ／ min; Temperture of
column:20°C; Volum of sample:100ul; Wavelength of detect:254nm; solution: 10％methanol＋
90%H2O; Linear scale: 10ng／ml～1ug／ml，y = 14954x - 1811.8,R² = 0.99999; Limit of
detect: 1ng; Limit of measure:5ng; recovery test(add sample): 80%group ： 100.2% ；
100%group：98.7%；120%group：98.1%；rsd:1.09%.
Result: This method theoretically can be used in detection and mesurement for the blood of rats
given orally with big dose colchicine(, although I can not provide some experiment date to
verify it since the time of my internship is limited.
Keywords：colchicine；micro pllet；pharmacokinetics；HPLC
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7. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
前言
秋水仙碱是从百合科秋水仙的球茎和种子中提取的一种生物碱。秋水仙碱与中性粒细
胞微管蛋白的亚单位结合而改变中性粒细胞的趋化、粘附和吞噬作用、抑制磷脂酶 A2，减
少前列腺素和白三烯的释放，同时抑制局部细胞产生白介素－6 等，从而达到控制关节
局部疼痛、肿胀及炎症反应，因此其也广泛被使用在缓解痛风症状上。
痛风是长期嘌呤代谢紊乱和（或）尿酸排泄减少所引起的一组异质性，代谢性疾病。
痛风的临床特点为高尿酸血症、反复发作的急性关节炎、痛风石性慢性关节炎和关节畸
形，累及肾脏引起慢性间质性肾炎和肾结石等。其中尿酸炎结晶通过刺激炎性介质的合成
和释放维持强烈的炎性反应。尿酸炎结晶通过以下两种机制发挥作用（1）传统途径：尿
酸炎结晶作为调理素和吞噬颗粒诱发吞噬细胞一系列吞噬反应溶酶体溶解、呼吸爆发和炎
性介质释放（2）特异途径：尿酸炎结晶通过膜插入和膜糖化蛋白交联与脂质膜和蛋白
直接作用，激活 G 蛋白、磷脂酶 C 和 D 信号通路，进而诱导单核细胞白细胞介素（IL-
8） 的表达。秋水仙碱就是通过改变内皮细胞整合素数目和分配以及改变中性粒细胞对
IL-1 或肿瘤坏死因子的反应起到抗炎作用。
口服缓控释制剂的研究已成为国内外医药工业的一个重要研究方向，近年来，由于
许多新型辅料的开发与生产，缓释微丸胶囊在缓控释领域显示了独特的优越性：（1）
微丸受消化道输送食物和胃排空作用的影响较小；（2）微丸剂型由较多的小丸组成，
个别制备的失误对整体的载药性质影响较小，其释药的一致性也由于普通薄膜包衣片
剂；（3）微丸进入体内后即可分散开，可以减少局部的刺激性；（4）微丸剂型的可调
节性较高，可混合不同释放速度的微丸调节整体的释放速度，也可混合包裹不同药物的
微丸，达到协同效果。鉴于缓释微丸胶囊剂型具有诸多优势，再加上考虑到秋水仙碱既可
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8. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
以对痛风所造成的急性炎症疼痛症状起到很好的缓解作用，也可以少量服用起到预防发
作的作用，现有的普通片剂针对急性症状效果较好，但对于预防来说需要多次服用，并
不方便。因此本实验组将其制成缓释微丸胶囊剂，消除突释，延长药物释放，使患者服用
的周期得以延长。
在查阅了相关文献后，发现基本都是用 LC-MS 来检测人血浆中的秋水仙碱含量
的，较少有用 HPLC 来检测的，而且较少用 HPLC 来检测的，实验动物也是犬。本实验
希望可以先不用 LC-MS，而试着建立 HPLC 的方法来检测大鼠体内秋水仙碱含量。
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9. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
第一章 秋水仙碱药代动力学 HPLC 检测方法的建立及验证
本章根据秋水仙碱本身的性质、剂型和工艺的要求，应用 HPLC 建立了秋水仙碱药代动力学的检测
方法，并进行了方法学验证。
1.1 试药与仪器
（1） 乙酸铵：国药集团化学试剂有限公司，分析纯，500g，20130122
（2） 乙酸乙酯：北京益利精细化学品有限公司，分析纯，500ml
（3） 氯化钾：天津市光复科技发展有限公司，500g，20091112
（4） 硼酸：北京益利精细化工有限公司，分析纯，500g
（5） 甲酸：西陇化工股份有限公司，分析纯，500ml，1206181
（6） 甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC 级，4L
（7） 秋水仙碱原料药 1：武汉神曲生物化工（正文未提几号标准品，则默认为 1）
（8） 秋水仙碱原料药 2：中检所购买
（9） HPLC 仪器：Hitachi 高效液相色谱仪
（10） 离心机：SIGMA 1-14ED
1.2 实验常用操作步骤
1.2.1 常用溶液配置
（1）进样溶剂：V 甲醇－V 水（10:90）。
（2）秋水仙碱标准溶液：
1mg／ml：取秋水仙碱标准品 0.05g，用进样溶剂定容至 50ml。
1ug／ml：取 1mg／ml 秋水仙碱标准溶液 50ul，用进样溶剂定容至 50ml。
1ng／ml：取 1ug／ml 秋水仙碱标准溶液 50ul，用进样溶剂定容至 50ml。
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10. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
（3）秋水仙碱大鼠灌胃溶液：将定容用的进样溶剂换成纯净水，其余同操作（2）
（4）硼酸盐缓冲液：取硼酸 3.00g，加 0.1mol/L 氯化钾溶液 500ml 使溶解，再加
0.1mol／L 氢氧化钠溶液适量（大约 200ml），调节 PH 至 9.2。
（5）肝素钠溶液：150u／ml：取 150u／mg 的肝素钠粉末 0.01g，用注射用生理盐水
定
容至 10ml。（使用比例：5ul 抗凝毛细玻璃管眼眶取出的 1 滴血）
1.2.2 大鼠取血方法
采用大鼠眼眶取血方法，每个时间点取 5 滴血。
1.2.3 大鼠全血处理方法
5 滴全血→缓慢摇动使之与肝素钠抗凝剂混合均匀→4500r 离心 10min→取上层淡黄色澄
清血浆 50ul→加入乙酸乙酯 300ul 提取→涡旋混合 2min, 3000r／min 离心 10min（若出
现严重乳化现象，则 12000 转离心 10min）→取有机层（上层）200ul 转移至另一试管中
→置于室温下氮气吹干→残留物用 1mL 进样溶剂溶解。
1.3 HPLC 条件筛选
1.3.1 参考资料中 HPLC 的条件
（1）中国药典 2010 年版第二部：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇－水
（40:60）
为流动相；检测波长为 254nm。理论塔板数按秋水仙碱峰计算不低于 5000。
（2）杭州师范大学药理教研室：以 ZORBAX Extend－C18 为色谱柱；流动相为甲醇－
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11. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
10mmol/L 乙酸铵，流速为 1.1ml/min。
（3）复旦大学上海医学院法医系：以 ZORBAX SB－C18 为色谱柱；流动相为 V 甲醇
－V
（20mM 乙酸铵和 0.1%甲酸缓冲液）（80:20），流速为 0.2ml/min。
1.3.2 本实验组的筛选过程
（1）条件一：在参考完文献后，最初决定使用流动相为 V 甲醇－V（20mM 乙酸铵和
0.1%
甲酸缓冲液）（80:20）。在秋水仙碱样品溶剂也为流动相，流速为 0.2ml／min，
进样量为 5ul 和 20ul 的条件下，秋水仙碱标准品 1 出现了双峰现象，且基线不稳，
怀疑可能为配置时引入了相关杂质或是原料本身原因。（见表 1 和图 1）
条件一的数据统计表
项目 浓度 进样量 流速/min 检测波长 现象
秋 1 1ug/ml 5ul 0.2ml 254
双峰现象秋 1 1ug/ml 20ul 0.2ml 254
秋 1 1ng/ml 5ul 0.2ml 254
秋 1 1ng/ml 20ul 0.2ml 254
秋 2 10ug/ml 5ul 0.2ml 254 峰形良好
表 1
双峰现象图
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12. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
分钟
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
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0
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mAU
- 2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 3 - 2 5 1 5 : 5 2 : 0 0
图 1
（2）条件二：用前一天的秋水仙碱样品和新配的 1 号秋水仙碱样品比较，看是否为配制
问题，发现新配的就没有双峰现象出现，确实是配制过程中出现的问题。在换用秋水
仙碱标准品 2 相同条件下进样后发现出峰良好，但基线依旧不稳定，噪音很大。（见
表 2 和图 2）
条件二数据统计表
表 2
新配秋水仙碱 1 号原料色谱图
项目 浓度 进样量 流速/min 检测波长 峰面积
秋 1 1ug/ml 5ul 0.2ml 254 双峰现象
秋 1 1ug/ml 5ul 0.2ml 254
秋 1（新
配）
10ug/ml 5ul 0.2ml 254 4647204
秋 1（新
配）
10ug/ml 5ul 0.2ml 254 5003572
秋 1（新
配）
1ug/ml 5ul 0.2ml 254 654131
秋 1（新
配）
1ug/ml 5ul 0.2ml 254 600474
秋 2 10ug/ml 5ul 0.2ml 254 2008479
秋 2 10ug/ml 5ul 0.2ml 254 没有跑完
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13. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
分钟
- 2 - 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
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0
2
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6
8
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18
20
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0
2
4
6
8
10
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14
16
18
20
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 3 - 2 6 1 5 : 4 5 : 4 5
名称
图 2
（3）条件三：由于基线始终不稳定，怀疑可能是流动相不均匀，决定简化流动相用比较
常用的 V 甲醇－V 水（40:60），流速也调成 1ml／min，溶剂调成 V 甲醇－V 水
（10:90），
进样量依旧为 5ul 和 20ul。实验数据（见表 3 和图 3）上看秋水仙碱没有出峰只能有
一个原因那就是色谱保留时间过长，流动相洗脱能力较差（极性较强），因为
1mg/ml
的样品中必然含有可检出的秋水仙碱量。所以我加大了流动相甲醇的比例（减弱极
性），分别调整为 50%的甲醇和 55%的甲醇进 1mg/ml 的秋水仙碱样品，结果为
50%的
甲醇的 12.8min 出峰，55%的甲醇 7.5min 出峰。所以选用 50％的甲醇作流动相更为
合适。
条件二数据统计表
项目 浓度 进样量 流速／min 现象
秋 1 1ug /ml 5ul 1ml 有溶剂峰，无秋
水仙碱峰，开始
设定时间为
20min，后面进
1mg/ml 的延长
秋 1 1ug /ml 20ul 1ml
秋 1 10ug /ml 5ul 1ml
秋 1 10ug /ml 20ul 1ml
秋 1 1mg /ml 5ul 1ml
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14. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
到 35min 也无。秋 1 1mg /ml 20ul 1ml
表 3
35min 内未能检出药物图谱
分钟
- 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
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0
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mAU
0
2
4
6
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12
14
16
18
20
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 3 - 2 7 1 1 : 5 9 : 0 6
名称
图 3
(4)条件四：采用 V 甲醇－V 水（50:50）为流动相的条件下，虽然方法学验证过程比较
顺
利，但采用含药血浆样品进行摸索后，发现在空白样品中 11min～12min 有个未知杂
峰，
这个杂峰在给药样品中不能很好的与秋水仙碱的峰分开。在长时间清洗色谱柱和系统
后，进行了一次专属性实验，最终确定了这个杂峰就是血浆中的，而非色谱残留。（见
图 4）
条件四专属性图（由上至下依次为：给药组，空白组，对照组，溶剂组）
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15. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
分钟
- 2 - 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
mAU
7. 0
7. 5
8. 0
8. 5
9. 0
9. 5
10. 0
10. 5
11. 0
11. 5
12. 0
12. 5
13. 0
13. 5
14. 0
14. 5
15. 0
15. 5
mAU
7. 0
7. 5
8. 0
8. 5
9. 0
9. 5
10. 0
10. 5
11. 0
11. 5
12. 0
12. 5
13. 0
13. 5
14. 0
14. 5
15. 0
15. 5
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4 - 1 7 1 7 : 3 5 : 26
名称
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4 - 1 7 1 7 : 5 7 : 3 5
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4 - 1 7 2 0: 0 7 : 3 3
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4- 1 8 0 : 2 7 : 2 3
图 4
（5）条件五：鉴于条件四存在的不足，因此决定减小流动相极性，延长分离时间，将
流
动相调整为 V 甲醇－V 水（45:55），其余不变，在这个条件下秋水仙碱已可以和
前
述杂峰分开，但就是洗脱持续时间稍长，秋水仙碱出峰时间大约在 26min 左
右，30min
可以全部出峰。（见图 5）考虑到实习时间有限，在这里就暂且采用这种条件。
条件五图谱
15

16. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
分钟
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
mAU
6. 25
6. 50
6. 75
7. 00
7. 25
7. 50
7. 75
8. 00
8. 25
8. 50
8. 75
9. 00
9. 25
9. 50
9. 75
10. 00
mAU
6. 25
6. 50
6. 75
7. 00
7. 25
7. 50
7. 75
8. 00
8. 25
8. 50
8. 75
9. 00
9. 25
9. 50
9. 75
10. 00
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4 - 23 2 3 : 1 4 : 45
名称
图 5
1.3.3 最终 HPLC 条件
固定相：Kromasil 100-5C18（250x4.6mm E59392）
流动相：V 甲醇－V 水（45:55）
流速：1ml/min
柱温:20 ℃
进样量：100ul
紫外检测波长：254nm
1.4 HPLC 方法学验证
1.4.1 专属性
空白组：大鼠眼眶取完血，按照 2.3 方法处理后，通过滤头过滤即为样品。
对照组：取 1ug／ml 的秋水仙碱标准溶液 100ul，再加入 900ul 的进样溶剂，通过滤头
过
滤即为样品。
给药组：按照 2.3 方法进行操作，在第一次离心后的 50ul 血浆中加入 1ug／ml 的秋水仙
碱标准溶液 100ul，其余不变，通过滤头过滤即为样品。
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17. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
专属性验证图谱（由上至下依次为：给药组，空白组，对照组，溶剂组）
分钟
- 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
mAU
7. 0
7. 5
8. 0
8. 5
9. 0
9. 5
10. 0
10. 5
11. 0
11. 5
12. 0
12. 5
13. 0
13. 5
14. 0
14. 5
mAU
7. 0
7. 5
8. 0
8. 5
9. 0
9. 5
10. 0
10. 5
11. 0
11. 5
12. 0
12. 5
13. 0
13. 5
14. 0
14. 5
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4 - 23 1 6 : 5 8 : 3 0
名称
DAD- CH1 2 5 4 nm
2 01 4 - 4 - 2 3 2 1 : 51 : 1 2
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 01 4 - 4 - 2 3 1 7 : 4 0 : 4 1
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 01 4 - 4- 2 4 4 : 4 8 : 4 9
图 6
结果：由图片可以看出，秋水仙碱出峰良好，不受处理后血浆影响，专属性良好。
1.4.2 线性
用之前配好的秋水仙碱标准溶液（见 1.2.1（2）），按比例与纯净水配制成 1ug／
ml、0.5ug／ml、0.1ug／ml、0.05ug／ml、0.01ug／ml 的五个样品。见表 4 图 7
线性验证数据统计表
项目 保留时间 峰面积
秋水仙碱 1ug／ml 29.880 1481268
秋水仙碱 1ug／ml 29.927 1504086
秋水仙碱 0.5ug／ml 29.347 747412
秋水仙碱 0.5ug／ml 29.167 748644
秋水仙碱 0.1ug／ml 28.707 150832
秋水仙碱 0.1ug／ml 28.567 143935
秋水仙碱 0.05ug／ml 28.193 70566
秋水仙碱 0.05ug／ml 28.187 69579
秋水仙碱 0.01ug／ml 27.327 16302
秋水仙碱 0.01ug／ml 27.633 13983
表 4
线性分析图（纵坐标：每一浓度峰面积的平均值，横坐标：取浓度和进样量的乘积）
17

18. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
图 7
结果：由图可知 R^2>0.999，所以线性满足要求。
1.4.3 检测限和定量限
根据之前线性的图谱可以大体看出检测限和定量限。（具体药物峰与噪音峰见图 8）
0.05、0.01ug／ml 秋水仙碱样品色谱图 （由上至下依次为 0.05、0.01ug／ml）
分钟
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
mAU
8. 3
8. 4
8. 5
8. 6
8. 7
8. 8
8. 9
9. 0
9. 1
9. 2
9. 3
mAU
8. 3
8. 4
8. 5
8. 6
8. 7
8. 8
8. 9
9. 0
9. 1
9. 2
9. 3
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4 - 2 3 3 : 3 6 : 4 6
名称
DAD- CH1 2 5 4 n m
2 0 1 4 - 4 - 2 3 6 : 2 4 : 0 2
图 8
18

19. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
结果：检测限为 1ng，定量限为 5ng（进样量为 100ul 的情况下）
1.4.4 加样回收率
考虑到加药经过萃取后损耗比较严重，血浆基质中的药物量并不能很好的确定，所以决
定采用加样回收率法测定。（C－A）／B（C：实测值，A：基质中的含药量，B：对照
品量）（数据见表 5）
基质：血浆 50ul＋1ug／ml 秋水仙碱标准品 100ul＋乙酸乙酯 0.3ml手摇混合均匀
20min3000r 离心 10min（效果不好则振瑶再次离心）取上层有机层室温下氮
吹
干残留物则为基质
基质组：基质＋甲醇水（1:9）1ml
对照组：1ug／ml 秋水仙碱标准品 100ul＋甲醇水（1:9）900ul
加样组：基质＋1ug／ml 秋水仙碱标准品 80ul／100ul／120ul＋甲醇水（1:9）920ul
／900ul／880ul
加样回收率数据统计表
项目 保留时间 峰面积 面积平均值 加样回收率
对照组 1 27.473 181639 160296
对照组 2 27.187 138952
基质组 1 23.360 40528 34893
基质组 2 22.030 29257
80%加样组 1 26.573 166025
163323 100.2%80%加样组 2 25.920 162004
80%加样组 3 26.313 161940
100%加样组 1 26.140 191322
193046 98.7%100%加样组 2 25.960 193734
100%加样组 3 25.793 194083
120%加样组 1 25.627 223495
19

20. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
223631 98.1%120%加样组 2 25.373 223734
120%加样组 3 25.253 223666
表 5
结果：由以上数据可算得，三个回收率均在 98%－102％之间，回收率较高，三个回收
率的 rsd 为 1.09%<2%。
1.4.5 萃取回收率
由于在血浆处理步骤中得乙酸乙酯萃取会造成药物损耗，有必要知道处理完后药物含量
与加药量得关系，便于以后由测量值计算真实血药浓度，所以需要做一下萃取回收率。
（数据见表 6）
对照组：1ug／ml 秋水仙碱标准溶液 100ul＋甲醇水溶液（1：9）900ul
处理平行样品 5 份：血浆 50ul＋1ug／ml 秋水仙碱标准品 100ul＋乙酸乙酯 0.3ml手摇
混合均匀 20min3000r 离心 10min（效果不好则振瑶再次离心）
取上层有机层室温下氮吹干残留物加 1ml 甲醇水溶液（1：9）溶解
萃取回收率数据统计表
项目 保留时间 峰面积 平均值 回收率
对照 28.027 303037 301134
对照 28.380 299230
萃取样品 1 27.960 93697 93057 30.9％
萃取样品 1 26.720 92416
萃取样品 2 26.733 92415 91831 30.5％
萃取样品 2 27.373 91247
萃取样品 3 26.420 93752 93166 30.9％
萃取样品 3 26.433 92580
萃取样品 4 26.933 98062 97112 32.2％
萃取样品 4 26.700 96161
萃取样品 5 26.373 84545 84726 28.2％
萃取样品 5 26.233 84906
表 6
20

21. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
结果：Rsd＝4.8%，平均萃取回收率为 30.5%
1.4.6 药物稳定性
（1）药物在进样溶剂中得稳定性。取 1ug／ml 得秋水仙碱标准溶液 1ml 作为样品。进样
测定药物浓度，置于 4 度下间隔 24 小时再次进样测定。（数据见表 7）
药物溶剂稳定性数据统计表
项目 保留时间 峰面积
新配制样品 27.473 1463476
新配制样品 27.107 1464377
24 小时后样品 28.700 1435215
24 小时后样品 28.680 1437017
表 7
结果：24 小时内药物量在溶剂中下降了 1.9%，所以药物在溶剂内基本稳定。
（2）药物在血浆中得稳定性。平行配置两份，一份取 1ug／ml 得秋水仙碱大鼠灌胃溶液
200ul 加入 50ul 血浆中，混合均匀，按照 2.3 得操作继续处理，进样测定药物浓
度。
另一份取 1ug／ml 得秋水仙碱大鼠灌胃溶液 200ul 加入 50ul 血浆中，混合均匀，
置
于 4 度下间隔 24 小时，再按照 2.3 得操作继续处理，进样测定药物浓度。（数据见
表 8）
药物血浆稳定性数据统计表
项目 保留时间 峰面积
新配制样品 28.940 105699
新配制样品 28.707 107879
24 小时后样品 28.487 98484
24 小时后样品 28.000 97424
表 8
21

22. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
结果：24 小时内药物量在血浆中下降了 8.3%，所以药物在血浆中稳定性并不是太好，
所
以血液取出后应该及时处理，冷冻保存。
22

23. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
第二章 秋水仙碱药代动力学检测
2.1 大鼠给药方法探究
大鼠口服给药一般采用灌胃针给予药物溶液，而秋水仙碱缓释微丸为固体颗粒，且为
了考察其大鼠体内的缓释效应，不能将其溶解了给药，因此怎样很好的将微丸定量的给
予大鼠是个很实际的问题，如果不能很好的解决，那么之后的实验将很难继续下去。
2.1.1 混入食物给药
大体方案：先将大鼠禁食 24 小时，使其饥饿，然后将混有微丸的食物给予大鼠。
个人看法：此方法虽然较好操作，但大鼠在进食是有一个时间段的，并不是瞬间摄入，
所
以对之后的取血时间点设定有很大影响。而且此方法平行性较差，一组老鼠中，
每只进食的量和速度都不同。因此此方法不能采用。
2.1.2 凝胶混悬灌胃
大体方案：先用淀粉或泊洛沙姆 188 等可食用且 LD50 较高的高分子辅料与水混合制成
凝
胶基质，再向其中混入微丸颗粒，使颗粒分散均匀，再取一定量通过灌胃针灌
胃给药。
个人看法：此方法在凝胶的处方摸索上，可能比较费时，须要制成的凝胶流动性和悬浮
性
都较好的，且无毒可食用。在通过多次尝试后发现，此方法的瓶颈并不在处方
23

24. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
上，而在于如何解决灌胃针内径较细，给药时时常发生堵塞的问题。此方法如
果可以解决灌胃使针管的堵塞问题，那将是个可取的方法。
2.1.3 套管针填塞
大体方案：采用临床上用于穿刺的套管针，将内针针头打磨圆润，或换相等粗细的柱状
物，
给药时，现在套管内填入药物，塞入大鼠食道，用内针将填入的药物推入大鼠
胃部，之后在给予适量水。
个人看法：此方法可以很好的满足给药的要求，但不足的是给药过程较为麻烦，因为套
管
针较粗，可能大鼠挣扎的会比较剧烈，且若不慎灌入气管，很可能致大鼠死亡。
2.2 大鼠给药剂量和取样方案
2.2.1 大鼠给药剂量
人的预防给药量为 0.5～1mg/天（参考：云南植物药业有限公司生产的秋水仙碱片
（H53020166），按 1mg/天计算。人的体重按照 70kg 计算，则单位体重给药量为
0.014mg/kg*天。大鼠的给药量为 6.3*0.014=0.0882mg/kg*天（参考动物给药表面积折算
法）。大鼠体重按照 200g 计算则给药量应为 0.0882*0.2=0.01764mg。考虑到在摸索阶
段，打算将给药量放大 2～3 倍，所以计划每只 200g 大鼠给药 0.05mg。配制 50ug/ml 的
秋水仙碱溶液（溶剂为纯净水），灌胃 1ml。
2.2.2 取样方案
考虑到是秋水仙碱标准溶液（速释），时间跨度适当缩短，取 9 个点（具体见表
24

25. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
9），每个点取 5 滴血。实际操作后验证了在这个取血方案下，大鼠并不会因为失血过多
而死亡，但在多次取血后有明显的虚弱现象，活动减少，反抗减少。
取样时间点分布表
时间点 0min 5min 10min 15min 30min 1h 2h 4h 6h 9h
表 9
2.3 实际给药后血药浓度测定
2.3.1 初次给药尝试
由于目前还未很好的解决微丸灌胃的问题，而且对于建立的 HPLC 方法能否很好的
用于实际给药后样品的检测也不明确。因此先直接灌胃秋水仙碱溶液来，观察给药量大体
为多少的时候，血药浓度可以达到定量限。
实验步骤：由于处于条件摸索阶段，先采用 1 只大鼠实验。通过普通灌胃方法，按照
2.2.1
的方案灌胃给药 50ug/ml 的秋水仙碱大鼠灌胃溶液 1ml，按照 2.2.2 所设计的
时间点进行取血，然后按照 1.2.3 的大鼠全血处理方法及时处理每个时间点的
血样，最后使用 1.3.3 的 HPLC 条件来进行检测。
数据记录：
初次给药取血时间点记录表
时间点 0min 5min 10min 15min 30min 1h 2h 4h 6h 9h
记录 10:26 10:31 10:36 10:42 10:56 11:26 12:30 14:30 14:29 19:31
表 10
所有时间点都没有检出药物峰。
讨论：初次给药实验结果很失败，所有时间点均未检出秋水仙碱均未出峰。
现怀疑以下几点原因：
25

26. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
（1）灌胃失败。（这个理由应该不正确，因为灌入后，未见到大鼠吐出液体）
（2）处理步骤损耗严重，且 HPLC 本申的检测限就不是很低，样品中秋水仙含量
不足
以达到 HPLC 的检测限。（下次实验打算提高给药量）
（3）药物分布问题，因为采用眼眶取血，不知道是否有影响。（眼眶取血很成熟，
应该不是这方面的问题）
2.3.2 第二次给药尝试
经过排除一些不太可能的原因后，最终我认为失败的原因还是样品中的秋水仙碱含
量不足以达到我所建立的 HPLC 方法的检测限。为了验证我的猜想，计划将给药量提高至
初次给药实验的 10 倍，即口服给药 500ug。（经查阅相关资料，大鼠的 LD50 为静脉
1.6mg／kg，折算为 200g 的大鼠静脉注射 320ug）另外由于本次实验并不在于做完整的
给药实验，只是为了看能否检出药物，所以取血只取到两小时。
实验步骤：将给药量换成灌胃给于 0.5mg/ml 秋水仙碱大鼠灌胃溶液 1ml，取样时间跨度
缩短，其余和 2.3.1 中的操作步骤一样。
数据记录：
第二次给药取血时间点记录表
设计时间 0min 5min 10min 15min 30min 1h 2h
实测时间 14:20 14:28 14:34 14:43 14:59 15:31 16:35
表 11
第二次给药血药浓度数据统计表
项目 保留时间 峰面积 血浆药物浓度
26

27. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
5min 28.320 44442 29.8ng/ml
5min 27.067 41056
10min 25.053 28992 20.7ng/ml
10min 27.253 29390
备注：HPLC 的检测数据依旧不理想，只有前两个时间点检出药物。
表 12
讨论：由于定量限为 50ng／ml，而得到的数据显示血药浓度都未达到定量限，所以这个
给药剂量似乎还不能达不到我的检测要求。但由于我用的大鼠只有一只，样本量很
小，具有很大的特殊性，所以这个数据只能作为参考。
第三章 结论
本 HPLC 方法可以用于检测大鼠口服给予高浓度的秋水仙碱溶液后的血药浓度。虽然
从这个实验的数据中可以看出，即使给予人预防剂量的 20 倍的药物量，我所建立的
HPLC 依旧只能检出样品。但考虑到大鼠的秋水仙碱 LD50 为静脉 1.6mg／kg，折算为
200g 的大鼠静脉注射 320ug，大鼠的全血大概为 16ml，即血液内的秋水仙碱浓度 20ug
27

28. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
／ml 时会导致死亡。与此相比我本次实验口服给予了大鼠 500ug 的秋水仙碱，但血液内
的浓度还远未达到 LD50。所以如果我将给药的浓度在适当提高，应该是可以很好的测定
出药物在大鼠体内各时间段的药物浓度。鉴于实习的时间有限，没能再此提高浓度，进行
实验。
本 HPLC 方法对于缓释微丸的检测理论上是可行的，经过我的测算，如果采用套管针
填塞法给药，那么大体可以给予大鼠 1ml 体积左右的微丸颗粒，而 1ml 左右的微丸颗粒
重量为 1g 左右，大约秋水仙碱缓释微丸中秋水仙碱质量分数为 0.5%，即每 1g 微丸含
5mg。这个给药量比我第二次给药尝试中的 500ug 扩大了 10 倍。从数据上来看，HPLC
方法对于检出给予微丸的大鼠体内的药物还是完全可以的，但考虑到缓释微丸的释药速
度较慢，且生物利用度与直接给予溶液相比如何还不清楚，可能若想很好的做出药时曲
线还应使用液质联用较为合适。
28

29. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
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究，2010，
18（3）
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31. 中国药科大学本科生毕业论文（设计）
致谢
本论文是在众老师和同学的指导与帮助下完成的，在此谨向所有帮助和支持本论文
工作的老师和同学表示衷心的感谢。
首先要感谢我的实习导师郑稳生老师，郑老师在专业方面渊博的知识以及对于实验
工作严谨务实的态度都使我收益匪浅。从我未来药物所实习时，便积极的和我进行沟通，
让我倍感亲切。在我来所实习期间，认真的督促和提醒我实验工作的进展也使我养成了不
浪费时间并且认真记录每天实验的良好习惯。在我遇到问题时，郑老师也能很好给我提出
一些他的看法，及时的给我启发。
本论文的完成也离不开药物所其他的一些老师和同学的帮助。在此感谢张宇佳老师，
王璐璐老师，方夏琴老师和乔培香老师在我实验工作期间给予我的指导，尤其是方夏琴
老师，对于我实验的每一步进展和遇到的问题都给予了我很大的帮助。感谢张秀立师兄，
陈少华师兄和相莉师姐对我在药物所实习期间生活上的关心和学业方面的指导。
虽然本论文的完成是在中国医学科学院药物研究所，但我仍旧要感谢曾经教导过我
的母校中国药科大学，没有药大众位老师给我的教诲，我不会有机会来药物所实习。
最后感谢带给我这一切的父母，是他们给我经济上的支持，每当我遇到挫折时给予
我心灵上的安慰。
31