1.
Marlon Caianelo Dias Campos
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Guimarães
Atividade Antimicrobiana
Residual
27 de outubro de 2016
Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo
Pós Graduação em Saneamento e Ambiente
1

2.
INTRODUÇÃO
2
Antimicrobianos
Humano
Veterinário
Degradar: POA?
Adsorção no
lodo: biossólidos.
Biodegradabilidade
ETE < 10%
Ocorrência
ng - µg L-1
Não totalmente
metabolizado
Água
Não são
removidos por
ETA < 50%
Excretado
in natura
Solo
Cloração : não
degrada
Produtos de
degradação?
Métodos para monitorar?

3.
3
Bactéria
Grau de resistência
bacteriana
Antimicrobianos
baixa alta
Preocupações ambientais
Desenvolvimento
de resistência
bacteriana
Afeta a
microbiota
* Atualmente
700,000
mortes / ano
Desequilíbrio
ecossistema
Resistência
cruzada
Desenvolvimento
de novos
medicamentos?
Efeitos ecotóxicos
desconhecidos

4.
Bactéria Gram negativa
4
Gram negativa:
Escherichia coli
Principal representante de
bactérias de águas superficiais
Gram positiva
Bacillus subtilis
Principal representante de
bactérias presentes no solo
e Gram positiva

5.
Bactéria Gram negativa
5

6.
Bactéria Gram positiva
6

7.
Avaliação da Atividade Antimicrobiana
de soluções aquosas
7
 Expor uma concentração de UFC conhecida de uma
bactéria (Gram positiva ou Gram negativa) a uma
amostra para avaliar sua atividade antimicrobiana.
 Avaliar o crescimento bacteriano
 Tempo determinado;

8.
• Realizar os ensaios em um capela de fluxo laminar:
Ensaio de Atividade Antimicrobiana
Cuidados
6
• Esterilizar o material a ser utilizado em autoclave:
Ponteiras, solução tampão, meios de cultura,
todos os materiais utilizados devem ser estéril.
• Autoclavar: 20 min a 120 °C

9.
Método
9
 Preparar:
 Meios de cultura (sólido e líquido);
 Tampão fosfato;
 Solução Mc Farland (= 1x108 UFC para E. coli e B. subtilis);
 Cultivar micro-organismos no meio sólido e líquido
para avaliar possíveis contaminações e resultados
falsos;

10.
Meios de cultura
•Líquido •Sólido
•Utilizado no cultivo das bactérias •Utilizado para verificar possível
contaminação das cepas cultivadas
Placa de Petri
Frascos T com 10 mL de meio líquido 7
Camadas finas e sem
bolhas
Água mili-Q
Mueller-Hinton Agar
(MHA)
Água mili-Q
Mueller Hinton broth
(MHB)

11.
11
Tampão fosfato •Padrão Mc Farland
•Solução de Fosfato de potássio
monobásico anidro (1 mmol L-1)
•Absorbância (620 nm) da solução
deve estar entre 0,08 e 0,1.
•Quando o valor da absorbância da
solução Mc Farland for igual ao da
cultura de bactéria, significa que a
solução apresenta 1 X 108 UFC mL-1.
Soluções utilizadas
Solução H2SO4 (145,5 ml)
+ cloreto de bário (0,5ml)
Cloreto de bário
dihidratado
(56,3 mmol L-1 )
H2SO4 (1% v/v)
•Ajustes do pH
•H3PO4 3M (pH 4)
•KOH (pH 8)
•Utilizado para diluir as amostras
•Evitar variações de pH que
prejudiquem o crescimento das
bactérias

12.
Cultivo das bactérias
12
Descongelamento Congelamento
Inoculação Replique
24
hrs
Durante 5 dias
Tubo
criogênico
• 750µL de bactéria
cultivada
• 450 µL caldo MHB
• 300 µL glicerol
Inocular no MHA
Inocular uma ponta de
alça em 10 ml de MHB
(37°C) durante 24 Hrs

13.
Diluição Serial
13
Incubar por 8 h a 37 °C.
A)
B)
D)
C)

14.
Análise dos dados
• As medidas de absorbância são convertidas em inibição do
crescimento (em %), I, de acordo com a equação:
100


controle
controle
A
A
A
=
I
onde:
• Acontrole é a absorbância correspondente ao crescimento da cultura
não-inibida, obtida pela média das absorbâncias registradas no
Controle 1 de cada microplaca (poço n°24)
• A é absorbância a 620 nm registrada nos poços contendo as
amostras.
• Para determinar as curvas de dose-resposta e os valores de EC50 foi
usado o software Prism 6.0 (GraphPad).
14

15.
-3 -2 -1 0
0
5 0
1 0 0
L o g d ilu itio n
I
(G
r
o
w
th
In
h
ib
itio
n
)
t = 0 m in
C o n tr o l
-3 -2 -1 0
0
5 0
1 0 0
L o g d ilu itio n
I
(G
ro
w
n
th
In
h
ib
itio
n
,
%
)
t = 0 m in
C o n tr o l
Exemplo: AAM da Gatifloxacina
15
Bactéria Gram negativa (Escherichia coli) Bactéria Gram positiva (Bacillus subtilis)
EC50 : 3,6 μg L-1 EC50 : 1,1 μg L-1
250 µg L-1
33 ng L-1
/
(Inibição
do
crescimento,
%)
/
(Inibição
do
crescimento,
%)
Logdiluição Logdiluição
-2 -2
Controle
Controle
t = 0 min
Controle = Solução de Gatifloxacina 500 µg L-1)

16.
Bactéria Gram negativa (Escherichia coli)
Exemplo: Avaliação da AAM de uma solução de
GAT submitida a Fotólise e peroxidação
/(Inibição
do
crescimento,
%)
Logdiluição
0 4 8 12 16 20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
UVC
UVA
H2
O2
(2.4 mmol L
-1
)
C/C
0
t (min)
16

17.
Bactéria Gram positiva (Bacillus subtilis)
Exemplo: Avaliação da AAM de uma solução de
GAT submitida a Fotólise e peroxidação
0 4 8 12 16 20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
UVC
UVA
H2
O2
(2.4 mmol L
-1
)
C/C
0
t (min)
17
Logdiluição
/(Inibição
do
crescimento,
%)

18.
18
AAM: UV/H2O2
Bacteria Gram Negativa
(Escherichia coli)
<10%
97 %
UV/H2O2 1,6 mmol L-1
UV/H2O2 2,0 mmol L-1
UV/H2O2 2,4 mmol L-1
UV/H2O2 0,4 mmol L-1
UV/H2O2 0,8 mmol L-1
H2O2 2,4 mmol L-1
UVC254 nm
(Inibição
do
crescimento,
%)
Logdiluição

19.
19
AAM: UV/H2O2
Bacteria Gram Positiva
(Bacillus subtilis)
<10%
97 %
UV/H2O2 1,6 mmol L-1
UV/H2O2 2,0 mmol L-1
UV/H2O2 2,4 mmol L-1
UV/H2O2 0,4 mmol L-1
UV/H2O2 0,8 mmol L-1
H2O2 2,4 mmol L-1
UVC254 nm
(Inibição
do
crescimento,
%)
Logdiluição

20.
AAM: UV/H2O2 (2,4 mmol L-1)
Bacillus subtilis
T= 0 min
T= 2,5 min
T= 4,5 min
T= 6,5 min
T= 10 min
T= 20 min
15 diluições
15 diluições
11 diluições
8 diluições
6 diluições
4 diluições

21.
21
Marlon Caianelo Dias Campos:
marloncaianelo@gmail.com
AGRADECIMENTOS